鮑琳琳，占玲俊，鄧 巍，許黎黎，朱 華，呂 琦，李楓棣，秦 川

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

流感病毒具高傳染性，且每年在很多國家都會造成區(qū)域性的流行。20世紀(jì)曾發(fā)生過4～5次世界大流行（pandemics），每次間隔9～39年；其中以1918～1919年期間，H1N1流感病毒造成4 500萬人的死亡最為嚴(yán)重［1］。自1933年以來甲型病毒已經(jīng)歷了4次抗原轉(zhuǎn)變：1933～1946年為H0N1（原甲型，A0），1946～1957年為H1N1（亞甲型，A1），1957～1968年為H2N2（亞洲甲型，A2），1968年以后為H3N2（香港型，A3）。2009年8月，根據(jù)香港最近的流感病毒分析，甲型H1N1流感占49％，H3占43％，顯示兩種病毒已成主流。甲型H3病毒在香港相當(dāng)普遍，2008年主要是Brisbane型，2009年出現(xiàn)的甲型H3流感病毒與Brisbane型不同，出現(xiàn)基因漂移情況，但應(yīng)是源自Brisbane型的變種。2009年8月，據(jù)報道，香港已出現(xiàn)3宗因H3流感的死亡個案。所以，在系統(tǒng)研究流感，預(yù)防和治療流感任重而道遠(yuǎn)。

研究流感過程中重要環(huán)節(jié)就是動物試驗(yàn)，因此流感病毒感染動物模型的合理建立顯得尤為重要。雪貂是目前為止最為敏感的流感病毒感染動物模型，本研究應(yīng)用雪貂建立H3流感動物模型，從臨床癥狀到實(shí)驗(yàn)室檢測多個方面系統(tǒng)的評價雪貂感染后的變化，為研究H3流感病毒發(fā)病機(jī)制評價藥物和疫苗奠定基礎(chǔ)［2，5］。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 毒株：H3N2病毒株為A/Brisbane/10/07，其HA效價都為1：256，107TCID50/mL，由香港大學(xué)陳鴻霖教授惠贈。

1.1.2 動物：由美國引進(jìn)去勢雪貂（Mustela Pulourius Furo）6只，4～10月齡，500～1 200g。實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行血清學(xué)檢查，HI方法檢測H1N1，H3N2抗體，抗體陰性為合格雪貂方可入組實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 試劑：RNA提取試劑盒RNeasy Mini Kit購自Qiagen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScriptⅢ First-Strand Synthesis System購自Invitrogen公司，熒光染料Power SYBR green PCR master mix，48孔0.2ml PCR反應(yīng)管fast optical 48-well RXN plate，及光學(xué)反應(yīng)蓋膜48-well optical adhesive film 25PK均購自ABI公司，實(shí)時熒光定量PCR儀為ABI公司StepOne系列產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 雪貂的感染性：實(shí)驗(yàn)在本所的BSL-2實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。將6只雪貂隨機(jī)分為2個組，每個滴度3只，每籠1只。將雪貂采用獸用氯胺酮輕度麻醉，將流感A/Brisbane/10/07病毒株分別以106TCID50和107TCID50滴鼻感染，每只雪貂鼻孔內(nèi)均勻滴入500μL病毒液。獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具中正常飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)的觀察期為5d。

1.2.2 皮下芯片植入：實(shí)驗(yàn)開始前2周，雪貂采用獸用氯胺酮輕度麻醉后，皮下植入芯片，通過芯片錄入實(shí)驗(yàn)動物編號，每日讀取動物體溫數(shù)值。

1.2.3 臨床觀察和取樣：實(shí)驗(yàn)開始前1周每日記錄雪貂體溫及體重變化作為感染前背景資料。感染后每天記錄體溫、體重變化、觀察并記錄有無咳嗽、流涕、嘔吐、腹瀉、氣促、呼吸困難、明顯食欲缺乏等臨床表現(xiàn)。感染前0天，感染后第1～5天取鼻甲骨活檢物測定病毒載量和病毒滴度。感染后第5天安樂處死動物，取動物肺、肝、脾、肺、小腸、腦組織測定病毒滴度，做病理檢查。

1.2.4 病毒滴度的測定：雪貂取肺、肝、脾、小腸、腦組織放入1mL DMEM（青霉素、鏈霉素各1 000IU/mL）液中，用勻漿器將組織研磨成乳劑，3 000r/min離心10min，取上清液。組織上清液10×連續(xù)稀釋至10-8，接種于單層培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個稀釋度接種4個重復(fù)孔，CO2培養(yǎng)箱中35℃靜止培養(yǎng)，觀察記錄各孔細(xì)胞病變（CPE）情況，連續(xù)觀察3d，用1％火雞血球復(fù)檢，出現(xiàn)凝集反應(yīng)的結(jié)果為陽性［3］。按照Reed-Muench方法計算感染雪貂臟器病毒的TCID50。

1.2.5 病理學(xué)檢查：大體觀察，處死動物后，詳細(xì)觀察肺、腸組織的形態(tài)變化；病理切片制備，取處死動物的肺、腸組織，10％甲醛液固定，石蠟包埋，常規(guī)病理組織切片處理后，HE方法染色，鏡檢觀察。

1.2.6 PCR檢測：鼻甲骨活檢物可以直接應(yīng)用試劑盒RNeasymini kit（Qiagen）提取RNA。鼻甲骨活檢物溶于1mL DMEM培養(yǎng)基中，RNA最終濃度溶入無RNA酶的水中，20mg肺組織總RNA提取物定容于30 μL無RNA酶的水中?？俁NA中取8μL RNA應(yīng)用SuperScriptⅢ reverse transcriptase（Invitrogen）逆轉(zhuǎn)錄。取cDNA2μL應(yīng)用Power SYBR green PCR master mix（ABI）作定量PCR。引物：BR-10F 5’-gagaatccagcacacaagag-3’，BR-10R 5’-ttctcagttcaagagtgctc-3’。程序：①94℃，3min；②94℃，30s，③61℃，30s，④72℃，30s（②-④運(yùn)行35個循環(huán)），⑤95℃，15s；⑥60℃，1min；此后運(yùn)行溶解曲線程序，95℃，15s，60℃，1min；95℃，15s。熒光定量PCR儀可直接讀取病毒載量結(jié)果。

表1 雪貂感染H3N2后體重變化Tab.1 Changes of the body weight of ferrets infected with H3N2 influenza virus

2 結(jié)果

2.1 雪貂感染后體重變化

雪貂感染后出現(xiàn)體重下降，106TCID50組由感染后第1天一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，107TCID50組在感染后第1天呈現(xiàn)體重下降，在感染后第4天到實(shí)驗(yàn)結(jié)束體重開始回升，體重變化見表1。雪貂感染后體重變化率見圖1。

圖1 雪貂感染H3N2后體重變化率（％）Fig.1 Changes of the body weight of ferrets infected with H3N2 influenza virus（％）

2.2 雪貂感染H3N2后體溫變化

雪貂感染H3N2后出現(xiàn)體溫升高，106TCID50組在感染后第2天、第3天出現(xiàn)體溫升高，107TCID50組在感染后第2天出現(xiàn)體溫一過性升高，體溫變化見圖2。

2.3 雪貂感染后臨床表現(xiàn)

圖2 雪貂感染H3N2后體溫變化℃Fig.2 Changes of the temperature of ferrets infected with H3N2 influenza virus

表2 雪貂感染H3N2后臨床評分標(biāo)準(zhǔn)：Tab.2 Criteria for clinical sign scores in the ferrets after H3N2 influenza virus infection

圖3 雪貂感染后臨床表現(xiàn)評分（分）Fig.3 Scores of clinical signs of the ferrets infected with H3N2 influenza virus

雪貂感染H3N2后的表現(xiàn)臨床評分標(biāo)準(zhǔn)：NIH提供的雪貂感染實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)分為鼻部癥狀和活動度兩個部分，具體指標(biāo)見表2。2組感染的雪貂臨床變化相似，雪貂在感染后1d出現(xiàn)癥狀，主要表現(xiàn)為流涕、打噴嚏等上呼吸道感染的表現(xiàn)，伴有一定程度的活動度下降。雪貂感染后臨床變化情況見圖3。

2.4 感染雪貂病理變化結(jié)果

感染5d后，雪貂安樂死解剖，大體觀察到肺組織背側(cè)面和腹側(cè)面有散在點(diǎn)狀出血灶，其他組織未見異常。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)以肺組織輕度間質(zhì)性肺炎為主要表現(xiàn)，肺組織肺靜脈及肺泡壁毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張充血，部分肺靜脈壁及周圍組織明顯水腫，局部支氣管及肺泡上皮細(xì)胞壞死、脫落，肺泡腔內(nèi)可見滲出和漏出的紅細(xì)胞、水腫液、炎細(xì)胞及壞死脫落的上皮細(xì)胞碎屑。其他組織未見明顯異常（圖4，見封二）。106TCID50組與107TCID50組肺組織病變差異沒有顯著性。

2.5 感染雪貂病毒的復(fù)制及釋放

雪貂感染后，每天取鼻甲骨活檢物做病毒滴度測定，結(jié)果顯示106TCID50組雪貂在感染后第2天就可以檢測到病毒，滴度為102.1TCID50，一直到感染后第4天可以檢測到病毒，而且觀察到鼻甲骨活檢物的病毒檢測呈現(xiàn)下降的趨勢。107TCID50組雪貂在感染后鼻甲骨活檢物沒有檢測到病毒，結(jié)果見表3。以上的結(jié)果說明H3N2病毒感染雪貂后，出現(xiàn)上呼吸道排毒的現(xiàn)象，而且病毒的復(fù)制和釋放隨著感染的天數(shù)呈現(xiàn)下降的趨勢。從另外一方面來看，2個滴度的病毒感染雪貂后，上呼吸道排毒的現(xiàn)象結(jié)果不一致在一定程度上顯示106TCID50是一個感染雪貂比較合適的劑量。

雪貂在感染后第5天安樂處死，取雪貂肝、脾、肺、小腸、腦組織做病毒滴度測定。結(jié)果顯示肝、脾、肺、腦組織都未分到病毒，106TCID50組雪貂小腸組織的病毒在101.8～102.3TCID50之間，106TCID50組在101.8TCID50（表4）。以上的結(jié)果反映了H3N2病毒感染雪貂是主要以上呼吸道受到病毒感染為主，肺組織受到病毒感染的程度比較低。腸道組織的高病毒滴度從一定程度可以說明H3N2病毒株可以感染呼吸道以外的組織臟器，并在其中復(fù)制釋放。

雪貂感染后，每天取鼻甲骨活檢物做病毒載量測定，結(jié)果顯示2個滴度組雪貂在感染后第1天至感染后第5天，上呼吸道排毒都呈下降趨勢，見圖5。從106TCID50組和107TCID50組雪貂鼻甲骨的病毒載量測定結(jié)果來看沒有差異。

3 討論

利用小鼠模型能夠進(jìn)行流感病毒感染、免疫和抗流感病毒藥物作用等方面的研究。小鼠作為流感的動物模型會表現(xiàn)為較重的下呼吸道感染的癥狀（間質(zhì)性肺炎），有一些人際感染的流感病毒在小鼠身上并不能復(fù)制，需要經(jīng)過多代的適應(yīng)建立相應(yīng)的鼠肺適應(yīng)株才能夠感染小鼠。雪貂是目前比較公認(rèn)的流感適合的動物模型，A型和B型流感病毒都可在雪貂上直接感染不需要經(jīng)過傳代適應(yīng)。雪貂的解剖結(jié)構(gòu)分為上下氣室，有利于研究流感病毒對不同氣室的感染。

表3 雪貂感染后鼻甲骨活檢物病毒培養(yǎng)滴度情況（log10TCID50）Tab.3 Virus detection and titration in samples from nasal cavity（virus titer was expressed in log10TCID50）

表4 雪貂感染后組織病毒培養(yǎng)滴度情況（log10TCID50）Tab.4 Virus culture from tissues of ferrets（log10 TCID50）

圖5 雪貂鼻中病毒載量變化Fig.5 Virus loading from nose of infected ferrets

本次實(shí)驗(yàn)中雪貂感染H3N2病毒后出現(xiàn)明顯的上呼吸道感染的癥狀，例如體重下降，體溫升高，活動度下降，流涕，打噴嚏等，這與人感染季節(jié)性流感病毒后的癥狀是相似的，雪貂感染后肺部病理改變是散在的點(diǎn)狀病灶［4，6］。本試驗(yàn)應(yīng)用的病毒株是A/Brisbane/10/07，病毒感染雪貂后，病毒分離結(jié)果顯示，106TCID50組雪貂鼻甲骨活檢物在第1天至第4天都可以分離到活病毒，這個結(jié)果反映了雪貂感染后出現(xiàn)了持續(xù)的上呼吸道排毒，并且病毒的排出呈現(xiàn)下降趨勢，鼻甲骨活檢物病毒載量的結(jié)果也與這一結(jié)果相吻合。107TCID50的A/Brisbane/10/07病毒株感染雪貂后，病毒分離的結(jié)果沒有顯示出上呼吸道排毒現(xiàn)象，病毒載量的結(jié)果與A/HK/43358/09感染的結(jié)果相似，呈現(xiàn)出病毒載量逐天下降的趨勢（結(jié)果未顯示）。這表明A/HK/43358/09病毒株的感染力較弱，相比較而言A/Brisbane/10/07更適于建立雪貂感染H3N2動物模型。A/Brisbane/10/07病毒株感染雪貂后，解剖大體檢查發(fā)現(xiàn)肺組織上、中、下肺葉背側(cè)面和腹側(cè)面有散在點(diǎn)狀暗紅色出血灶，鏡下可見肺毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張充血，周圍有水腫，局部支氣管及肺泡上皮細(xì)胞壞死、脫落，肺泡腔內(nèi)可見大量滲出和漏出的紅細(xì)胞、水腫液、炎細(xì)胞及壞死脫落的上皮細(xì)胞碎屑［7］。總結(jié)幾方面的結(jié)果發(fā)現(xiàn)106TCID50組雪貂的臨床癥狀和病毒分離結(jié)果較107TCID50組更明顯，106TCID50的病毒滴度更適用于建立感染雪貂模型。

季節(jié)性流感H3N2病毒是A型流感病毒中比較溫和的病毒株，難以感染小鼠，建立小鼠感染動物模型通常需要建立鼠肺適應(yīng)株［8］。對于H3N2病毒感染機(jī)制的研究，藥物、疫苗評價需要合適的動物模型，本次試驗(yàn)的結(jié)果說明雪貂感染的動物模型在臨床表現(xiàn)、病毒復(fù)制情況以及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果幾方面都與人感染流感后結(jié)果相似，為H3N2流感病毒研究提供了一個研究平臺。

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