王廣銀

(1.德州學(xué)院農(nóng)學(xué)系,山東 德州 253023;2.德州市兔業(yè)工程技術(shù)研究中心,山東 德州 253023）

肉嫩度是衡量肉質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一。近年來(lái),人們?cè)噲D通過(guò)各種方法來(lái)改善肉質(zhì)的嫩度,以滿足消費(fèi)者的需求,但通過(guò)非遺傳因素來(lái)提高肉的嫩度成效不大[1],隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展,標(biāo)記輔助選擇為解決這一問(wèn)題提供了新的思路。研究表明,鈣蛋白酶是影響宰后肉質(zhì)嫩度最重要的候選基因,在肌肉纖維宰后嫩化中扮演著重要角色,控制著肌纖維蛋白的降解,是肌肉蛋白降解的限速步驟[2],因而在肉的嫩化中起著重要作用。本文簡(jiǎn)要綜述鈣蛋白酶系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、功能、活性調(diào)節(jié)及其在肉嫩化中的作用機(jī)理等研究進(jìn)展。

1 鈣蛋白酶系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能

鈣蛋白酶系統(tǒng)是高度可調(diào)的、復(fù)雜的蛋白質(zhì)水解酶系統(tǒng),主要包括依賴于Ca2+的鈣蛋白酶、鈣蛋白酶抑制蛋白和鈣蛋白酶激活蛋白,以及其活性表現(xiàn)為鈣非依賴性的骨骼肌特異性鈣蛋白酶。

1.1 鈣蛋白酶 鈣蛋白酶是細(xì)胞內(nèi)鈣依賴性中性半胱氨酸內(nèi)肽酶,主要存在于肌纖維Z盤附近和肌質(zhì)網(wǎng)膜上。根據(jù)鈣蛋白酶表現(xiàn)半最高活性所需的Ca2+濃度的不同,可以將其分為鈣蛋白酶Ⅰ(μ-calpain）和鈣蛋白酶Ⅱ(m-calpain）[3],兩者都由2個(gè)亞基組成,其中30 kD小亞基在兩種鈣蛋白酶中是相同的,由DⅤ和DⅥ兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成,兩結(jié)構(gòu)域之間由一段富含脯氨酸的序列連接,為同一基因的產(chǎn)物,而80 kD大亞基是由4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成,是不同基因的產(chǎn)物[4]。大亞基的DⅠ在μ-calpain活化前或活化過(guò)程中自體水解發(fā)生自溶,是酶原活化時(shí)被加工的區(qū)域;DⅡ是表現(xiàn)水解活性的關(guān)鍵部位;DⅢ起活性調(diào)節(jié)作用;DⅣ是鈣離子的結(jié)合部位[5]。

在宰后肉類成熟過(guò)程中,μ-calpain通過(guò)降解α-肌動(dòng)素、Z-nin蛋白,而m-calpain通過(guò)降解肌間線蛋白、聯(lián)結(jié)蛋白、半肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白 T和 I、原肌球蛋白、C-蛋白、M-蛋白來(lái)弱化肌纖維結(jié)構(gòu)來(lái)提高肉的嫩度,但在成熟的過(guò)程中主要是μ-calpain,而不是m-calpain參與了肉的嫩化[6]。

1.2 鈣蛋白酶抑制蛋白 鈣蛋白酶抑制蛋白是細(xì)胞內(nèi)專一性抑制鈣蛋白酶活性的蛋白質(zhì),它可以識(shí)別鈣蛋白酶與Ca2+結(jié)合引起的構(gòu)象變化并與之特異性結(jié)合。鈣蛋白酶抑制蛋白含有5個(gè)結(jié)構(gòu)域,N端第一個(gè)結(jié)構(gòu)域稱L結(jié)構(gòu)域,其功能目前還不太清楚,第2個(gè)到第5個(gè)結(jié)構(gòu)域是4個(gè)相似的重復(fù)單位,每個(gè)重復(fù)單位含有A、B、C 3個(gè)保守區(qū)。鈣蛋白酶抑制蛋白主要是防止鈣蛋白酶被過(guò)度激活產(chǎn)生一種潛在而劇烈的破壞物,它調(diào)控著鈣蛋白酶的活性,是通過(guò)抑制鈣蛋白酶的自溶而發(fā)揮作用[7]。

1.3 鈣蛋白酶激活蛋白 鈣蛋白酶激活蛋白是鈣蛋白酶活性的直接調(diào)節(jié)者,它可以增強(qiáng)鈣蛋白酶在生理?xiàng)l件下對(duì)Ca2+的親和性,并與鈣蛋白酶結(jié)合而起活化作用,促進(jìn)鈣蛋白酶活性的發(fā)揮[8]。目前發(fā)現(xiàn)的鈣蛋白酶激活蛋白有 UK 114和ACBP(?；o酶A結(jié)合蛋白）兩種,前者是μ-calpain的激活因子,后者是m-calpain的激活因子。UK 114分子量為30 kD的二聚體,ACBP分子量約為20 kD的二聚體,兩者氨基酸序列基本相同[9]。UK 114和ACBP的具體結(jié)構(gòu)尚未見報(bào)道。

1.4 骨骼肌特異性鈣蛋白酶(p94） p94又稱CAPNⅢ,是最典型的組織特異性鈣蛋白酶。p94在構(gòu)造上與μ-calpain和m-calpain的大亞基保持高度同源性,但又具有許多自身獨(dú)特性質(zhì),如p94不含小亞基、不形成異源二聚體、活性為鈣非依賴性等。p94的基因中存在3個(gè)獨(dú)特的插入序列,即NS、IS1及IS2,認(rèn)為與其自我消化、酶壽命及與肌聯(lián)蛋白結(jié)合等有關(guān)[5]。目前盡管還沒(méi)有試驗(yàn)證明它能水解肌原纖維中任何一種蛋白,但種種跡象表明,p94與肌纖維代謝活性及宰后嫩度密切相關(guān)[10]。

2 鈣蛋白酶活性調(diào)節(jié)

細(xì)胞中的鈣蛋白酶活性受到Ca2+、鈣蛋白酶抑制蛋白和鈣蛋白酶激活蛋白的調(diào)節(jié),Ca2+、鈣蛋白酶激活蛋白是正調(diào)節(jié)因子,鈣蛋白酶抑制蛋白呈抑制性作用,鈣蛋白酶的活性表現(xiàn)是它們共同作用的結(jié)果。

2.1 Ca2+的調(diào)節(jié)作用 當(dāng)鈣蛋白酶的大小亞基相結(jié)合時(shí),它不具有活性,在被Ca2+激活后其大小亞基分離,大亞基主要起催化作用,小亞基主要起調(diào)節(jié)作用[11]。鈣蛋白酶表現(xiàn)蛋白水解活性,其具體過(guò)程為:大小亞基的分離、小亞基的自溶、30 kD亞基迅速降解為17 kD、大亞基自溶、80 kD轉(zhuǎn)化成78 kD再變成76 kD、鈣蛋白酶構(gòu)象發(fā)生變化呈自溶狀態(tài)表現(xiàn)蛋白水解酶活性。除Ca2+濃度調(diào)控外,鈣蛋白酶的活性還受離子強(qiáng)度、pH值、底物等因素的影響[12]。

2.2 鈣蛋白酶抑制蛋白的調(diào)節(jié)機(jī)制 鈣蛋白酶抑制蛋白是一種內(nèi)源性、需Ca2+激活的鈣蛋白酶抑制劑,在大多數(shù)組織中其濃度足以抑制鈣蛋白酶的活性[13]。當(dāng)鈣蛋白酶被Ca2+激活后,如果附近有鈣蛋白酶抑制蛋白存在,將迅速與之結(jié)合而抑制鈣蛋白酶的活性,從而保證鈣蛋白酶對(duì)底物只進(jìn)行局部特定位點(diǎn)的水解,起到防止鈣蛋白酶被隨機(jī)和過(guò)度激活的作用,鈣蛋白酶抑制蛋白和鈣蛋白酶的這種結(jié)合是可逆的,Ca2+濃度不足時(shí)兩者會(huì)發(fā)生分離。鈣蛋白酶抑制蛋白抑制鈣蛋白酶的大致過(guò)程為:鈣蛋白酶抑制蛋白的第Ⅱ到第V結(jié)構(gòu)域中的A和C保守區(qū),與鈣蛋白酶的Ⅳ和Ⅵ結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合,然后B保守區(qū)與鈣蛋白酶的Ⅱ結(jié)構(gòu)域結(jié)合而發(fā)揮作用[14]。

2.3 鈣蛋白酶激活蛋白的調(diào)節(jié) 鈣蛋白酶激活蛋白是鈣蛋白酶最直接的調(diào)節(jié)者,它可明顯提高鈣蛋白酶的活性,降低其激活所需的Ca2+濃度,使鈣蛋白酶抑制蛋白的抑制作用減弱,提高鈣蛋白酶對(duì)膜的吸附性。當(dāng)鈣蛋白酶激活蛋白發(fā)揮激活作用時(shí),首先鈣蛋白酶與鈣離子直接結(jié)合,然后鈣蛋白酶激活蛋白激活二者的復(fù)合體而不與鈣離子直接結(jié)合,其激活過(guò)程為:鈣蛋白酶激活蛋白與鈣蛋白酶80 kD的催化亞基結(jié)合,并促進(jìn)其與小亞基的解離,使80 kD的亞基變?yōu)?8 kD,隨后再變?yōu)?5 kD,這樣就使鈣蛋白酶的活性大約提高100倍。鈣蛋白酶激活蛋白還與鈣蛋白酶抑制蛋白通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地爭(zhēng)奪結(jié)合位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對(duì)鈣蛋白酶的調(diào)控作用[9]。

3 鈣蛋白酶與肉的嫩化

肉的嫩化是動(dòng)物宰后的一定時(shí)間內(nèi),肌纖維碎裂,肌肉變軟,嫩度增加的成熟過(guò)程。影響肌肉嫩度的因素很多,包括肌節(jié)的長(zhǎng)度、肌內(nèi)脂肪與結(jié)締組織的含量、肌肉結(jié)構(gòu)蛋白水解敏感性、pH值等[13]。大量研究表明,鈣蛋白酶引起肌肉中蛋白質(zhì)的水解,是導(dǎo)致宰后肌肉嫩化的主要原因。鈣蛋白酶引發(fā)肌原纖維蛋白降解的可能機(jī)制是:鈣蛋白酶被激活后,首先攻擊肌原纖維的肌節(jié),或攻擊粗肌絲和細(xì)肌絲的連接處N2線,降解連接蛋白和半肌動(dòng)蛋白,使肌原纖維I帶和Z盤結(jié)合變?nèi)趸驍嗔?使肌纖維釋放出粗肌絲和細(xì)肌絲,細(xì)肌絲的肌原蛋白和原肌球蛋白及粗肌絲的C-蛋白進(jìn)一步降解,分別解離出肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白,然后被溶酶體或胞質(zhì)蛋白酶所捕獲進(jìn)一步降解,導(dǎo)致肌原纖維的有序結(jié)構(gòu)被破壞,從而有利于肉的嫩化[15]。

4 前景與展望

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于鈣蛋白酶系統(tǒng)的研究主要集中在其基因cDNA序列分析與克隆、部分內(nèi)含子的酶切及其與肉嫩度相關(guān)性的初步研究等方面,鈣蛋白酶系統(tǒng)的詳細(xì)結(jié)構(gòu)、生理功能及具體調(diào)控機(jī)理還不是很清楚。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展和研究的不斷深入,在完善鈣蛋白酶系統(tǒng)的同時(shí),一定會(huì)從中篩選出理想的肉質(zhì)嫩度分子標(biāo)記,從根本上加快遺傳進(jìn)展,以獲得足夠嫩度高且穩(wěn)定性好的肉產(chǎn)品,滿足廣大消費(fèi)者的需求。

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