H.E染色和普魯氏染色在動物鐵過負荷診斷的比較

江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學院 張 靜

動物鐵中毒主要表現(xiàn)為嘔吐、腹痛、腹瀉、急性腸壞死等。其原因在于動物的腸屏蔽功能不能有效防止鐵的過量吸收。研究表明，豬仔體內(nèi)含鐵量超過400 mg/頭時會導致死亡；綿羊若含鐵量2.5 g就會引發(fā)急性鐵中毒，0.5 g/kg則會導致瘤胃弛緩、腹瀉以及腎機能障礙，慢性中毒的綿羊3周內(nèi)就會死亡。當前隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，飼料中添加鐵制劑成為一種常態(tài)，動物鐵中毒或者鐵過負荷的現(xiàn)象時有發(fā)生。診斷和解決動物鐵中毒和鐵過負荷成為當前養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的需要，然而針對鐵過負荷和鐵中毒的研究卻非常稀少，本試驗研究比較了鐵過負荷豬的臟器H.E染色和普魯氏染色變化。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗材料 10頭臨床診斷判定為鐵過負荷病豬。

試驗材料：Leica冰凍切片機、PM-10AD顯微鏡、數(shù)碼相機。實施H.E染色以及普魯氏染色法所需要的各種器皿以及藥品。

1.2 試驗方法 采用病理解剖學觀察法：（1）解剖并取該淋巴結(jié)，將其被膜上的脂肪組織剝除，接著將脂肪組織切片，在生理鹽水中洗滌后取圖像。（2）將其放入由50 mL濃度為5%的亞鐵氰化鉀和50 mL相同濃度的鹽酸配置成的普魯氏蘭染色液中進行15 min染色，當淋巴結(jié)出現(xiàn)藍色反應時將其取出并沖洗，吸水紙吸干水分后觀察和采集圖像。（3）分別采用淋巴結(jié)、肝臟、脾臟、肺臟以及腎臟的組織塊，用生理鹽水洗滌，然后借助Leica冰凍切片機專有的組織粘附劑將上述各個組織塊粘在凍頭上，并在-25℃進行切片，每一切片的厚度為5 μm。切片成功后將其放在干凈的載玻片上并即刻用100 mL/L的福爾馬林固定30 s左右，然后再用濃度為950 mL/L的乙醇再固定30 s。每種臟器都要做兩組切片，其中一組切片用H.E染色，另一組用普魯氏染色。最后用酒精脫水后并采用中性的樹膠封固切片，之后移至顯微鏡下進行觀察并采集圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理解剖學變化 鐵過負荷機體內(nèi)的淋巴結(jié)的顏色隨著鐵過負荷程度的不同而呈現(xiàn)出從棕黃色到棕褐色的不同色澤。鐵過負荷程度越高，其在普魯氏染色之后呈現(xiàn)的藍色越深，反之鐵過負荷程度越低，其呈現(xiàn)出的藍色越淺。

2.2 組織病理學變化

2.2.1 淋巴結(jié) 通過對H.E染色標本觀察可知，病變之后的淋巴結(jié)被膜、小梁、實質(zhì)、淋巴小結(jié)、髓索以及髓竇內(nèi)巨噬細胞的數(shù)量劇增。在淋巴結(jié)的副皮質(zhì)區(qū)內(nèi)可以明顯觀察到網(wǎng)狀細胞和淋巴細胞的數(shù)量減少，巨噬細胞數(shù)量增加，增加幅度甚至高達原來的幾十倍。巨噬細胞的細胞質(zhì)內(nèi)含有鐵血黃素顆粒，這些顆粒的數(shù)量不等，顏色呈棕黃色。但是由于巨噬細胞吞噬了大量的鐵黃素顆粒，因此體積增大導致正常形態(tài)受損難以被識別。而在普魯氏蘭染色標本中，可以觀察到巨噬細胞呈現(xiàn)出由淡藍色到深藍色的不同顏色，而且其數(shù)量也比H.E染色多，所在位置也以周圍的淋巴組織和淋巴竇為主，被膜、小梁和淋巴結(jié)內(nèi)的數(shù)量則相對少一些。巨噬細胞大量集結(jié)在一起無法識別其清晰的輪廓，但是單獨存在的巨噬細胞還是比較清晰的并能夠識別。

2.2.2 脾臟 H.E標本中的巨噬細胞數(shù)量明顯增多，體積變大，含有大量的鐵黃素顆粒。分布區(qū)域主要是邊緣區(qū)和脾索內(nèi)，其次是脾血竇和動脈周圍的淋巴組織鞘。普魯氏蘭染色標本巨噬細胞的分布位置與H.E標本大致相同，但前者巨噬細胞的數(shù)量更多而且更加清晰。巨噬細胞的體積隨著鐵黃素顆粒數(shù)量的增多而增大，顏色也隨之變深。

2.2.3 肝臟 肝臟組織的H.E標本中枯否氏細胞數(shù)量大量增加，而且在其細胞質(zhì)內(nèi)可見鐵黃素顆粒肝細胞出現(xiàn)空泡變性癥狀。普魯氏蘭染色標本中的枯否氏細胞數(shù)量較前者更多，而且由于細胞都被染成藍色因此更易觀察和辨識。在肝臟的葉下靜脈中可以清晰地看到內(nèi)含鐵黃素顆粒的單核細胞，而這些單核細胞也可能是被肝臟轉(zhuǎn)移的細胞。同時可以觀察到肝細胞內(nèi)也有大量被染成藍色的鐵黃素顆粒。

2.2.4 肺臟 肺組織H.E標本中，可以在肺泡膈中看到肺巨噬細胞和肺泡巨噬細胞的數(shù)量明顯增多，而且這些巨噬細胞的細胞質(zhì)內(nèi)都含有鐵黃素顆粒。但是由于較小的結(jié)構(gòu)反差，因此在試驗中不易識別。而在普魯氏藍染色標本中巨噬細胞被染成藍色識別相較于前者較為容易。需要指出的是肺泡腔內(nèi)的塵細胞往往以聚集的團狀物存在。

2.2.5 腎臟 H.E染色標本中未發(fā)現(xiàn)吞噬有鐵黃素顆粒的巨噬細胞，在普魯氏蘭染色標本中則可以發(fā)現(xiàn)血管球毛細血管之間的球內(nèi)系膜細胞質(zhì)內(nèi)含有鐵黃素顆粒。含有鐵黃素顆粒的巨噬細胞則主要存在于腎臟的間質(zhì)內(nèi)，不過數(shù)量稀少。

3 小結(jié)

3.1 鐵過負荷的病理解剖學診斷 診斷鐵中毒主要借助動物的病史和詳細的檢查：包括動物服用的鐵制劑的種類、數(shù)量以及時間都、血清鐵峰值水平、外周圍血白細胞數(shù)以及血糖水平。正鐵和蛋白質(zhì)組成的含鐵血黃素在病理狀態(tài)下是一種呈黃褐色的顆粒，在組織細胞內(nèi)則以黃褐色顆粒或者小塊的形式存在，當實施普魯氏蘭試驗時，會發(fā)生藍色陽性反應。大量的臨床試驗證明，只有鐵過負荷的動物淋巴結(jié)細胞才會含有鐵血黃素。本試驗用普魯氏染色液對淋巴結(jié)組織塊進行染色的方法，只需要15 min就能確切診斷該動物是否鐵過負荷。

3.2 鐵過負荷的組織病理學診斷 在H.E標本中鐵黃素保持其原有的黃色至褐色的顏色變化范圍，沒有著色。盡管也可以在標本中清晰顯示病理變化，但是H.E染色難以與其他黃色色素進行區(qū)別，當巨噬細胞中的鐵黃素顆粒較少時，鐵黃素的色澤往往會被蘇木素或者伊紅色素掩蓋，不能清晰的顯示出來。而采用普魯氏蘭染色液染色之后則可以避免該種現(xiàn)象出現(xiàn)，能夠通過對其染上藍色清晰顯示出淋巴結(jié)、肺臟、肝臟以及腎臟等組織細胞中含有的鐵血黃素。

總之普魯氏蘭染色和H.E染色能借助相應細胞變色的原理解釋和反映動物鐵過負荷的現(xiàn)狀。但僅用于定性，不能對動物鐵負荷進行定量檢測。