劉宇婧，劉 越，黃耀江，龍春林，2，①

人類(lèi)社會(huì)發(fā)展至今，已經(jīng)通過(guò)分類(lèi)學(xué)方法鑒定和描述了170萬(wàn)種生物，然而這個(gè)數(shù)字僅僅是分類(lèi)學(xué)家預(yù)計(jì)的全球物種總數(shù)的15％，因此，對(duì)地球上眾多的物種進(jìn)行分類(lèi)和鑒定仍然是全人類(lèi)的一項(xiàng)長(zhǎng)期而艱巨的任務(wù)。由于物種的形態(tài)會(huì)受到生物性別和發(fā)育階段的影響，因此，對(duì)物種進(jìn)行分類(lèi)客觀上存在一定的困難；同時(shí)，傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)方法無(wú)法鑒定出許多群體中普遍存在的隱種(即外觀相似但遺傳特征截然不同的物種)，可能會(huì)導(dǎo)致物種劃分有誤，需要對(duì)這些物種進(jìn)行訂正；另外，物種的分類(lèi)需要長(zhǎng)期的經(jīng)驗(yàn)和知識(shí)積累，往往要很多年才能培養(yǎng)出一位擅長(zhǎng)某一類(lèi)群分類(lèi)的專(zhuān)家。鑒于以上因素并基于對(duì)時(shí)間和成本的綜合考慮，開(kāi)發(fā)一種更靈活的物種標(biāo)準(zhǔn)化鑒定系統(tǒng)已成為當(dāng)前生物分類(lèi)學(xué)研究領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急［1-3］。

DNA條形碼(DNA barcoding)技術(shù)是以染色體組為基礎(chǔ)，用1段標(biāo)準(zhǔn)DNA序列作為標(biāo)記實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確和自動(dòng)化的物種鑒定方法，類(lèi)似于超市用條形碼掃描識(shí)別成千上萬(wàn)種商品，該方法是近幾年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)全新的物種鑒定技術(shù)，為解決傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)面臨的難題提供了新方法。除物種鑒定功能外，DNA條形碼技術(shù)還有助于發(fā)現(xiàn)新種和隱種，也可應(yīng)用于其他學(xué)科(如民族植物學(xué))的研究。該技術(shù)在動(dòng)物研究中已得到廣泛的應(yīng)用，采用的標(biāo)準(zhǔn)片段是線(xiàn)粒體COI基因中1段約650 bp的DNA片段，然而，COI基因在植物中的進(jìn)化速率遠(yuǎn)慢于在動(dòng)物中的進(jìn)化速率，因此COI基因只適用于低等植物中某些藻類(lèi)的鑒定［4-5］。迄今為止，在陸生植物中還沒(méi)有找到通用性DNA條形碼［6］。盡管如此，對(duì)植物DNA條形碼的研究依然在迅速有效地進(jìn)行。構(gòu)建DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)、利用該技術(shù)鑒別已知物種和發(fā)現(xiàn)新種及隱種、重建物種和高級(jí)階元的演化關(guān)系，是目前分子生物學(xué)和分類(lèi)學(xué)發(fā)展的最新研究方向，對(duì)植物保護(hù)生物學(xué)和生物多樣性研究具有重大意義。

DNA條形碼具有諸多優(yōu)點(diǎn)：①以信息穩(wěn)定的DNA序列為檢測(cè)對(duì)象，每一物種具有各自特定的DNA序列信息，同種生物不同生長(zhǎng)時(shí)期具有相同的DNA序列信息，即使經(jīng)過(guò)加工使其形態(tài)發(fā)生變化，但其DNA序列信息不會(huì)改變，而傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒別特征會(huì)因趨同性和變異導(dǎo)致鑒定錯(cuò)誤；與傳統(tǒng)分類(lèi)方法相比，DNA條形碼技術(shù)擴(kuò)大了檢測(cè)樣本的范圍，即使樣本部分受損也不會(huì)影響鑒別結(jié)果。②能夠拋開(kāi)形態(tài)相似的假象，從基因水平上對(duì)傳統(tǒng)分類(lèi)方法難以區(qū)分的類(lèi)群進(jìn)行物種鑒定。③建立DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，不但可以一次性鑒定大量物種，而且可以提供各物種的明確信息；不僅能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)對(duì)物種形態(tài)描述的不足，而且還可以加快對(duì)已知物種的識(shí)別速度；同時(shí)還便于發(fā)現(xiàn)新物種，對(duì)分類(lèi)學(xué)科的快速深入發(fā)展有一定的推動(dòng)作用。④在DNA條形碼技術(shù)的基礎(chǔ)上研制簡(jiǎn)便和高效的條形碼掃描儀，可以加快物種鑒定和進(jìn)化研究的步伐，有益于推進(jìn)分類(lèi)學(xué)研究基礎(chǔ)薄弱的國(guó)家，尤其是發(fā)展中國(guó)家物種鑒定及進(jìn)化研究的步伐［2，7］。

1 植物DNA條形碼技術(shù)的研究進(jìn)展

1.1 DNA條形碼的發(fā)展軌跡

從2003年至2009年，陸續(xù)召開(kāi)了多次有關(guān)DNA條形碼的國(guó)際會(huì)議。2003年，20多位分類(lèi)學(xué)專(zhuān)家、分子生物學(xué)家和生物信息學(xué)家在冷泉港召開(kāi)了2次研討會(huì)，會(huì)議題目分別為“Taxonomy and DNA”和“Taxonomy，DNA and the Barcode of Life”，以期利用某個(gè)特定基因?qū)崿F(xiàn)物種鑒定的目標(biāo)。2004年，由Sloan基金會(huì)贊助，在華盛頓史密森尼研究院(Smithsonian Institution)成立了生命條形碼聯(lián)盟(CBOL，the Consortium for the Barcode of Life)，大部分國(guó)家的自然歷史博物館、標(biāo)本館、相關(guān)研究機(jī)構(gòu)和私人機(jī)構(gòu)等都加入了該組織，致力于鑒定生物物種全球標(biāo)準(zhǔn)的研制。2005年，由CBOL和英國(guó)自然歷史博物館主辦、在倫敦召開(kāi)了生命條形碼協(xié)會(huì)第一屆國(guó)際DNA條形碼會(huì)議，決定為1 000萬(wàn)個(gè)物種建立DNA條形碼編碼庫(kù)，并將其設(shè)置在GenBank中，作為一個(gè)向公眾開(kāi)放的DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)。2007年，在臺(tái)北召開(kāi)的第二屆國(guó)際DNA條形碼會(huì)議對(duì)理想DNA條形碼的選擇展開(kāi)了深入的討論，并給予了高度的重視。2009年，在墨西哥城召開(kāi)的第三屆國(guó)際DNA條形碼會(huì)議上，與會(huì)代表對(duì)植物DNA條形碼達(dá)成共識(shí)，決定將葉綠體基因片段rbcL和matK作為植物DNA標(biāo)準(zhǔn)條形碼的核心碼，同時(shí)建議將葉綠體基因片段trnH-psbA和核基因片段ITS作為植物DNA條形碼的補(bǔ)充碼；并指出ITS2片段雖然在DNA條形碼方面具有較大的潛力，但要警惕操作過(guò)程中的真菌污染問(wèn)題。此外，要繼續(xù)開(kāi)展通用單拷貝核基因片段的篩選和測(cè)試，這對(duì)推進(jìn)全球DNA條形碼計(jì)劃有重要作用［8-10］。可見(jiàn)，DNA條形碼技術(shù)正成為國(guó)際上生物分類(lèi)學(xué)研究的一個(gè)重要方向和主要研究手段。

加拿大圭爾夫大學(xué)(University of Guelph)教授、加拿大皇家學(xué)會(huì)會(huì)員Hebert率先將條形碼技術(shù)引入生物界并提出了“DNA條形碼”的概念。Hebert等采用線(xiàn)粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I(COI)上的1段基因序列，先后對(duì)脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物11個(gè)門(mén)共13 320個(gè)物種進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)除腔腸動(dòng)物(Cnidaria)外，98％ 的物種種內(nèi)遺傳距離差異為0％～2％，種間遺傳距離差異平均值為11.3％，說(shuō)明這段COI基因序列具有良好的分類(lèi)鑒別能力，并據(jù)此提出可以建立以1段長(zhǎng)度為650 bp的COI基因序列為基礎(chǔ)的DNA條形碼識(shí)別方法［11-12］。

近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的許多學(xué)者都對(duì)植物中適合作為DNA條形碼的基因序列進(jìn)行了積極的探索和研究［6，11-15］。線(xiàn)粒體COI基因在植物中的進(jìn)化速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)慢于動(dòng)物，因此，線(xiàn)粒體基因不適合作為大多數(shù)植物的DNA條形碼；核基因組通常具有多拷貝的特性，種內(nèi)變異較大，引物通用性較差，并且擴(kuò)增時(shí)對(duì)模板DNA的質(zhì)量要求較高，不適宜于存在DNA降解的材料；葉綠體基因組相對(duì)保守，但包含許多變異區(qū)域，而且還具有一些自身的優(yōu)勢(shì)，如單親遺傳避免了基因重組、植物個(gè)體中均有大量的葉綠體，即使模板DNA高度降解也容易擴(kuò)增成功。所以，從葉綠體基因組中選擇植物DNA條形碼是可行的。

目前，研究者主要通過(guò)單一片段或多片段組合2種植物DNA條形碼對(duì)相關(guān)植物物種進(jìn)行分類(lèi)鑒定研究，并嘗試建立植物DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 單一片段植物DNA條形碼研究進(jìn)展及其優(yōu)缺點(diǎn)分析

1.2.1 單一片段植物 DNA條形碼的研究進(jìn)展Newmaster等［16-17］通過(guò)對(duì)部分植物葉綠體基因組全面詳細(xì)的分析總結(jié)出以下幾點(diǎn)：①UPA片段是適合于藻類(lèi)的DNA條形碼，同時(shí)也可以作為陸地植物DNA條形碼的組合條形碼之一；②trnD-trnY片段的分辨率比trnH-psbA片段高，但trnD-trnY片段目前在基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的記錄不多，因此，尚未引起研究者們足夠的重視；③rbcL序列的進(jìn)化率較低，不能用于識(shí)別全部物種，但可以區(qū)分許多同屬植物。有研究者提議將UPA片段作為光合作用植物的DNA條形碼，已有研究表明UPA片段在海藻中存在一定的變異，但在陸地植物中變異率很低［6，18-19］。在對(duì)陸地植物進(jìn)行大尺度取樣研究后，Kress和Erickson提出：雖然rbcL片段的變異率低但通用性較好，可以作為DNA條形碼的核心片段，對(duì)不能識(shí)別的物種可以采用高變異率的trnH-psbA片段進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)分［20］。但是，在一些特殊的植物類(lèi)群中，如傘形科(Umbelliferae)的獨(dú)活屬(Heracleum L.)和禾本科(Poaceae)的甜茅屬(Glyceria R.Br.)中，trnH-psbA片段的變異率較低［21-22］，因而trnH-psbA片段的使用應(yīng)根據(jù)物種而定。Lahaye等［23］用8個(gè)葉綠體 DNA片段對(duì)蘭科(Orchidaceae)植物進(jìn)行了研究，通過(guò)比較最終認(rèn)為matK片段可以作為有花植物通用的DNA條形碼。Fazekas等［6］采用matK、trnH-psbA、rbcL、ITS1、UPA、rpoB、rpoC1、atpF-atpH和psbK-psbI等片段對(duì)32屬92種共251株植物進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：在所有片段中trnH-psbA片段的擴(kuò)增成功率和物種識(shí)別率均最高。Newmaster等［24］指出：采用matK、trnH-psbA和rbcL片段可以對(duì)金合歡屬(Acacia Mill.)類(lèi)群進(jìn)行有效的分類(lèi)鑒定。Song等［25］采用rbcL、trnH-psbA、ndhJ、rpoB、rpoC1、accD、ycf5和 nrITS等片段對(duì)蓼科(Polygonaceae)的38個(gè)類(lèi)群進(jìn)行分析，指出trnH-psbA片段最適合作為蓼科植物鑒定的DNA條形碼。

在Hebert提出“DNA條形碼”概念后不久，中國(guó)學(xué)者也開(kāi)始關(guān)注DNA條形碼技術(shù)。陳士林領(lǐng)導(dǎo)的研究小組針對(duì)753屬4 800種植物6 600個(gè)樣品的研究結(jié)果顯示：ITS2序列具有良好的通用性，在種級(jí)水平上的分辨成功率可以達(dá)到92.7％，為此，該研究小組建議將ITS2序列作為植物DNA條形碼之一［26］。作者所在的課題組利用目前植物DNA條形碼研究中的熱點(diǎn)候選序列ITS2、trnH-psbA、rbcL、rpoC1和ycf5對(duì)蕓香科(Rutaceae)72屬192個(gè)類(lèi)群的300個(gè)樣本進(jìn)行了研究和比較，結(jié)果顯示：ITS2序列具有良好的擴(kuò)增效率和測(cè)序成功率，在所考察的候選序列中具有最大的種間變異和較小的種內(nèi)變異，且種間變異明顯大于種內(nèi)變異，同時(shí)，ITS2序列的物種鑒定成功率最高，其各個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)均優(yōu)于其他候選序列［27］；此外，ITS2序列在黃芪屬(Astragalus L.)類(lèi)群中也具有很好的通用性，擴(kuò)增效率為100％，測(cè)序成功率為85.7％，而且種間變異遠(yuǎn)大于種內(nèi)變異［28］。還有研究者對(duì)全世界樺木科(Betulaceae)赤楊屬(Alnus Mill.)所有類(lèi)群(共26種)的131個(gè)單株進(jìn)行了分析，研究結(jié)果顯示：rbcL、matK、trnH-psbA和ITS片段在種級(jí)水平上的分辨能力差異較大，分辨率分別為10.0％、31.2％、63.6％和79.6％［29］。

1.2.2 常用單一片段植物DNA條形碼的優(yōu)缺點(diǎn)隨研究的不斷深入，研究人員發(fā)現(xiàn)一些單一片段DNA條形碼存在一定的局限性，尤其是matK、trnH-psbA、rbcL和ITS等常用植物DNA條形碼的缺點(diǎn)在一定程度上制約了DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展。

與其他片段相比，matK片段的進(jìn)化速率較快，但該片段的引物通用性較差，鑒定不同類(lèi)群時(shí)往往需要設(shè)計(jì)不同的引物［2，30］。Lahaye等［23］采用matK片段的390F/1326R引物對(duì)1 667個(gè)蘭科植物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增成功率達(dá)到100％；但Fazekas等［6］采用相同引物獲得的擴(kuò)增成功率卻低于50％，因此，matK片段的引物通用性還有待更多的實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)。

trnH-psbA片段是葉綠體基因進(jìn)化速率最快的片段之一［31］，但該片段具有較高的突變率和簡(jiǎn)單的序列重復(fù)和重排，在進(jìn)行序列分析時(shí)需要人工校正［2］，從而限制了該片段在系統(tǒng)發(fā)育研究中的應(yīng)用。盡管如此，也有研究者認(rèn)為：雖然trnH-psbA片段具有一定的缺陷，但仍然可以作為潛在的DNA條形碼［20］。

在大部分植物中，rbcL片段都比較容易擴(kuò)增和測(cè)序，因而該片段被許多學(xué)者作為研究對(duì)象并開(kāi)展了相關(guān)研究［2，16，32-33］，但植物中rbcL片段的進(jìn)化率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于動(dòng)物，且其變異主要存在于種級(jí)以上水平，種級(jí)水平的變異很小，因此，有研究者提出可以將該片段作為組合DNA條形碼之一［20］。

ITS序列在陸地植物中的引物通用性較差［20］，但是可將該片段作為一個(gè)潛在的DNA條碼用于相關(guān)研究［26，34］，已有學(xué)者開(kāi)始關(guān)注ITS2片段。ITS2是ITS序列中的1個(gè)片段，位于5.8S和26S rRNA之間； ITS2片段較短，易于擴(kuò)增和測(cè)序，尤其對(duì)發(fā)生DNA降解的材料更為有利［26-27，35］；該片段在物種水平上變異較大，已被廣泛用于物種分類(lèi)及系統(tǒng)進(jìn)化研究。盡管ITS序列比ITS2片段更早受到學(xué)者們的關(guān)注，但是在某些植物類(lèi)群中ITS序列的擴(kuò)增效率比較低，不符合DNA條形碼通用性的要求［26，28，36］。

葉綠體trnL(UAA)內(nèi)含子全序列及其p6環(huán)種間變異太小，限制了其在系統(tǒng)進(jìn)化研究中的應(yīng)用，不適合作為陸地植物種級(jí)水平鑒別的DNA條形碼。雖有這些不足，但該片段仍有許多優(yōu)勢(shì)，例如：高度保守、擴(kuò)增體系穩(wěn)定、p6環(huán)在DNA高度降解的樣本中仍可以成功擴(kuò)增，因此，該片段在植物DNA條形碼中的應(yīng)用需要進(jìn)一步研究［37］。

此外，還有一些非重點(diǎn)研究的片段，例如：在非被子植物中，rpoB2片段具有較低的擴(kuò)增率；rpoC1片段雖然具有較高的擴(kuò)增率，但突變率較低。這些片段均不適合用于種級(jí)以上水平的植物物種鑒定研究［2，38］。

1.3 多片段組合植物DNA條形碼研究進(jìn)展

大量的研究結(jié)果表明：?jiǎn)为?dú)使用某一個(gè)片段對(duì)所有的植物物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定是不太可能的，為此，研究者們又相繼提出了不同的植物DNA條形碼的多序列組合方案。Kress等早在2005年就提出了多序列組合觀點(diǎn)，他們預(yù)測(cè)將trnH-psbA和ITS序列組合用于被子植物種類(lèi)鑒定將有廣泛的應(yīng)用前景，但并未做具體的實(shí)驗(yàn)研究［34］。同年，Chase等提出條形碼分析的“交通燈法”：首先使用葉綠體條形碼進(jìn)行初步分析，用綠燈表示能被準(zhǔn)確鑒定的物種；用黃燈表示存在問(wèn)題的物種，再由分析者根據(jù)實(shí)際情況判定是否需要進(jìn)一步的精確鑒定；用紅燈表示識(shí)別非常不準(zhǔn)確的物種［39］。Newmaster等［17］則提出將等級(jí)分類(lèi)的方法應(yīng)用于植物物種鑒定的觀點(diǎn)：首先選擇1個(gè)核心片段作為第1級(jí)條形碼，然后再根據(jù)不同類(lèi)群選擇不同片段作為第2級(jí)條形碼。Chase等也提出了使用條形碼組合的建議，并指出：在rpoC1和rpoB與matK的組合中，rpoC1和rpoB序列的引物通用性較好，擴(kuò)增成功率也較高，雖然進(jìn)化速率較慢，但也能區(qū)分出許多物種；matK序列變異較大，能夠提供更多的識(shí)別信息，但是matK序列的引物通用性還有待進(jìn)一步研究；在rpoC1和matK與trnH-psbA的組合中，保守的rpoC1序列和長(zhǎng)度一定的matK序列可以保證大部分物種的種間鑒定，再加上高變異率的trnH-psbA序列就可以識(shí)別出更多的物種［30］。2005年，Kress和Erickson［20］通過(guò)對(duì) rbcL、rpoC1、rpoB2、trnH-psbA、matK和ITS1序列的兩兩組合分析，最終確定rbcL和trnH-psbA組合適用于對(duì)陸地植物的識(shí)別和鑒定；在這些葉綠體基因片段中，rpoB2、rpoC1、rbcL、matK屬于編碼區(qū)片段，trnH-psbA屬于非編碼區(qū)片段。Fazekas等［6］認(rèn)為：DNA條形碼的識(shí)別能力與組合片段的數(shù)目有一定關(guān)系；在兩兩片段組合中，rbcL和trnH-psbA組合的擴(kuò)增率和物種識(shí)別率最高。通過(guò)對(duì)7個(gè)候選序列進(jìn)行單個(gè)分析、兩兩組合分析和三個(gè)組合分析后，CBOL植物工作組指出：三個(gè)組合與兩兩組合的鑒別力一樣，而且增加了鑒別工作量和投入成本，建議將rbcL和matK組合作為鑒別陸地植物的通用DNA條形碼［2］。任保青等［29］認(rèn)為：在整個(gè)植物界，若想用1個(gè)基因或1個(gè)短的DNA片段來(lái)區(qū)別所有物種幾乎是不可能的，但是可以通過(guò)1個(gè)條形碼組合在基因組范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)階層條形碼，進(jìn)而逐級(jí)縮小鑒定范圍，最終達(dá)到物種自動(dòng)鑒定的目的；在陸地植物中比較可行的DNA條形碼組合是rbcL、matK、ITS與trnH -psbA的組合，分別適于科級(jí)、屬級(jí)、種級(jí)類(lèi)群的鑒別。

多序列組合方案為植物DNA條形碼的研究指出了一個(gè)新的方向，但根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果篩選出的片段并不能完全滿(mǎn)足DNA條形碼的標(biāo)準(zhǔn)，仍需要大量的實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證它們的物種識(shí)別和鑒定能力。

1.4 植物DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)的篩選

迄今為止，已有大量的DNA片段被作為DNA條形碼用于物種鑒定，有的是單一片段方式，有的則是序列組合方式，但目前對(duì)于植物DNA條形碼的選擇還沒(méi)有一個(gè)明確的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)當(dāng)前的發(fā)展?fàn)顩r，Kress等［34］和Taberlet等［37］提出了理想的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)：①種間應(yīng)有明顯的變異以鑒別所有物種，同時(shí)種內(nèi)變異應(yīng)足夠??；②DNA條形碼應(yīng)盡可能標(biāo)準(zhǔn)化，即采用同一DNA片段來(lái)鑒定物種；③DNA片段應(yīng)足夠短，長(zhǎng)度約700 bp，便于單向測(cè)序，也有利于PCR擴(kuò)增，尤其是對(duì)DNA易降解的材料更有利；④存在高度保守區(qū)域，便于設(shè)計(jì)通用引物，并且該DNA片段易擴(kuò)增和測(cè)序；⑤目標(biāo)DNA條形碼應(yīng)包括足夠的種系進(jìn)化信息，以便對(duì)物種進(jìn)行系統(tǒng)分類(lèi)。

Erickson等［40］提出了可進(jìn)行量化和優(yōu)化的陸生植物DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)：①PCR擴(kuò)增成功率至少90％；②選擇1個(gè)在系統(tǒng)進(jìn)化研究中已經(jīng)被研究多年的DNA片段作為條形碼；③DNA條形碼之間應(yīng)具有互補(bǔ)性且不相關(guān)聯(lián)，將準(zhǔn)確鑒定的可能性最大化；④使用的DNA條形碼在分類(lèi)學(xué)應(yīng)用中應(yīng)具有普遍意義；⑤具有可行的生物信息學(xué)分析方法。

事實(shí)上，完美的植物DNA條形碼并不存在，對(duì)于不同的使用目的，以上標(biāo)準(zhǔn)并非都適用。例如，對(duì)于分類(lèi)學(xué)家而言，DNA條形碼具有足夠種系進(jìn)化信息和高度變異非常重要；而對(duì)于法醫(yī)鑒定或者加工食品的鑒定，DNA條形碼的標(biāo)準(zhǔn)化更為重要［39］。

2 植物DNA條形碼技術(shù)的應(yīng)用范疇

2.1 物種鑒定以及新種和隱種的發(fā)現(xiàn)

除了可以進(jìn)行物種鑒定外，利用DNA條形碼技術(shù)還可以發(fā)現(xiàn)許多新種和隱種。例如，Lahaye等［23］單獨(dú)使用matK片段對(duì)分布在中美洲的1 000多種蘭科植物進(jìn)行分析，顯示單獨(dú)使用matK片段能夠揭示隱種并且證明了DNA條形碼的可行性；2010年，Newmaster等［41］通過(guò)DNA條形碼技術(shù)發(fā)現(xiàn)了感應(yīng)草屬(Biophytum DC.)中的3個(gè)隱種，并發(fā)現(xiàn)了草沙蠶屬(Tripogon Roem.et Schult.)的1個(gè)新種。協(xié)助傳統(tǒng)分類(lèi)方法發(fā)現(xiàn)那些形態(tài)相似但存在遺傳分化的隱種是DNA條形碼技術(shù)對(duì)分類(lèi)學(xué)研究的重要貢獻(xiàn)，可顯著提高實(shí)地生態(tài)學(xué)考察研究的準(zhǔn)確性和效率。

2.2 用于解決一些生物學(xué)問(wèn)題

Jurado-Rivera等［38］認(rèn)為：DNA條形碼還可用于解決一些復(fù)雜的生物學(xué)問(wèn)題，如寄生關(guān)系等。通過(guò)擴(kuò)增草食性動(dòng)物牛的trnL基因，發(fā)現(xiàn)Peltoschema與4種寄生植物關(guān)系密切。因此，利用DNA條形碼可以正確識(shí)別寄生植物并確定營(yíng)養(yǎng)關(guān)系。

2.3 在民族植物學(xué)研究中的應(yīng)用

值得一提的是，DNA條形碼技術(shù)在民族植物學(xué)研究中也得到了一定的應(yīng)用。民族植物學(xué)以傳統(tǒng)社會(huì)管理和利用的植物為主要研究對(duì)象，在研究過(guò)程中常常通過(guò)借助民間分類(lèi)學(xué)家(parataxonomist)的知識(shí)來(lái)獲得當(dāng)?shù)厝藢?duì)植物進(jìn)行分門(mén)別類(lèi)的信息。這些民間分類(lèi)學(xué)家的知識(shí)有些是傳承自長(zhǎng)輩、有些則結(jié)合了自己的觀察和實(shí)踐，他們不必像分類(lèi)學(xué)家那樣一般需要獲得植物的繁殖器官才能有效鑒定物種，而是基于他們長(zhǎng)期積累的知識(shí)、通過(guò)植物某個(gè)生長(zhǎng)階段的某個(gè)(些)器官(通常是營(yíng)養(yǎng)器官)，就能準(zhǔn)確說(shuō)出植物的當(dāng)?shù)孛Q(chēng)、生長(zhǎng)習(xí)性、資源和分布狀況、用途和用法等。在開(kāi)展民族植物學(xué)研究的過(guò)程中，由植物分類(lèi)學(xué)家和民間分類(lèi)學(xué)家分別獲得的植物種數(shù)往往存在一定的差異，或前者數(shù)量多于后者，或后者數(shù)量多于前者。到底哪一個(gè)物種數(shù)是準(zhǔn)確的?在沒(méi)有足夠的時(shí)間等待植物開(kāi)花和結(jié)果的情況下，采集植物葉片通過(guò)DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行分類(lèi)鑒定，是一種理想的快速鑒別方法。基于這樣的設(shè)想，加拿大圭爾夫大學(xué)的Newmaster博士及其合作者，將DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于民族植物學(xué)的研究。印度南部西高止山脈的2個(gè)山地部落Irulas和Malasars把在當(dāng)?shù)乇环Q(chēng)為“Sunai pul”的1種草沙蠶屬禾草用于祭祀和其他經(jīng)濟(jì)用途，這種植物對(duì)當(dāng)?shù)厣鐓^(qū)居民十分重要，因而當(dāng)?shù)氐拿耖g分類(lèi)學(xué)家(或信息提供者informant)能輕易識(shí)別這一物種。有趣的是，這是1個(gè)植物分類(lèi)學(xué)上的隱種，植物分類(lèi)學(xué)家難以通過(guò)形態(tài)特征來(lái)識(shí)別。Newmaster等采用DNA條形碼技術(shù)，不僅證實(shí)了民間分類(lèi)學(xué)家鑒定該物種的正確性，而且發(fā)現(xiàn)Sunai pul是植物學(xué)上的1個(gè)新種，將其命名為T(mén)ripogon cope Newmaster。因此，他們認(rèn)為DNA條形碼技術(shù)可以應(yīng)用于一些民間分類(lèi)群(ethnotaxon)的鑒定和識(shí)別［42］。Newmaster等還將DNA條形碼與基因組學(xué)的相關(guān)技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用于印度一些部落的民間分類(lèi)群，包括民族藥用植物。在此基礎(chǔ)上，他們提出了“民族植物基因組學(xué)”(ethnobotany genomics)的概念，認(rèn)為通過(guò)民族植物基因組學(xué)的研究，可以識(shí)別一些隱種，還能確定一些珍稀植物的分布及其生態(tài)學(xué)特性［41］。

清風(fēng)藤屬(Sabia Colebr.)中的小花清風(fēng)藤(Sabia parviflora Wall.ex Roxb.)是1種非常重要的民間藥用植物，被貴州和云南的布依族民眾廣泛用于治療黃疸型肝炎、止血和消炎，布依族民眾也使用同屬植物作為代用品，但是一些形態(tài)相似的混淆品已經(jīng)進(jìn)入市場(chǎng)。龍春林領(lǐng)導(dǎo)的研究組用trnH-psbA、rbcL和matK片段對(duì)6種清風(fēng)藤屬植物和7種市場(chǎng)混淆品進(jìn)行鑒定［43］，結(jié)果表明：這3個(gè)DNA片段的擴(kuò)增成功率和物種識(shí)別率都很高，且小花清風(fēng)藤與同屬替代品之間的序列差異率較低(僅為0.00％～0.86％)，但與混淆品之間的序列差異率卻較高(達(dá)24.50％)，說(shuō)明布依族民眾識(shí)別清風(fēng)藤屬植物的傳統(tǒng)知識(shí)是可靠的。研究結(jié)果還表明，DNA條形碼技術(shù)不僅可以有效鑒別市場(chǎng)上小花清風(fēng)藤的混淆品，而且對(duì)民族傳統(tǒng)醫(yī)藥文化的保護(hù)有重要作用。

2.4 構(gòu)建AIT系統(tǒng)

2009年，Newmaster等［44］提出開(kāi)發(fā)和研制 AIT (automated identification technology)系統(tǒng)，即：將1片未知的植物葉片插入AIT機(jī)，通過(guò)無(wú)線(xiàn)網(wǎng)絡(luò)，就可以獲得該葉片所代表植物的名稱(chēng)、分布、化學(xué)成分、食用價(jià)值等，既省時(shí)又經(jīng)濟(jì)，可代替昂貴又費(fèi)時(shí)的傳統(tǒng)分類(lèi)方法，同時(shí)也減少了通過(guò)形態(tài)特征識(shí)別物種的一些限制因素。預(yù)計(jì)AIT系統(tǒng)可能會(huì)給生物界帶來(lái)革命性的改變，也會(huì)對(duì)人類(lèi)社會(huì)產(chǎn)生重要影響。

3 植物DNA條形碼技術(shù)的工作流程及分析方法

3.1 工作流程

植物DNA條形碼技術(shù)的工作流程主要包括采集樣品、提取DNA、選擇DNA條形碼、設(shè)計(jì)引物或者使用通用引物、擴(kuò)增序列、編輯與人工校正序列、分析結(jié)果、將最終結(jié)果提交至相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)等八大步驟。其中，采樣是全部工作的基礎(chǔ)，需要制定標(biāo)準(zhǔn)化流程以便能進(jìn)一步復(fù)核研究結(jié)果。序列分析是DNA條形碼研究中最重要的一步，經(jīng)過(guò)對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)和人工校正后，采用MEGA或PAUP法計(jì)算物種的種內(nèi)和種間K2P距離(kimura-2-parameter distance)，以確定遺傳距離的閾值，比較種、屬和科3個(gè)水平上的序列差異。然后，根據(jù)上述分析結(jié)果建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，最后依據(jù)DNA條形碼分析的聚類(lèi)結(jié)果就能對(duì)未知樣本進(jìn)行分類(lèi)和鑒定，也可以發(fā)現(xiàn)隱種［38，45-50］。

3.2 分析方法

由于植物的種間雜交現(xiàn)象比較普遍，因此植物DNA條形碼的分析方法也處于不斷的摸索過(guò)程中，目前報(bào)道的分析方法主要包括以下幾種：

3.2.1 DNA條形碼校對(duì)機(jī)制 在分析過(guò)程中，可能會(huì)由于多種原因?qū)е聰U(kuò)增的序列不正確，如采樣時(shí)存在污染、PCR污染、測(cè)序過(guò)程錯(cuò)誤等，可以通過(guò)DNA條形碼序列分析發(fā)現(xiàn)這些錯(cuò)誤，并重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序和人工校正以糾正錯(cuò)誤序列，或找多位專(zhuān)家對(duì)憑證標(biāo)本進(jìn)行重新鑒定。DNA條形碼序列具有三大校對(duì)防錯(cuò)機(jī)制，即序列校對(duì)防錯(cuò)、系統(tǒng)樹(shù)分析防錯(cuò)、barcoding gap檢驗(yàn)防錯(cuò)，以確保DNA條形碼序列和物種的正確對(duì)應(yīng)關(guān)系［14］。

3.2.2 DNA條形碼序列分析 向GenBank提交獲得的序列后，用Clustal X軟件對(duì)序列進(jìn)行排序并用DNAMAN軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)后，使用Bioedit軟件完成格式轉(zhuǎn)換，再用MEGA4.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)，最后，用bootstrap分析法檢驗(yàn)(1 000次重復(fù))嚴(yán)格一致性樹(shù)中各分支的可信度［2，14］。

3.2.3 DNA條形碼序列的鑒定效率評(píng)價(jià) 一般采用4種方法評(píng)價(jià)DNA條形碼序列的物種鑒定能力。

一是BLAST搜索法(相似性搜索算法)。該方法首先需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)建立物種的序列數(shù)據(jù)庫(kù)，并確定一個(gè)閾值，將樣本的DNA序列與全體序列進(jìn)行比對(duì)，如果可以在數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到僅包含query序列及同物種的序列，則認(rèn)為該query序列可以準(zhǔn)確鑒定到種。該方法具有運(yùn)行速度快、精確度高的特點(diǎn)。

二是序列之間遺傳距離的比較法。通過(guò)比較樣本DNA序列與全體序列的K2P距離，確定種內(nèi)和種間變異的閾值，即barcoding gap，進(jìn)而評(píng)估其物種鑒定效果。常用柱形圖來(lái)呈現(xiàn)種內(nèi)及種間遺傳距離的分布頻度。該方法比較耗時(shí)，并且對(duì)于缺失位點(diǎn)和變異位點(diǎn)的等價(jià)處理會(huì)造成一些數(shù)據(jù)誤差［51］。

三是系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的建立。建樹(shù)的目的是為了檢驗(yàn)每個(gè)物種的單系性，即同一物種的不同個(gè)體能否緊密聚集在一起，當(dāng)不同物種聚在一起時(shí)則認(rèn)為該DNA條形碼不能夠正確鑒定物種［14，23，52］。

四是在篩選DNA條形碼的研究過(guò)程中，需要對(duì)各個(gè)片段的效果進(jìn)行評(píng)估，因此需要對(duì)不同片段在種內(nèi)和種間的變異進(jìn)行比較，目前采用Wilcoxon signed rank tests法進(jìn)行比較。

4 影響植物DNA條形碼技術(shù)鑒定準(zhǔn)確性的因素

4.1 物種的類(lèi)型和數(shù)量

評(píng)價(jià)種內(nèi)距離通常采用3個(gè)參數(shù)，即K2P距離、平均θ值和平均溯祖度，這3個(gè)參數(shù)均會(huì)隨樣本數(shù)的增多而增大，因此應(yīng)盡可能增加物種內(nèi)的取樣個(gè)體數(shù)。然而，出于對(duì)成本的考慮，通常認(rèn)為每個(gè)物種內(nèi)的個(gè)體采集數(shù)量應(yīng)盡量不超過(guò)10個(gè)，并且最好包括5個(gè)居群的個(gè)體，這就要求研究者必須對(duì)擬作為DNA條形碼使用的基因片段有充分的了解［53］。此外，還可以應(yīng)用種間距離平均值(average interspecific distance)、種間平均變異θ值(average theta prime)和種間最小距離(smallest interspecific distance)［26，51］這3個(gè)參數(shù)來(lái)對(duì)種間差異進(jìn)行評(píng)估。

4.2 系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建方法

系統(tǒng)樹(shù)又叫進(jìn)化樹(shù)，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)的方法主要分為獨(dú)立元素法(discrete charactermethod)和距離依靠法(distancemethod)2種。其中，獨(dú)立元素法包括最大簡(jiǎn)約性法(maximum parsimonymethod)和最大可能性法(maximum likelihood method)；距離依靠法包括除權(quán)配對(duì)法(UPGMA)和鄰位相連法(neighborjoining)。Lahaye等［23］對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行了分析，認(rèn)為MP和UPGMA的物種正確識(shí)別率相對(duì)較高，但結(jié)果相差不大時(shí)選用NJ樹(shù)則能達(dá)到快速簡(jiǎn)便的效果。不同建樹(shù)方法得到的結(jié)果有一定差異，只有采用適當(dāng)方法構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)才會(huì)接近真實(shí)的“進(jìn)化樹(shù)”。

4.3 雜交/基因滲入

通常，物種間的邊界會(huì)由于雜交或基因滲入等原因而顯得模糊不清，這種情況下需要通過(guò)DNA條形碼的不同組合方式來(lái)增加標(biāo)記數(shù)，以達(dá)到準(zhǔn)確區(qū)分物種的目的。

4.4 物種起源時(shí)間的差異

如果物種之間產(chǎn)生生殖隔離的時(shí)間非常短，那么采用DNA條形碼技術(shù)來(lái)鑒定這些物種就比較困難。然而，化石記錄顯示大多數(shù)物種分化時(shí)間都超過(guò)了100萬(wàn)年，因此，對(duì)于大部分物種而言，采用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行鑒定工作比較簡(jiǎn)單［54-55］。

4.5 分子進(jìn)化速率差異

有研究表明，如果某個(gè)類(lèi)群中的各個(gè)譜系分子進(jìn)化速率不一致且差異達(dá)到100倍時(shí)，由于進(jìn)化快的譜系存在2次突變，在這個(gè)類(lèi)群中鑒定出進(jìn)化速率慢的物種將變得非常困難［56］。因此，分子進(jìn)化速率差異對(duì)DNA條形碼技術(shù)鑒定物種的準(zhǔn)確率有較大影響。

5 植物DNA條形碼技術(shù)研究存在的問(wèn)題與展望

自Hebert提出“DNA條形碼”概念以來(lái)，該技術(shù)得到了許多生物學(xué)家的支持并有較大進(jìn)展。由于COI基因在動(dòng)物鑒定中幾乎百分之百的成功，因此許多學(xué)者認(rèn)為DNA條形碼技術(shù)在一定條件下是可行的［11，57-58］；然而，也有部分學(xué)者持懷疑和反對(duì)態(tài)度，認(rèn)為采用DNA條形碼技術(shù)將是一種倒退［59］，會(huì)將分類(lèi)學(xué)退回到類(lèi)型學(xué)［60］。雖然有人認(rèn)為傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)在未來(lái)將被DNA條形碼取而代之，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為DNA條形碼可彌補(bǔ)傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)方法的不足，是對(duì)日漸萎縮的傳統(tǒng)形態(tài)分類(lèi)學(xué)強(qiáng)有力的補(bǔ)充。此外，還有一些學(xué)者認(rèn)為如此短的DNA片段不能提供物種水平的可靠信息，完全依靠DNA條形碼會(huì)導(dǎo)致鑒定錯(cuò)誤。

同一DNA條形碼片段在不同類(lèi)群中的應(yīng)用效果不一樣，因而目前尚未獲得一致的植物DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)片段，因此，當(dāng)前的研究熱點(diǎn)仍然是對(duì)可能的DNA條形碼片段進(jìn)行選擇和評(píng)價(jià)，并進(jìn)行更大規(guī)模的分析和整體評(píng)價(jià)。將DNA條形碼技術(shù)與其他分類(lèi)學(xué)方法結(jié)合使用，有助于區(qū)別個(gè)體及加快發(fā)現(xiàn)新物種的速度，然而，DNA條形碼只能作為一種初步篩選技術(shù)達(dá)到快速識(shí)別的目的，若要最終確定一個(gè)新物種，還需要經(jīng)過(guò)很多縝密的檢測(cè)手段。目前，植物DNA條形碼的分析方法還不夠成熟，需要生物信息學(xué)領(lǐng)域的專(zhuān)家開(kāi)發(fā)出適合多片段和針對(duì)某些特殊片段的分析方法。另外，對(duì)于植物DNA條形碼技術(shù)的價(jià)值還存在一些爭(zhēng)議，關(guān)于該技術(shù)能否適用于動(dòng)植物近緣和近期分化物種的鑒定也存在較大的爭(zhēng)議，這也是DNA條形碼技術(shù)研究的難點(diǎn)［41，61-65］。

雖然目前在DNA條形碼研究中投入的資金比較大，但是一旦成功構(gòu)建出一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)、統(tǒng)一的DNA條形碼序列數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)計(jì)出AIT系統(tǒng)，不僅能方便不同人群和民眾準(zhǔn)確地采集和鑒別植物，而且還能滿(mǎn)足不同背景的專(zhuān)業(yè)人員快速鑒定植物的需求，并能降低鑒定物種所需的人力和資金成本。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，測(cè)序過(guò)程將會(huì)更快速、更便宜，從這個(gè)意義上講，DNA條形碼技術(shù)是一個(gè)快捷、經(jīng)濟(jì)又實(shí)用的技術(shù)［24］。

序列標(biāo)記、DNA庫(kù)和組織庫(kù)(分類(lèi)憑證標(biāo)本)是實(shí)現(xiàn)條形碼標(biāo)準(zhǔn)化的3個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。隨著條形碼序列數(shù)據(jù)的不斷積累及研究范圍的不斷擴(kuò)大，同時(shí)伴隨大規(guī)模測(cè)序所產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)，條形碼研究會(huì)逐漸實(shí)現(xiàn)與世界范圍內(nèi)其他分類(lèi)學(xué)研究計(jì)劃的協(xié)調(diào)發(fā)展，作為一種物種鑒定工具必將廣泛應(yīng)用于植物系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)的研究，并在其他領(lǐng)域(如生藥學(xué)、民族植物學(xué)等)得到應(yīng)用。同時(shí)，包括質(zhì)體、核糖體、較短的低拷貝核基因等多個(gè)基因位點(diǎn)在內(nèi)的組合DNA條形碼的出現(xiàn)，將有效克服在被子植物物種分類(lèi)和鑒定過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)的由于雜交和多倍體現(xiàn)象所帶來(lái)的問(wèn)題。

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