張 琳

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070;2.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司,甘肅蘭州 730046)

口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的急性、熱性、高度接觸性的傳染病,有7個(gè)血清型,不同血清之間無(wú)免疫交叉保護(hù)性?？谔阋叩陌l(fā)生已有100多年的歷史,至今尚未消滅。疫苗接種是特異性預(yù)防FMD的可靠和有效手段,安全有效的疫苗是成功的預(yù)防、控制以致最終消滅FMD的先決條件。疫苗作為預(yù)防口蹄疫的可靠手段目前正在廣泛使用。近年來(lái),隨著生物工程技術(shù)的迅速發(fā)展,對(duì)亞單位疫苗、載體疫苗、基因缺失疫苗合成肽疫苗、核酸疫苗、植物反應(yīng)器可飼疫苗及多表位疫苗等新型口蹄疫疫苗的研究已成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

1 傳統(tǒng)疫苗

1.1 活疫苗或弱毒疫苗 活疫苗是指經(jīng)充分致弱,尚能在動(dòng)物體內(nèi)增殖,接種后能夠引起動(dòng)物發(fā)生無(wú)癥狀的感染,從而使機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的生物制劑,又稱為弱毒疫苗,常通過(guò)雛雞化、鼠化、兔化、雞胚化、細(xì)胞培養(yǎng)強(qiáng)化或人工誘變,使FMD田間流行的強(qiáng)毒或經(jīng)人工接種繁殖的培養(yǎng)物致弱,經(jīng)大量擴(kuò)增病毒后,收集感染組織或細(xì)胞培養(yǎng)物,加入一定的保護(hù)劑、佐劑而制成的病毒制劑。1937年Negel將病毒接種于成年鼠腦內(nèi),證明病毒毒力可以被致弱。1948年Fraub和Schneider將豚鼠毒轉(zhuǎn)接于雞胚,獲減毒毒株。Gillespic(1954)和Komorov(1957)將牛源毒適應(yīng)于雞胚和1日齡雛雞,曾發(fā)表致弱毒株的初步應(yīng)用報(bào)告。Gunha和Eichhom(1959)也在兔體傳代成功[1]。其具有價(jià)廉、成本低及抗原譜對(duì)號(hào)、抗體持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn),但其引起免疫動(dòng)物病毒血癥、長(zhǎng)期帶毒、排毒及病毒返強(qiáng)等缺點(diǎn)卻一直無(wú)法克服。20世紀(jì)50、60年代許多學(xué)者用不同的毒株進(jìn)行了各種途徑的致弱,但迄今為止還無(wú)一個(gè)可以滿足所有標(biāo)準(zhǔn)的口蹄疫弱毒疫苗株。1964年歐洲口蹄疫防治委員會(huì)決定歐洲國(guó)家不用弱毒疫苗免疫,停止了弱毒疫苗的研究[2]。目前世界上大多數(shù)國(guó)家已經(jīng)禁止使用此種疫苗,取而代之的是采用滅活疫苗。

我國(guó)在20世紀(jì)50年代育成O型弱毒株及A型弱毒株,并制成乳兔組織弱毒疫苗;60年代用A型兔化弱毒制造反應(yīng)苗[3];70年代選育出OPK弱毒株試制疫苗,并進(jìn)行A型、O型雙價(jià)苗組織培養(yǎng)弱毒試驗(yàn)研究;80年代培育出溫度敏感毒株,并培育了O型OP4細(xì)胞培養(yǎng)弱毒疫苗,這些疫苗在防止境外口蹄疫傳入我國(guó)的防制工作中發(fā)揮了很大作用[4]。

1.2 滅活疫苗 滅活疫苗是指用物理或化學(xué)方法使口蹄疫病毒喪失感染力而保留抗原性,再添加佐劑后制成的疫苗制劑。最早的滅活疫苗在歐洲于20世紀(jì)20年代出現(xiàn),用動(dòng)物病損組織經(jīng)氫氧化鋁吸附、甲醛滅活后制成疫苗。20世紀(jì) 40年代,Schm id t和Waldman等將口蹄疫病毒接種于健康牛舌皮內(nèi),等其發(fā)病后,采取病牛舌部的水皰皮和水泡液,經(jīng)甲醛滅活后制成鋁膠苗,獲得了較高的免疫保護(hù)力。1947年Frenkel首次用牛舌皮碎塊培養(yǎng)病毒獲得成功,生產(chǎn)了甲醛滅活疫苗,改變了當(dāng)時(shí)歐洲口蹄疫的流行態(tài)勢(shì)。1962年英國(guó)Pirbright的Mowat和 Chapman等開始用乳倉(cāng)鼠腎傳代細(xì)胞(BHK-21)培養(yǎng)口蹄疫病毒,生產(chǎn)口蹄疫滅活疫苗,并很快商業(yè)化。1966年Lapstich和Telling等應(yīng)用BHK-21細(xì)胞深層懸浮培養(yǎng)法制備口蹄疫疫苗,可大量培養(yǎng)細(xì)胞、增殖病毒和制造疫苗,20世紀(jì)80年代用大型發(fā)酵罐培養(yǎng)細(xì)胞、增殖病毒和制備疫苗獲得成功[5],這些病毒快速、大量繁殖技術(shù)的誕生,成為口蹄疫滅活疫苗的迅速發(fā)展的基礎(chǔ)。

在滅活劑方面,最早采用甲醛溶液滅活口蹄疫病毒抗原氫氧化鋁膠混合物,但由于該混合物對(duì)細(xì)胞有毒性,且據(jù)報(bào)道,在歐美暴發(fā)的一些口蹄疫與滅活疫苗中殘留活病毒密切相關(guān)[6],因此推動(dòng)了后來(lái)作用于核酸的AEI和BEI作為滅活劑的研究。目前我國(guó)在牲畜口蹄疫強(qiáng)制免疫中主要應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)病毒的BEI滅活苗,對(duì)豬使用O型口蹄疫滅活疫苗,對(duì)牛、羊、駱駝和鹿等使用O 型-亞洲Ⅰ型口蹄疫二價(jià)滅活疫苗;其中,豬O型口蹄疫滅活疫苗(II)采用豬源口蹄疫強(qiáng)毒株,經(jīng)BHK 21細(xì)胞增殖,應(yīng)用生物濃縮技術(shù)提高疫苗中有效抗原含量,BEI滅活病毒,與礦物油佐劑乳化而制成的高效疫苗。2009年初,我國(guó)湖北、上海等地突現(xiàn)牛A型口蹄疫,國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室立即啟動(dòng)A型疫苗技術(shù)儲(chǔ)備,迅速研制成功并推薦免疫A型滅活疫苗,對(duì)有效控制我國(guó)A型口蹄疫的流行做出了貢獻(xiàn)。

2 新型疫苗

20世紀(jì)70年代以來(lái),隨著分子生物學(xué)、免疫化學(xué)和生物工程學(xué)的深入發(fā)展,對(duì)口蹄疫新型疫苗諸如合成肽疫苗、亞單位疫苗、載體疫苗及基因疫苗的研究取得了較大進(jìn)展。

2.1 合成肽疫苗 合成肽疫苗是用化學(xué)合成法人工合成病原微生物的保護(hù)性多肽,并將其連接到大分子載體上,加入佐劑制成的疫苗,其特點(diǎn)是純度高,穩(wěn)定。理想的口蹄疫多肽疫苗應(yīng)同時(shí)具有B細(xì)胞和 T細(xì)胞表位。Doel等1990年曾用 A、O、C血清型(FMDV)VP1序列的141-158和200-213肽段組成了40個(gè)氨基酸的合成肽,對(duì)牛和豚鼠均產(chǎn)生了特異的高水平抗病毒抗肽抗體[7]。由于合成肽疫苗本身的優(yōu)點(diǎn),極大的推動(dòng)了這個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展[8]。目前,我國(guó)也已成功研制出了豬O型口蹄疫合成肽疫苗,并投入生產(chǎn)應(yīng)用于實(shí)踐[9-11]。疫苗使用O型毒株的VP1結(jié)構(gòu)中141～160氨基酸序列,利用化學(xué)方法人工合成這一肽段為抗原,同時(shí)為了增強(qiáng)疫苗的抗原性,在VP1上結(jié)合輔助T細(xì)胞表位的環(huán)狀構(gòu)造,克服了VP1環(huán)狀多肽只有B細(xì)胞表位的缺點(diǎn),借助內(nèi)源性和外源性的Th位點(diǎn),進(jìn)一步加強(qiáng)了T細(xì)胞免疫,而且通過(guò)雙硫鍵提高了環(huán)狀構(gòu)造的穩(wěn)定性。此疫苗經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)和臨床試驗(yàn)都顯示其高效的免疫力,同時(shí)無(wú)過(guò)敏等副反應(yīng),產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定,前景良好。

2.2 亞單位疫苗 基因工程亞單位疫苗又稱重組亞單位疫苗或生物合成亞單位疫苗,是利用DNA重組技術(shù),將編碼病原微生物保護(hù)性抗原的基因?qū)胧荏w菌(如大腸桿菌)或細(xì)胞,使其在受體中高效表達(dá),分泌保護(hù)性抗原肽鏈。提取保護(hù)性抗原肽鏈,加入佐劑即制成基因工程亞單位疫苗。FMDV衣殼VP1是主要的抗原蛋白,早期亞單位疫苗主要是利用各種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)VP1蛋白,或者VP1與免疫球蛋白重鏈穩(wěn)定區(qū)scIgG基因構(gòu)成嵌合體,制成疫苗。Kupper等1981年等克隆了FMDV VP1基因,將其插入到原核表達(dá)載體PL啟動(dòng)子的下游,實(shí)現(xiàn)VP1基因的原核表達(dá),并通過(guò)間接ELISA和放射免疫試驗(yàn)證實(shí)了其表達(dá)產(chǎn)物具有抗原性[12],從而為FMDV基因工程亞單位疫苗的研制提供了理論依據(jù)。目前,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FMDV結(jié)構(gòu)基因和非結(jié)構(gòu)基因2A、3C串聯(lián)起來(lái)表達(dá),可以產(chǎn)生76S的類病毒粒子,提純?cè)摬《玖Ｗ?用來(lái)免疫動(dòng)物,其免疫效果類似于全病毒,可產(chǎn)生高水平的中和抗體,能抵抗強(qiáng)毒的攻擊[13]。除此以外,酵母和桿狀病毒系統(tǒng)也用來(lái)表達(dá)VP1蛋白,解決VP1蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中不被修飾加工等問(wèn)題,以期提高其免疫原性。我國(guó)鄭兆鑫等利用化學(xué)法合成了口蹄疫病毒VP1基因的兩種抗原表位序列,將其串聯(lián)后與半乳糖苷酶基因連接成融合蛋白基因在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá),提取的融合蛋白制成亞單位疫苗免疫豬后能有效地防制口蹄疫病毒感染。該疫苗已在南京藥械廠完成了中試生產(chǎn)。

2.3 載體疫苗 隨著基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展,重組技術(shù)為開發(fā)重組FMD疫苗提供了技術(shù)支持。病毒和細(xì)菌都可用來(lái)生產(chǎn)口蹄疫疫苗。腺病毒的基因結(jié)構(gòu)與功能研究得比較清楚。May r等[14]利用復(fù)制缺陷型的第5型腺病毒,構(gòu)建了包含有FMDVP1-2A、3C蛋白前體編碼序列的重組病毒。發(fā)現(xiàn)含有3C序列的重組病毒能有效地加工結(jié)構(gòu)蛋白前體P-2A 成VP0、VP3、VP1,表達(dá)的蛋白具有類似病毒空衣殼的功能,能被免疫細(xì)胞識(shí)別,誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生高濃度的中和抗體。Du等[15]用腺病毒構(gòu)建了含口蹄疫VP1的3個(gè)氨基酸殘基表位(21～60、141～160、200～213)的重組腺病毒(rAd-GMCSF-VPe),并將其與豬的巨噬細(xì)胞集落刺激因子混合(rAd-GMCSF-VP1)接種豚鼠和豬,結(jié)果能檢測(cè)到特異性的體液免疫應(yīng)答,高水平的 T細(xì)胞增殖,IL-4和IFN-γ。所有 接 種 rAd-GMCSF-VPe和 rAd-GMCSF-VP1的豚鼠和豬都能抵抗FMDV的攻擊。

后來(lái),研究發(fā)現(xiàn)痘病毒基因組、偽狂犬病病毒重組體(PRV-P1)、脊髓灰質(zhì)炎病毒以及細(xì)菌(如啫酸乳酸桿菌)等均可以作為口蹄疫疫苗載體,并取得了一定的進(jìn)展。

2.4 核酸疫苗 核酸疫苗又稱基因疫苗,是將編碼病原體免疫保護(hù)性抗原蛋白基因置于真核表達(dá)元件的控制下,并將其導(dǎo)入動(dòng)物機(jī)體內(nèi),通過(guò)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白,從而誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答。最早開始核酸免疫研究的是Wo lff,1990年將質(zhì)粒接種于小鼠肌肉,取得了較好的免疫效果。Benvenisti(2001)將口蹄疫病毒完整的結(jié)構(gòu)基因P1和非結(jié)構(gòu)基因2A、3CD串聯(lián)起來(lái),同時(shí)加入腦心肌炎病毒(EMCV)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES),并通過(guò)免疫熒光和免疫斑點(diǎn)技術(shù)檢測(cè)到病毒蛋白在體外表達(dá)和加工,利用基因槍注射到豬皮膚中,部分豬獲得抵抗FMDV強(qiáng)毒的攻擊[16]。Shieh(2001)為了克服亞單位疫苗不能產(chǎn)生持久的免疫保護(hù),通過(guò)基因免疫和亞單位疫苗聯(lián)合免疫來(lái)增強(qiáng)其免疫效果,首先用含有口蹄疫病毒主要免疫原性基因VP1的質(zhì)粒免疫鼠,接下來(lái)用VP1多肽偶合物(P29-KLH)刺激,免疫的鼠產(chǎn)生高滴度的抗體,并具有中和口蹄疫病毒活性[17]。

在利用這些DNA疫苗的同時(shí),一些免疫增強(qiáng)分子佐劑也被應(yīng)用進(jìn)來(lái)。比如白介素和干擾素經(jīng)驗(yàn)證也是很好的DNA疫苗分子佐劑。除了佐劑之外,補(bǔ)體也被構(gòu)建進(jìn)來(lái)。Fan等將VP1連到豬或鼠的補(bǔ)體上,將補(bǔ)體接種豚鼠,豚鼠能抵抗活毒的攻擊。比較豬的補(bǔ)體和鼠的補(bǔ)體的免疫效果,連有VP1的鼠補(bǔ)體免疫效果更強(qiáng),這為開發(fā)DNA疫苗嵌合體提供了新的技術(shù)途徑。核酸疫苗免疫期長(zhǎng),成本較低,容易構(gòu)建和制備,穩(wěn)定性好,抗原遞呈過(guò)程與病原的自然感染相似,可通過(guò) MHCⅠ類和MHCⅡ類分子直接遞呈免疫系統(tǒng),并刺激CD8+淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)。研制成功的核酸疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。

2.5 可飼疫苗 可飼疫苗是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將抗原基因?qū)胫仓曛?獲得表達(dá)抗原蛋白的植株,將該植株飼喂給動(dòng)物后,可刺激動(dòng)物胃腸道黏膜產(chǎn)生局部免疫應(yīng)答進(jìn)而獲得全身性的免疫保護(hù)。1998年Carrillo等用表達(dá)了FMDV VP1基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥葉浸提取物腹腔注射免疫小鼠,誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生,該抗體能與VP1蛋白的第135～160位氨基酸殘基的多肽和完整的FMDV顆粒反應(yīng),所有免疫的小鼠均能抵抗 FMDV強(qiáng)毒的攻擊。2001年Carrillo等[18]在馬鈴薯中成功表達(dá)了VP1蛋白,動(dòng)物試驗(yàn)證明免疫動(dòng)物也能抵抗強(qiáng)毒的攻擊。He等[19]構(gòu)建的表達(dá)載體pBI121CTBVP1經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化土豆,VP1和霍亂毒素B(CTB)的融合蛋白能在土豆中穩(wěn)定表達(dá),且具有一定的免疫原性。我國(guó)潘麗等[20]已在蕃茄中成功表達(dá)了口蹄疫結(jié)構(gòu)蛋白P1-2A,3C和VP1,其葉片提取物接種豚鼠以后能抵抗活毒的攻擊。除此之外,研究者還在玉米、煙草、豇豆等植物中表達(dá)FMDV的抗原保護(hù)性基因,均已初見(jiàn)成效?？娠曇呙缡褂梅奖?、安全,為牛羊等草食動(dòng)物的口蹄疫防制帶來(lái)光明的前景。

3 展望

新型疫苗的研究雖然取得了很大的進(jìn)展,但目前大部分還處于實(shí)驗(yàn)室階段,要使其規(guī)?；a(chǎn),應(yīng)用于市場(chǎng),還有很長(zhǎng)的路要走。但隨著研究的深入,相信在不久的將來(lái),新型疫苗必將大量投入使用,人類可以對(duì)口蹄疫進(jìn)行有效地防控。

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