哮喘小鼠模型研究現(xiàn)狀分析①

杜 軍 郭宏偉 鄧家剛 (廣西中醫(yī)學(xué)院，南寧530001)

支氣管哮喘(Asthma)是一種由多種因素引起的以可逆性氣道阻塞、氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥為特征的變態(tài)反應(yīng)性疾病。到目前為止，人類對(duì)哮喘發(fā)病的機(jī)制尚未十分明確[1]，而直接對(duì)人體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)有很大的限制性，因此，有關(guān)哮喘發(fā)病原因、發(fā)病機(jī)制及藥物防治等方面的研究在相當(dāng)程度上還需要通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。近20年來(lái)利用動(dòng)物模型研究支氣管哮喘方興未艾，曾用于制作哮喘模型的動(dòng)物很多，包括:貓、狗、馬、猴、兔、羊、豚鼠、大鼠、小鼠。1995年以前所用動(dòng)物均為豚鼠，1995年以后才逐漸有報(bào)道應(yīng)用大鼠和小鼠進(jìn)行哮喘的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。其中，小鼠免疫遺傳背景較為清楚，免疫系統(tǒng)認(rèn)識(shí)已較全面深入，加上基因技術(shù)及生物測(cè)定技術(shù)的迅猛發(fā)展，小鼠在國(guó)內(nèi)外已成為最主要的哮喘動(dòng)物模型，并且，建模的成功與否直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的好壞[2]。為了給哮喘研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和數(shù)據(jù)參考，本文查閱了2001年1月1日～2010年12月31日國(guó)內(nèi)15種中文核心期刊公開(kāi)發(fā)表的有關(guān)小鼠哮喘的實(shí)驗(yàn)研究論文，并對(duì)其中小鼠建模方法的研究進(jìn)行系統(tǒng)的歸納和分析。

1 材料與方法

1.1 查閱的雜志種類和篇數(shù) 中華結(jié)核和呼吸雜志、中華兒科雜志、中華哮喘雜志、免疫學(xué)雜志、中華微生物和免疫學(xué)雜志、中國(guó)免疫學(xué)雜志、細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志、現(xiàn)代免疫學(xué)、國(guó)際免疫學(xué)雜志、中成藥、中國(guó)病理生理雜志、中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志、中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)、中國(guó)藥學(xué)雜志、中國(guó)中藥雜志。查閱文獻(xiàn)篇數(shù)共計(jì)133篇。

1.2 年限 2001年1月1日～2010年12月31日

1.3 查閱方法 手工查閱，關(guān)鍵詞分別是小鼠、哮喘。

1.4 數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源 中國(guó)知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)(CNKI)。

1.5 文獻(xiàn)質(zhì)量 本文查閱的文獻(xiàn)中所用樣本均由正規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供或代養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)到的樣本數(shù)共有5 175個(gè)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌瑯颖玖繌?0個(gè)至150個(gè)不等，分組后每組至少有5個(gè)樣本，所有樣本無(wú)死亡的。在用不同方法造模后，其中有4 470個(gè)樣本分別從肺組織的病理學(xué)改變、體征觀察方面，或用小鼠通氣功能檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定致敏小鼠通氣功能證實(shí)了所造模型的有效性，為可靠、有效的樣本，文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)中樣本有效率為86.38%。

2 結(jié)果

對(duì)所查文獻(xiàn)中提及到小鼠哮喘建模方法的全部?jī)?nèi)容進(jìn)行匯總、排序，并用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如下。

2.1 小鼠的選擇

2.1.1 小鼠種類的選擇 實(shí)驗(yàn)小鼠品系很多，根據(jù)不同繁殖方法而獲得的遺傳特性分為近交系、突變系、遠(yuǎn)交群和雜交群。用作哮喘模型的小鼠主要是近交系小鼠。常用的品系有C57BL/6、BALB/c、A/J、CBA、C3H、昆明鼠系等，以前兩種品系使用最多。其中，BALB/c所用比例為79.5%，C57BL/6所用比例為13.9%，昆明鼠系所用比例為6.6%。

2.1.2 小鼠性別的選擇 所用實(shí)驗(yàn)小鼠性別統(tǒng)計(jì)如下:雌性小鼠46.6%，雄性小鼠37.3%，雌雄不限16.1%。

2.1.3 小鼠周齡的選擇 根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法及目的的不同，所用小鼠的周齡也不相同，通常選用6至8周的小鼠，也有選用2～3天的幼鼠，或1至2個(gè)月的成年鼠，具體情況如下:見(jiàn)表1。

2.2 對(duì)致敏所用藥物 根據(jù)小鼠哮喘模型的不同，所用致敏藥物歸納如下:

2.2.1 變態(tài)反應(yīng)性炎癥哮喘模型 常用的抗原有雞卵白蛋白(OVA)、塵螨、花粉、蟑螂等，其中OVA由于免疫原性強(qiáng)、價(jià)格低廉、來(lái)源方便，最為常用，并且多與免疫佐劑(主要為氫氧化鋁)聯(lián)合使用。

2.2.2 氣道重塑模型 此模型是以O(shè)VA反復(fù)多次致敏，抗原激發(fā)時(shí)間要比較前一模型長(zhǎng)，主要以氣道平滑肌增生肥厚以及不可逆性氣道狹窄為主要表現(xiàn)。

2.2.3 生物因素誘導(dǎo)的哮喘模型 目前已建立一些病毒、真菌、細(xì)菌引起的哮喘模型，如呼吸道合胞病毒、霉菌金龜子綠僵菌在對(duì)前述范圍的文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)整理后，發(fā)現(xiàn)目前國(guó)內(nèi)主要是以變態(tài)反應(yīng)性炎癥模型為主要研究對(duì)象，其中 OVA所用比例占到了89.3%，塵螨(包括粉塵螨、屋塵螨)占1.6%和蟑螂(美洲大蠊、德國(guó)小蠊)占2.5%，有研究氣道重塑的會(huì)考慮第二種模型。第三種模型占到6.6%，誘導(dǎo)因素主要是呼吸道合胞病毒。

2.3 對(duì)致敏方法的統(tǒng)計(jì) 上述文獻(xiàn)所用致敏方法如下(主要是OVA致敏):腹腔注射占84.6%;皮下注射占4.3%;腹腔與皮下注射占8.5%;還有用尾根部皮下注射，以及足墊皮內(nèi)注射與多部位同時(shí)注射各占0.8%。

2.4 對(duì)致敏劑量和次數(shù)的統(tǒng)計(jì) 雖然國(guó)內(nèi)對(duì)致敏因素的選擇較為一致，主要選用OVA，但致敏劑量和致敏次數(shù)的差異卻很大，現(xiàn)將結(jié)果統(tǒng)計(jì)如下:

表1 鼠周齡的選擇與所占比例Tab.1 The choice of mice age and its proportion

表3中28次致敏為連續(xù)4周，42次為連續(xù)6周，致敏時(shí)間在2周以上者，主要為氣道重塑模型。其中選用OVA致敏2次的占一半以上，但2次的具體時(shí)間各有差異，現(xiàn)將此結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表4。

2.5 激發(fā)所用方法及天數(shù)的統(tǒng)計(jì)

2.5.1 激發(fā)方法 常用的激發(fā)方法主要有兩種，即霧化激發(fā)法和滴鼻激發(fā)法，其中使用霧化方法占79.3%，使用滴鼻法占19.0%，也有使用氣管內(nèi)注射與霧化結(jié)合，以及尾靜脈注射的，各占0.8%。

2.5.2 激發(fā)天數(shù) 對(duì)上述文獻(xiàn)資料統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在建模時(shí)所需激發(fā)天數(shù)也有很大差異，統(tǒng)計(jì)結(jié)果按使用頻率由多至少依次如表5。

2.6 致敏與激發(fā)間隔天數(shù) 見(jiàn)表6。

表2 OVA致敏劑量范圍與所占比例Tab.2 Sensitization dose of OVA and its proportion

表3 OVA致敏次數(shù)與所占比例Tab.3 The times of sensitization and its proportion

表4 OVA致敏2次的具體時(shí)間與所占比例Tab.4 The specific time of 2 times sensitization and its proportion

表5 OVA激發(fā)天數(shù)及所占比例Tab.5 The days with OVA stimulating and its proportion

表6 致敏與激發(fā)間隔天數(shù)與所占比例Tab.6 The days between sensitization and stimulation and its proportion

3 討論

3.1 對(duì)所選小鼠品系、種類、性別的分析與討論據(jù)上述統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，所用小鼠種類以SPF級(jí)6～8周齡BALB/c最為多見(jiàn)，且所用雌性小鼠比例略高于雄性小鼠。這是因?yàn)锽ALB/c小鼠易產(chǎn)生針對(duì)OVA和花粉的高滴度IgE和氣道高反應(yīng)性(AHR)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定。而在運(yùn)用塵螨作為誘發(fā)因素時(shí)會(huì)考慮使用C57BL/6小鼠[3]。在小鼠性別選擇的方面，國(guó)外有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在OVA誘發(fā)成熟雌/雄性BALB/c小鼠的遲發(fā)性氣道炎癥中，雄性BALB/c小鼠的嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的支氣管-細(xì)支氣管炎沒(méi)有雌性BALB/c小鼠嚴(yán)重，而且支氣管肺泡液中炎癥細(xì)胞數(shù)也較雌性少[4]。

3.2 對(duì)致敏方法的分析與討論 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在哮喘實(shí)驗(yàn)中，大多數(shù)采用 OVA(Sigma，GradeⅤ)作為致敏原，且用腹腔注射。使用劑量以10～100 μg為宜，但以10 μg最為常用，多數(shù)在第0天與第7天致敏2次。有學(xué)者曾對(duì)OVA所用致敏劑量進(jìn)行過(guò)比較研究，發(fā)現(xiàn)10 μg劑量組較其他劑量組能誘導(dǎo)出明顯的肺部EOS浸潤(rùn)、杯狀細(xì)胞增生、AHR及高滴度的IgE等與人類哮喘特征相似的指標(biāo)[5]。另外在OVA致敏時(shí)常以Al(OH)3凝膠作為佐劑，多數(shù)采用 Sigma公司產(chǎn)品，也有應(yīng)用國(guó)產(chǎn)分析純Al(OH)3，但是在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)國(guó)產(chǎn)分析純?nèi)芙舛容^差，致敏后小鼠腹部容易出現(xiàn)硬結(jié)，致敏吸附效果也相對(duì)較差。

3.3 對(duì)激發(fā)方法的分析與討論 變應(yīng)原進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體的途徑有多種，如霧化吸入、鼻腔滴入(in.)、腹腔注射(ip)、皮下注射(sc.)、氣管內(nèi)滴入(it)等。同一品系動(dòng)物致敏與激發(fā)的方法也可不同[6]。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，多數(shù)研究者采用霧化激發(fā)法，因?yàn)槠湓O(shè)備簡(jiǎn)單，且易于操作，但有研究發(fā)現(xiàn)滴鼻激發(fā)法建立的哮喘模型氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性比霧化法更為顯著[7]。但是滴鼻激發(fā)容易導(dǎo)致小鼠窒息死亡，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)可比性，這可能是抑制其使用的原因之一。另外，哮喘開(kāi)始激發(fā)的時(shí)間多數(shù)為末次致敏后間隔一周開(kāi)始激發(fā)，連續(xù)數(shù)日，但也不盡相同。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，建模時(shí)所需激發(fā)天數(shù)差異較大，從1～56天不等，這可能與研究方向有關(guān)，對(duì)于炎癥性模型其致敏時(shí)間較短一般在3～14天，而對(duì)于氣道重塑模型致敏時(shí)間較長(zhǎng)一般都在2周以上。

1 鞏 靜，劉北星.哮喘小鼠模型中小鼠外周血IL-1 8水平與肺中嗜酸性粒細(xì)胞測(cè)定[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2008;18(6):740-742.

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5 Sakai K，Yokoyama A，Kohno N et al.Effect of different sensitizing dose of antigen in a murine model of atopic asthma[J].Clin Exp Immunol，1999;118(1):9-15.

6 于琨瑛，楊 慧，劉玉琳 et al.屋塵螨變應(yīng)原重組體免疫治療的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)免疫學(xué)雜志，2007;23(7):656-659，663.

7 沈 璐，賴克方，姜 華 et al.不同激發(fā)方式對(duì)小鼠過(guò)敏性支氣管哮喘模型的影響[J].中華哮喘雜志，2009;3(6):404-408.