免疫組織化學(xué)染色技術(shù)常見問題的研究與探討

何新明 羅穎潔 楊 通 莫明聰 林云恩 劉桂紅 (廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，廣州510120)

自從1941年coons首先用熒光素標(biāo)記抗體，檢測肺組織內(nèi)的肺炎雙球菌獲取成功之后，后繼研究者創(chuàng)建了免疫組織化學(xué)技術(shù)。經(jīng)過幾十年的不斷發(fā)展，從最初的直接免疫熒光標(biāo)記方法，逐漸發(fā)展為免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)、免疫酶組織化學(xué)技術(shù)、親和免疫組織化學(xué)技術(shù)和免疫金銀組織化學(xué)技術(shù)等。該方法具有特異性強(qiáng)，敏感性高，定位準(zhǔn)確，形態(tài)與功能相結(jié)合等優(yōu)點，已越來越多用于臨床的病理診斷、腫瘤性質(zhì)的判斷、預(yù)后的評估及基礎(chǔ)科學(xué)的研究。

免疫組織化學(xué)(Immuohistochemistry)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)。它是組織化學(xué)的分支，是用標(biāo)記的特異性抗體(抗原)對組織內(nèi)抗原(或抗體)的分布進(jìn)行組織和細(xì)胞原位檢測技術(shù)。由于免疫組織化學(xué)技術(shù)是一多步驟、多環(huán)節(jié)、多因素影響的實驗技術(shù)，有很多干擾因素影響最終的檢測結(jié)果，從而導(dǎo)致誤判和誤診[1-4]。本文就影響免疫組化染色的主要因素以及產(chǎn)生假陰性或假陽性結(jié)果的相關(guān)因素及對策進(jìn)行分析和總結(jié)。

1 免疫組化染色的影響因素

1.1 組織固定 抗原的保存和定位對于免疫組織化學(xué)檢測方法的精確性是至關(guān)重要的。及時和充分的固定是一切優(yōu)良組織學(xué)切片的基礎(chǔ)。如果組織固定不良，則在其后的任何操作階段遇到問題均難以補(bǔ)救。

免疫組織化學(xué)技術(shù)要求盡量保持組織、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)接近于其生活狀態(tài)時的形態(tài)結(jié)構(gòu)和位置。固定的目的不僅是使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，終止或減少外源性和內(nèi)源性細(xì)胞內(nèi)分解酶的反應(yīng)，防止組織細(xì)胞自溶，更重要的是最大限度地保存組織、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的抗原性，使抗原不失活、不彌散。故免疫組化染色結(jié)果的穩(wěn)定與否，首先取決于組織固定效果[5]。

在進(jìn)行免疫組織化學(xué)反應(yīng)前的組織固定時應(yīng)注意:

1.1.1 固定的組織必須新鮮 組織取材后應(yīng)該立即固定，應(yīng)盡快進(jìn)入固定液固定或入液氮冷凍保存。特別是在夏季，如果保標(biāo)本不及時固定，組織容易收縮變形，并發(fā)生自溶現(xiàn)象。

1.1.2 針對不同抗原及染色方法選擇最佳固定液較好的固定液應(yīng)該具有強(qiáng)滲透力，能迅速滲透入組織內(nèi)部;其次不會使組織發(fā)生過度收縮變形，并能使組織內(nèi)易觀察的成分得以凝固為不溶性物質(zhì);還要使組織達(dá)到一定硬度，有較好的折光率。

1.1.3 組織塊體積 組織塊的體積宜小而薄，一般用于免疫組化的組織大小宜為1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm。組織太大，內(nèi)部得不到充分固定，導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)破壞，給切片帶來一定的困難，還增加非特異性染色，同時浪費(fèi)試劑。

1.1.4 固定液的量 固定組織時，必須有足夠的固定液。一般為組織塊體積的10～15倍。固定用的容器必須足夠大，組織材料不要太多，避免組織中的水分滲出影響固定液的濃度。

1.1.5 固定時間 固定的時間要視組織塊的大小及固定液的種類、濃度、溫度而定。組織塊越大，固定時間越長;反之，組織塊越小，固定的時間越短。固定液的穿透力與濃度呈正比。10%中性甲醛、4%多聚甲醛最合適，乙醇最常用濃度為95%。在37℃或者室溫固定，適合于許多蛋白質(zhì)、抗原，并能保持其與抗體的反應(yīng)能力。70%的乙醇固定能力最強(qiáng)。固定的時間與溫度呈反比。一般固定液效果隨著溫度升高而加強(qiáng)，溫度一般在-70℃ ～37℃之間，以室溫22℃為常用。某些酶的固定要求在37℃以下進(jìn)行，如用丙酮在-20℃ ～-40℃之間固定30分鐘最佳。對于臨床活檢標(biāo)本，固定時間要求短?？傊?，固定的時間應(yīng)該根據(jù)條件而定。

1.1.6 固定后要充分沖洗，以減少染色時的人工假象[1]組織固定后，因固定液滲透到組織中，所以必須徹底沖洗，除去殘留的固定液，否則會影響下一步的脫水。特別對于長時間固定的標(biāo)本應(yīng)用流水沖洗，盡可能減少色素沉著。對于混合固定液固定的組織、更要及時沖洗，否則將影響免疫組織化學(xué)切片的質(zhì)量，產(chǎn)生人工假象。

1.2 抗原修復(fù) 在固定的過程中，醛類固定劑與蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性從而達(dá)到固定目的，但同時又使蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)，引起蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變，從而封閉了部分抗原決定簇，降低抗原與抗體的結(jié)合位點，從而影響到免疫組化結(jié)果[6，7]。因此，免疫組化的可靠性與組織切片中蛋白抗原的性質(zhì)密切相關(guān)。

抗原修復(fù)技術(shù)可修復(fù)因固定而發(fā)生封閉的抗原，使被封閉的抗原重新暴露，以達(dá)到提高免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的陽性表達(dá)率，極大地推動了免疫組織化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，提高了免疫組織化學(xué)的可靠性。常用的抗原修復(fù)技術(shù)方法有酶消化修復(fù)法、熱修復(fù)法。

1.2.1 酶消化修復(fù)法 酶消化修復(fù)法是以化學(xué)的方式使醛基斷裂，暴露抗原決定簇的抗原修復(fù)法，也是最早應(yīng)用的抗原修復(fù)方法，主要應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)、組織間抗原的修復(fù)。在操作的過程中應(yīng)選擇最佳的消化酶濃度、染色時間，避免因濃度過高、時間過長處理后影響組織抗原的修復(fù)，并造成背景染色，最終影響結(jié)果。

1.2.2 熱修復(fù)法 熱修復(fù)法是在高溫條件下，通過抗原修復(fù)液中離子與蛋白質(zhì)相互作用充分暴露抗原決定簇，是一種較為簡單、經(jīng)濟(jì)的方法。按其操作方法可進(jìn)一步分為高壓加熱、微波加熱及單純加熱。目前使用最為廣泛的是高壓加熱法，此法不僅可以修復(fù)變性的抗原，還可以使組織通透性提高，從而獲得良好的染色效果。影響抗原修復(fù)的因素有很多，所以在抗原修復(fù)的時候必須注意的問題有以下幾點:

1.2.2.1 pH值的應(yīng)用范圍及選擇 應(yīng)用于抗原修復(fù)的物質(zhì)很多，但至今為止，大家公認(rèn)的最好的抗原修復(fù)液還是檸檬酸鹽緩沖液pH6.0，據(jù)多年來的實踐認(rèn)為，該液確實很好，它適合于大多數(shù)的抗原，在常規(guī)應(yīng)用的臨床標(biāo)記抗體中基本都適用，經(jīng)用該液修復(fù)后的抗原表達(dá)增強(qiáng)，抗原的定性和定位很理想，結(jié)果不錯。但近來也有文獻(xiàn)報道，應(yīng)用抗原修復(fù)液pH8.0的效果也不錯。

1.2.2.2 抗原修復(fù)時應(yīng)選擇最佳溫度 據(jù)Masson等研究表明:70℃ ～90℃的溫度對沒有經(jīng)固定的蛋白可發(fā)生變性，但經(jīng)福爾馬林固定的蛋白，要使其發(fā)生變性，溫度必須在92℃以上。據(jù)實驗認(rèn)為溫度在92℃ ～98℃之間，尤其在95℃最為合適，這是因為:①這種溫度未達(dá)到沸騰，切片不容易脫離載片;②能夠解離和破壞與蛋白交聯(lián)的甲醛醛鍵等，處理時可以隨意選擇和確定抗原修復(fù)的作用時間。

1.2.2.3 抗原修復(fù)液必須遵循自然降溫規(guī)律，否則效果不好或達(dá)不到抗原修復(fù)的目的 抗原修復(fù)持續(xù)時間過后，取出放于室溫中讓其自然冷卻，決不能為了爭取時間，強(qiáng)行用冰塊或冷水使其冷卻。這是因為當(dāng)高溫中的抗原蛋白分子鏈脫離了其它的束縛或聯(lián)結(jié)，要有一個自然環(huán)境讓其自然放松下來，隨著溫度的降低，它們會慢慢地恢復(fù)原來的形態(tài)和構(gòu)型。如果用冰塊和冷水強(qiáng)行使其降溫，松開后的蛋白分子肽鏈突遇降溫而固定下來，恢復(fù)不了原有的構(gòu)型，達(dá)不到預(yù)想的效果。

1.2.2.4 盡量使用足量的抗原修復(fù)液 抗原修復(fù)的方法都采用加熱的方法，尤其是微波輻射加熱法，該法由于產(chǎn)熱快。液體容易揮發(fā)直至干涸。因此，應(yīng)用于抗原修復(fù)的液體，一定要充足，防止切片干涸。用于抗原修復(fù)的切片，如果由于液體少而導(dǎo)致切片的干涸，則應(yīng)丟棄切片，因為熱干涸的切片中的抗原是沒辦法補(bǔ)救的，因它是一種不可逆的現(xiàn)象。據(jù)實驗認(rèn)為，用于微波輻射抗原修復(fù)的液體，量大可多至1 000 ml。應(yīng)用大量的抗原修復(fù)液時，由于它的量較大，可延緩了液體的沸騰時間，增加了切片受微波輻射的量，對抗原修復(fù)將達(dá)到徹底。

1.3 抗體 免疫組化染色要想得到令人滿意的結(jié)果，抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合的質(zhì)和量至關(guān)重要。在這一結(jié)合過程中，諸多因素發(fā)揮著作用，如抗體的質(zhì)量、最適濃度、孵育時間、溫度等等[8，9]。

目前國際上生產(chǎn)抗體的大公司一般都能保證產(chǎn)品質(zhì)量，但需注意運(yùn)輸、分裝、儲存都可能會影響到產(chǎn)品質(zhì)量。一抗的濃度是免疫組織化學(xué)染色的關(guān)鍵，如過度稀釋會使抗原抗體結(jié)合的質(zhì)量下降，而濃度過大又可抑制抗原抗體的結(jié)合。故在使用抗體時，市售抗體所附說明書標(biāo)有的工作濃度僅作參考，須作“棋盤式效價”檢測以達(dá)到合適的稀釋度。通常以1∶30的比例開始稀釋，盡量找出最適稀釋濃度。稀釋的抗體不能長時間保存，4℃冰箱可存放1～3天，否則效價會明顯降低。近年國內(nèi)外一些公司開發(fā)出即用型抗體，由于采取了特殊的穩(wěn)定性處理，一般4℃保存效價穩(wěn)定在1年以上，且可反復(fù)使用?？贵w的孵育一般于37℃反應(yīng)30～60分鐘(恒溫)或4℃冰箱過夜;對大部分抗體而言，37℃的反應(yīng)條件其生物活性最強(qiáng)，有利于增強(qiáng)抗原抗體反應(yīng);但需注意必須在濕盒中進(jìn)行，防止切片干燥而出現(xiàn)大片非特異染色。

1.4 顯色反應(yīng) 免疫組化顯色是一種酶促反應(yīng)，它通過連接在抗原-抗體復(fù)合物上的過氧化物酶與底物DAB發(fā)生反應(yīng)，生成有顏色的復(fù)合物沉淀在組織細(xì)胞中的抗原部位。

當(dāng)抗原與抗體充分結(jié)合并經(jīng)檢測系統(tǒng)連結(jié)、放大之后，尚須經(jīng)過酶促反應(yīng)，即顯色反應(yīng)。連結(jié)在抗原抗體復(fù)合物上的辣根過氧化物酶在過氧化氫的催化作用下與底物DAB發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，最后生成不溶性、棕黃色的DAB復(fù)合物而沉淀在組織細(xì)胞原位。在光鏡下可清晰地呈現(xiàn)出來。成功的染色應(yīng)為組織背景清晰，定位明顯，核、漿、膜著色與臨床病理基本相符，DAB顯色的濃度與時間對顯色尤為重要，濃度過高、時間過長均會造成特異性染色深或假陽性。DAB顯色劑必需要現(xiàn)配現(xiàn)用，配好后最好在30分鐘以內(nèi)使用，否則時間長了就會產(chǎn)生DAB顆粒;如組化片太多，建議可以分多次配用，否則DAB顆粒會沉積在切片上，影響結(jié)果的觀察。H2O2濃度也不宜太高，否則會加速反應(yīng)，也可能增加背景染色。蘇木素復(fù)染時應(yīng)徹底洗滌，充分藍(lán)化，這樣與DAB染色對照效果較好。DAB的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控，達(dá)到理想的染色程度時立即終止反應(yīng)，避免顯色過深，產(chǎn)生背景。

2 產(chǎn)生假陰性及假陽性的相關(guān)因素及對策

2.1 假陰性結(jié)果的原因

2.1.1 抗體已經(jīng)失活或者本身達(dá)不到應(yīng)有的敏感度。目前國內(nèi)外的抗體，有時候都會有抗體不能顯示抗原的現(xiàn)象。

2.1.2 因保存不妥當(dāng)，反復(fù)凍融，造成活性下降直至抗體效價下降。

2.1.3 抗原丟失或減弱，主要是在制片過程中某一階段處理不當(dāng)而造成抗原的破壞，如固定時間過長，組織不夠新鮮、脫蠟不干凈或脫蠟后的切片擱置時間過長則可能呈假陰性。

2.2 假陽性結(jié)果的原因

2.2.1 抗體與多種抗原有交叉反應(yīng)。

2.2.2 抗體與組織中某些成分的非特異性結(jié)合。如組織中正在壞死的細(xì)胞、膠原及嗜伊紅細(xì)胞等能非特異性吸附一抗，經(jīng)過二抗放大后出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。

2.2.3 內(nèi)源性酶封閉不夠充分，在顯色時候出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

2.2.4 腫瘤或者病變中有其他的組織殘留，尤其是腫瘤中殘余極少的正常組織，而正常組織此時又有一定程度的增生或者萎縮，易將其誤認(rèn)為是腫瘤組織。

2.2.5 異位抗原的表達(dá)。

2.2.6 陽性表達(dá)不在特定的抗原部位出現(xiàn)主要是抗原的彌散或者腫瘤細(xì)胞吞噬而使抗原在不該出現(xiàn)的部位表達(dá)。

2.3 避免出現(xiàn)假陰性及假陽性結(jié)果對策

2.3.1 陽性對照實驗 該法是用已經(jīng)被免疫組化證實為陽性組織切片或者用某些組織必定含有的某些抗原或抗體的組織切片作為陽性對照，待檢的切片一起進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果如下所示:①陽性對照片與待檢片同時呈現(xiàn)陽性，說明待檢片中含有與對照片相同的抗原或者抗體，此為正常結(jié)果;②陽性對照片出現(xiàn)陽性，而待檢片中出現(xiàn)陰性，說明待檢片中沒有含有與對照片相同的抗原或者抗體，也未正常結(jié)果;③陽性對照片和待檢片同時出現(xiàn)陰性，此為不正常結(jié)果，需另查找原因。

2.3.2 陰性對照實驗 該法是用以確定不含有待測抗原的組織切片，聯(lián)通待檢的切片一起進(jìn)行染色，如對照片和待檢片同時出現(xiàn)陰性，說明該方法使用得當(dāng);如果對照片為陽性，則需要查找原因。

2.3.3 空白對照試驗 取出一張待檢片，不加一抗，用PBS代替一抗，結(jié)果出現(xiàn)以下三種結(jié)果:①對照片及待檢片均為陰性，對照片一抗用PBS代替，結(jié)果為陰性無可爭議性，而待檢片結(jié)果為陰性則應(yīng)查證各種方法無誤后方可確定;②對照片出現(xiàn)陰性，待檢片出現(xiàn)陽性。此為預(yù)定結(jié)果;③對照片基待檢片均呈陽性，因為對照片不可能出現(xiàn)陽性，所以此為不正常結(jié)果，應(yīng)該再查找原因。

2.4 避免對照組試驗出現(xiàn)異常結(jié)果應(yīng)注意的問題

2.4.1 避免出現(xiàn)抗體效價下降 抗體的使用時間一般是在半年左右，一次用不完的抗體可保存在4℃條件下，不能在0℃以下保存，因為反復(fù)的凍融抗體會破壞抗體的生物活性，容易導(dǎo)致抗體的效價下降。如果不能在有效期內(nèi)將抗體全部用完，則應(yīng)該將其分裝數(shù)個Eppendorf管中，大致含20～50 μl，封上蠟?zāi)ず蟠娣庞?30℃條件下。此方法效果較好，保存幾年之久的抗體，其標(biāo)記效果仍然很好。

2.4.2 正確使用二抗 目前常用的免疫組化方法主要是ABC和LSAB方法，這兩種方法中二抗有抗鼠和抗兔之分，所以必須正確地使用二抗。

2.4.3 選擇合適的抗體 目前的抗體有適合于石蠟切片的，有適合于冰凍切片的，還有一類是經(jīng)僅使用冰凍切片的。所以必須要認(rèn)真閱讀說明書，選擇合適的抗體。

2.4.4 配置pH值適當(dāng)?shù)木彌_液 一般的緩沖液pH值的使用范圍是7.2～7.6之間，過酸和過堿均會影響免疫組化的結(jié)果。

2.4.5 按照正確操作步驟 在操作過程中有許多的環(huán)節(jié)[10，11]，如固定時間是否過長，組織是否新鮮以及固定液的選擇是否正確。一般認(rèn)為組織固定的時間在小于24小時，尤其是多聚甲醛，固定時間長，固定液變酸，會影響染色效果。醛類固定液體則主要靠與蛋白質(zhì)交聯(lián)起固定作用，但這種交聯(lián)作用會造成細(xì)胞膜通透性下降，使抗原喪失抗原性，而且，醛類固定液的交聯(lián)作用具有高度pH依賴性，pH值高時交聯(lián)作用增強(qiáng)，組織表面的蛋白質(zhì)被先固定，阻礙了其它固定液性中間進(jìn)一步滲透，使中間的組織不能得到及時的固定，導(dǎo)致抗原發(fā)生彌散，所以選擇正確的固定液，如中性緩沖福爾馬林，可減少上述問題的發(fā)生。

綜上所述，我們認(rèn)為，免疫組化操作雖然簡單，影響其質(zhì)量的環(huán)節(jié)眾多，但只要我們嚴(yán)格按照規(guī)范的操作程序操作，出現(xiàn)問題及時系統(tǒng)分析和查找原因，以便找到有效的解決辦法，定能獲得理想的效果。

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