殷麗天，李 媛，李 莉，崔慧慧，黃 幸，楊建一

（山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，太原 030001）

高鹽攝入被認(rèn)為是高血壓發(fā)生最重要的因索之一［1］。20世紀(jì)70年代，Luft等［2］根據(jù)高血壓患者對高鹽攝入后的血壓反應(yīng)及潴鈉的程度，首先提出了鹽敏感性的概念。之后，對于鹽敏感性高血壓的研究逐步展開。鹽敏感性高血壓是指由于相對高鹽攝入所引起的血壓升高［3-6］。除流行病學(xué)外，對鹽敏感性高血壓的研究多采用動(dòng)物模型進(jìn)行。血壓升高過程涉及到腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）和各種細(xì)胞因子的作用，血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）是RAS的主要活性肽，AngⅡ的大多數(shù)生理效應(yīng)是通過細(xì)胞表面的血管緊張素Ⅱ性受體（angiotensinⅡ type 2 receptor，AT1R）進(jìn)行的。AT1R主要存在于血管平滑肌表面、上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞和腎小球膜細(xì)胞等，其激活導(dǎo)致血管收縮，升高血壓等。國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）腎素血管緊張素系統(tǒng)研究已有一定進(jìn)展［7］，但在感覺神經(jīng)損傷性鹽敏感性高血壓大鼠模型尚未見報(bào)道。在鹽敏感性高血壓大鼠中，血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）的表達(dá)如何？本研究建立感覺神經(jīng)損傷性鹽敏感性高血壓大鼠模型，觀察探討大鼠心肌和腎臟組織中AT1R在基因和蛋白水平的表達(dá)水平，探討其在鹽敏感性高血壓發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Wistar大鼠，由山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供［合格證號：醫(yī)動(dòng)字第070102，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室許可證號：SYXK（晉）2009-0001號］。

1.2 主要儀器設(shè)備

YD-202C切片機(jī)，浙江金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠；Progene Techne PCR擴(kuò)增儀；DYY-7C型電泳儀，北京六一儀器廠；JY-SPCT水平電泳槽，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；Neofuge15R臺式高速冷凍離心機(jī)，上海力申科學(xué)儀器有限公司；Tanon 2500凝膠成像系統(tǒng)，天能（上海）科技有限公司；UV-2602型紫外分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；BL-410生物信號顯示與處理系統(tǒng)，成都泰盟電子有限公司；HX-Ⅱ小動(dòng)物血壓計(jì)。

1.3 藥品與試劑

辣椒辣素（CAP），美國Sigma公司；蘇木素，F(xiàn)MP公司；溴化乙錠（EB），美國Sigma公司分裝；瓊脂糖，Solarbio公司；高效切片石蠟，上海華申康復(fù)器材有限公司生產(chǎn)；免疫組化試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)；RT-PCR試劑盒，寶生物工程有限公司（大連）生產(chǎn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物模型復(fù)制及分組：參考相關(guān)文獻(xiàn)［8］建立模型與分組：雄性Wistar大鼠生后第1～2天，實(shí)驗(yàn)組皮下注射辣椒辣素50mg/kg（溶解在含5％乙醇、5％吐溫80的生理鹽水中）；對照組皮下注射同體積的溶液（含5％乙醇、5％吐溫80的生理鹽水）。哺乳期（3周）后，雄性大鼠被隨機(jī)分成以下4組：對照+正常鹽飲食組（飼料中含1％NaCl，CON-NS）；對照+高鹽飲食組（飼料中含4％NaCl，CON-HS）；辣椒辣素+正常鹽飲食組（CAP-NS）；辣椒辣素+高鹽飲食組（CAP-HS）。每組8只動(dòng)物分別接受以上不同的處理4周。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)過程：分組時(shí)及分組后各周用尾套法測量大鼠清醒時(shí)尾收縮壓，測三次取均值。動(dòng)物8周齡時(shí)模型建立。心尖部取約100mg心肌組織，置于凍存管，液氮中保存，準(zhǔn)備行RT-PCR檢測。沿房室環(huán)剪去大血管、心房及右室游離壁，將余下的室間隔、左室游離壁作為左心室，左心室側(cè)壁取一塊狀心肌組織，以4％甲醛液固定，準(zhǔn)備行免疫組化檢測；取右側(cè)腎臟約100mg組織，置于凍存管，液氮中保存，用于RT-PCR檢測；左側(cè)腎臟組織，以4％甲醛固定，準(zhǔn)備行免疫組化檢測。

1.4.3 免疫組化檢測大鼠心肌和腎臟AT1R蛋白表達(dá)：操作步驟按免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行。用Image-Pro Plus 5.1圖像分析軟件分析大鼠心肌和腎臟AT1R的表達(dá)水平，以吸光度（A）值表示其相對含量。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of the primers

表2 各組大鼠血壓的變化（±s，n=8）Tab.2 Changes of the blood pressure the rats of the four groups（±s，n=8）

表2 各組大鼠血壓的變化（±s，n=8）Tab.2 Changes of the blood pressure the rats of the four groups（±s，n=8）

注：*與CON-NS組比較，P＜0.01。Note：* Compared with the CON-NS group，P＜0.01.

組別Group血 壓 值（mmHg）Blood pressure（mmHg）0周0 week 1周1 week 2周2 weeks 3周3 weeks 4周4 weeks CAP-HS 89.50±10.02 115.50±10.20 128.25±15.67 136.507±9.97* 152.13±10.05* CAP-NS 86.00±9.52 107.13±8.76 115.63±14.00 117.50 ±12.68 116.50±9.84 CON-HS 87.75±12.66 113.00±11.56 123.13±13.12 126.50 ±9.75 123.00±8.91 CON-NS 85.38±8.14 109.63±10.50 118.75±12.16 116.13 ±10.30 115.63±12.21

1.4.4 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測大鼠心肌和腎臟AT1RmRNA表達(dá)：操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。從NCBI的nucleotide中查得目的基因，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)ACE和ACE2上下游引物。AT1R、β-actin的序列參考Lan He等［9］文獻(xiàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行產(chǎn)物半定量分析，比值表示其相對含量。各對引物序列如表1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：

用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用單因素方差分析檢驗(yàn)其顯著性。

2 結(jié)果

2.1 收縮壓變化

在實(shí)驗(yàn)過程中各組大鼠尾收縮壓均有明顯增加。從第2周開始，CAP-HS組尾收縮壓開始高于正常組，到第3、4周，CAP-HS組的尾收縮壓與CON-NS組比較差異有顯著性（P＞0.05）。CAPNS、CON-HS、CON-NS三個(gè)組的尾收縮壓均在正常血壓范圍之內(nèi)，差異不顯著（表2）。

2.2 大鼠心肌和腎臟組織AT1R蛋白表達(dá)

CAP-HS組大鼠腎臟組織中AT1R蛋白呈彌散性高表達(dá)（圖1）；CAP-NS組有少量表達(dá)（圖2）；CON-HS組表達(dá)較多（圖3）；CON-NS組表達(dá)同CAP-NS組相似，少量表達(dá)（圖4）。在心肌組織中，CAP-HS組組織中高表達(dá)AT1R蛋白（圖5）；CAPNS組有少量表達(dá)（圖6）；CON-HS組表達(dá)也比較多（圖7）；CON-NS組表達(dá)同CAP-NS組相似，有少量表達(dá)（圖8），（圖1～8見彩插1）。

2.3 免疫組織化學(xué)圖像分析

采用Image-Pro-Plus圖象分析軟件對免疫組化染色切片進(jìn)行計(jì)量分析。隨機(jī)從每張切片左上、左下、右上、右下和中部采集5個(gè)區(qū)域計(jì)算每個(gè)視野陽性染色的累積光密度值（integrated optical density，IOD），對免疫組化進(jìn)行定量分析，計(jì)算心肌、腎臟組織中AT1R的表達(dá)量。IOD是陽性面積與陽性平均光密度的乘積。面積越大，光密度越大，IOD的值越大。分析方法同Gomori染色圖像分析。

CAP-HS組大鼠心肌、腎臟組織中AT1R蛋白表達(dá)陽性率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于CON-NS組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01；CON-HS組AT1R蛋白表達(dá)陽性率較CONNS有差異，且P＜0.05（表3）。

表3 各組大鼠心肌、腎臟AT1R免疫組化IOD值比較（±s，n=8）Tab.3 Comparison of IOD of kidney and heart in the rats of the four groups（±s，n=8）

表3 各組大鼠心肌、腎臟AT1R免疫組化IOD值比較（±s，n=8）Tab.3 Comparison of IOD of kidney and heart in the rats of the four groups（±s，n=8）

注：＊＊與CON-NS比較，P＜0.01；*與CON-NS比較，P＜0.05。Note：＊＊Compared with the CON-NS group，P＜0.01；*Compared with the CON-NS group，P＜0.05.

組別Group 心肌Heart 腎臟Kidney CAP-HS 31979.5±7873.6＊＊ 30942.8±2252.1＊＊CAP-NS 9747.8±5215.8 3802.1±643.8 CON-HS 15370.7±4621.6* 10571.1±1126.2* CON-NS 8116.9±4988.8 3682.9±780.6

2.4 腎臟、心肌組織AT1RmRNA表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示，腎臟、心肌組織AT1RmRNA表達(dá)中：β-actin在228bp位置上有清晰明亮的條帶，亮度相似（圖9、圖10）；腎臟和心肌組織中的AT1R表達(dá)在464bp位置上有清晰條帶，但明亮程度有差別。其中第4泳道CAP-HS組AT1RmRNA條帶最亮，第2泳道CON-HS組條帶次亮，第3、1泳道CAPNS、CON-NS組亮度相似（圖11、圖12）。

圖9 各組大鼠腎臟AT1R與β-actin表達(dá)電泳圖Fig.9 AT1R and β-actin expression in the kidney

圖10 各組大鼠心肌AT1R與β-actin表達(dá)電泳圖Fig.10 AT1R and β-actin expression in the heart

圖11 各組大鼠腎臟AT1RmRNA表達(dá)電泳圖Fig.11 AT1RmRNA expression in the kidney

圖12 各組大鼠心肌AT1R mRNA表達(dá)電泳圖Fig.12 AT1R mRNA expression in the heart

2.5 大鼠腎臟、心肌組織AT1R mRNA表達(dá)分析

采用凝膠成像系統(tǒng)和紫外分光光度計(jì)分析AT1R mRNA表達(dá)。大鼠心肌組織CAP-HS組和COH-HS組AT1R mRNA的表達(dá)與其CON-NS組比較差異有顯著性（P＜0.01）；腎臟組織中，CAP-HS組表達(dá)與CON-NS組比較差異有顯著性（P＜0.01）；CON-HS組較CON-NS比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且P＜0.05（表4）。

表4 各組大鼠心肌、腎臟組織AT1R mRNA表達(dá)圖像分析IOD值比較（±s，n=8）Tab.1 Image analysis of the IOD of AT1R mRNA in the heart and kidney of rats（±s，n=8）

表4 各組大鼠心肌、腎臟組織AT1R mRNA表達(dá)圖像分析IOD值比較（±s，n=8）Tab.1 Image analysis of the IOD of AT1R mRNA in the heart and kidney of rats（±s，n=8）

注：＊＊與CON-NS比較，P＜0.01；*與CON-NS比較，P＜0.05。Note：＊＊Compared with the CON-NSgroup，P＜0.01；*Compared with the CON-NS group，P＜0.05

組別Group 心肌Heart 腎臟Kidney CAP-HS 0.779±0.04＊＊ 0.711±0.05＊＊CAP-NS 0.311±0.01 0.318±0.05 CON-HS 0.609±0.01＊＊ 0.463±0.07* CON-NS 0.303±0.04 0.305±0.06

3 討論

AT1R的激活可以產(chǎn)生血管收縮、升高血壓、細(xì)胞增殖、氧化、醛固酮釋放、水鈉重吸收、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長以及纖維化等作用。AT1R主要存在于血管平滑肌表面（VSMCs）、上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞和腎小球膜細(xì)胞，介導(dǎo)血管舒縮、水鹽代謝以及血管平滑肌細(xì)胞增殖與肥大、功能調(diào)節(jié)等生理學(xué)效應(yīng)，是RAS作用于效應(yīng)器的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。據(jù)研究，除細(xì)胞膜上有AT1R外，細(xì)胞核及染色體上也均發(fā)現(xiàn)有AngⅡ的特異性結(jié)合位點(diǎn)。細(xì)胞自身合成的AngⅡ能以胞內(nèi)分泌的方式通過細(xì)胞核及染色體上的AngⅡ特異性結(jié)合位點(diǎn)介導(dǎo)其生理功能［10］。

高血壓疾病中，AngⅡ是主要的縮血管物質(zhì)和致血管重構(gòu)的重要因素。AngⅡ調(diào)節(jié)血管結(jié)構(gòu)及功能的主要過程是與其特異的受體（AT1R）結(jié)合，激活PLC-β（G蛋白偶聯(lián)的磷脂酶C-β），產(chǎn)生兩種重要的第二信使分子，三磷酸肌醇（IP3）和三酰甘油（DAG），導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣釋放和蛋白激酶C激活，并對包括轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的多種底物進(jìn)行磷酸化調(diào)節(jié)，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［11，12］。后來發(fā)現(xiàn)，AngⅡ與AT1R結(jié)合后，還可激活可溶性酪氨酸激酶PP60，然后磷酸化和刺激PLC-γ1，PLC-γ1進(jìn)一步水解磷酯酰肌醇，最終生成IP3和DAG。IP3可激活肌漿網(wǎng)，致細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，細(xì)胞內(nèi)鈣增加又可激活低電導(dǎo)的氯離子通道，使膜去極化激活鈣通道，致鈣內(nèi)流增加［13，14］。一方面使游離Ca2+濃度增高，另一方面通過特異的離子流激活核基因及增加胞漿蛋白合成。AT1R介導(dǎo)多種活性，其表達(dá)是通過AngⅡ，生長因子、雌激素、類固醇、低密度脂蛋白的改變來完成的［15，16］。

本課題組曾經(jīng)在感覺神經(jīng)損傷性高血壓大鼠中研究RAS系統(tǒng)中ACE和ACE2的表達(dá)［17］，作為此系統(tǒng)中血管緊張素的相應(yīng)受體（AT1R），本研究進(jìn)一步用免疫組化法和RT-PCR法分別檢測AT1R在蛋白和mRNA水平的表達(dá)，進(jìn)一步闡明RAS系統(tǒng)在鹽敏感性高血壓中的作用。分析結(jié)果顯示，CAPHS組大鼠的心肌、腎臟組織AT1R的表達(dá)與CONNS組比較差異均有顯著性（P＜0.01），提示血壓明顯升高，AT1R的表達(dá)顯著增多。結(jié)果與黃建寨等［18］在SHR（自發(fā)性高血壓）和RHR（腎性高血壓）大鼠所作結(jié)果基本一致。CON-HS組心肌AT1R mRNA表達(dá)較腎臟更為顯著，出現(xiàn)此結(jié)果的原因可能與左心室肥厚有關(guān)［19］。以上說明，感覺神經(jīng)損傷性鹽敏感性高血壓大鼠心肌和腎臟組織中存在AT1R mRNA和蛋白的高表達(dá)，AT1R mRNA和蛋白的高表達(dá)與大鼠血壓有一定的相關(guān)性。對于探討鹽敏感性高血壓發(fā)病機(jī)制，以及臨床使用AT1R拮抗劑防治高血壓及其所帶來的危害有一定的臨床意義。至于AT1R蛋白和mRNA在其他組織中的表達(dá)情況，例如血管、腦等與高血壓密切相關(guān)的器官中是否有同樣結(jié)果或差異，將進(jìn)一步研究。

［1］盧荔紅，陳慧，駱杰偉，等.a-adducin基因與鹽敏感性高血壓、腎損害的相關(guān)性［J］.中國分子心臟病學(xué)雜志2007，7（2）：66-71

［2］Luft FC，Grim CE，Willis LR，et al.Natriuretic response to saline infusion in normotensive and hypertensive man.The role of renin suppression in exaggerated natriuresis［J］.Circulation，1977，55（5）：779-784.

［3］Beeks E，Kesseis AG，Kroon AA，et al.Genetic predisposition to salt-sensitivity：a systematic review［J］.Hypertetions，2004，22（7）：1243-1249.

［4］Hurwitz S，F(xiàn)isher ND，F(xiàn)erri C，et al.Controlled analysis of blood pressure sensitivity to sodium intake：interactions with hypertention tpye［J］.Hypertens，2003，21（5）：951-959.

［5］Weinberger MH.Sodium and blood pressure 2003［J］.Curr Opin Cardiol，2004，19（4）：353-356.

［6］王曼，牟建軍，陳恩讓，等.血壓鹽敏感性及相關(guān)因素家庭聚集性分析［J］.中國公共衛(wèi)生，2007，23（1）：38-39.

［7］王東，蔣湘蓮，聶亞雄.高血壓大鼠模型的研究進(jìn)展［J］.中國動(dòng)脈硬化雜志，2006，14（3）：271-273.

［8］Wang DH，Li JP，Qiu JX.Salt-sensitive hypertension induced by sensory denervation：introduction of a new model［J］.Hypertension，1998，32：649-653.

［9］He L，Qi Y，Rong X，et al.The Ayurvedic medicine Salacia oblonga attenuates diabetic renal fibrosis in rats：suppression of angiotensinⅡ/AT1 signaling［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2009，Aug 25（Epub ahead of print）

［10］鄭紅霞，羅兵.AT1R基因與人類疾病的相關(guān)性研究［J］.中國實(shí)用醫(yī)藥，2007，2（5）：91-92

［11］Regitz-Zagrosek V，Neuss M，Holzmeister J，et al.Molecular biology of angiotensin receptor and their role in human cardiovascular disease［J］.Mol Med，1996，74（5）：233-251.

［12］Leclerc PC，ProulxCD，Arguin G，etal.Ascorbicacid decreases the binding affinity of the AT1 receptor for angiotensinⅡ［J］.Am J Hypert，2008，21（1）：67-71.

［13］Griendling KK，Ushio-Fukai M，Lassegue B，et al.Angiotensin signaling in vascular smooth muscle［J］.Hypertension，1997，29（1 pt 2）：366-373.

［14］Schieffer B，Paxton WG，Marrero MB，et al.Importance of tyrosine phosphorylation in angiotensin Ⅱ type 1 receptor signaling［J］.Hypertention，1996，27（3 pt 2）：476-480.

［15］Mueller CF，Wassmann K，BergerA，etal.Differential phosphorylation of calreticulin affects AT1 receptormRNA stability in VSMC［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，370（4）：669-674.

［16］Mueller CF，Berger A，Zimmer S，et al.The heterogenous nuclear riboprotein S1-1 regulates AT1 receptor gene expression via transcriptional and posttranscriptional mechanisms［J］.Arch Biochem Biophys，2009，488（1）：76-82.

［17］崔慧慧，李莉，楊建一，等.感覺神經(jīng)損傷性鹽敏感性大鼠心腎ACE和ACE2的表達(dá)［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2010，20（8）：38-43.

［18］黃建寨，魏立，王曉軍，等.高血壓大鼠心肌腎素-血管緊張素系統(tǒng)的日變化［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)雜志，2006，11（8）：863-867.

［19］李媛，李莉，崔慧慧，等.感覺神經(jīng)損傷性鹽敏感性大鼠左心室肥厚與血壓的關(guān)系［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（11）：38-41.