李明岳，鮑世韻，劉嘉林，鄭錦鋒，林寶行，余小舫

（暨南大學第二臨床醫(yī)學深圳市人民院，深圳 518020）

組蛋白在翻譯后的修飾中會發(fā)生改變，從而提供一種識別的標志，為其它蛋白與DNA的結合產(chǎn)生協(xié)同或拮抗效應，是一種動態(tài)轉錄調控成分［1］。染色質免疫共沉淀-實時定量PCR法（chromatin immunoprecipitation-real time quantitative PCR methods，CHIP-PCR）技術可以檢測特定DNA序列染色質的結構，能夠充分反映生理條件下的DNA與蛋白質相互作用的真實情況［2］。MafA基因又稱亮氨酸拉鏈蛋白Maf家族A（v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family protein A，MafA），是一個關鍵的基因特異性表達的調節(jié)器，對于胰腺生長和β細胞的分化及β細胞正常功能的維持起重要作用［3］。本研究采用CHIP-PCR技術比較小鼠胚胎干細胞（mouse embryonic stem cell，mES）、NIH小鼠成纖維細胞（NIH 3T3）和小鼠胰島素瘤β細胞（NIT-1）之間MafA基因轉錄起始區(qū)的組蛋白修飾變化，以管家基因MLH1為對照，探討組蛋白修飾對MafA基因轉錄表達的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

（1）129/J小鼠胚胎干細胞（40 XY）和γ射線照射處理的第3代昆明小鼠胚胎成纖維細胞由賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司提供。小鼠成纖維細胞株NIH3T3細胞和小鼠β細胞株NIT-1細胞由中山醫(yī)科大學動物實驗中心細胞庫提供，上述兩細胞均來自美國ATCC細胞庫；（2）組蛋白H3K4三甲基化（histone 3 lysine 4 trimethylation，H3K4m3）抗體（Abcam）、組蛋白H3K9三甲基化（histone 3 lysine 9 trimethylation，H3K9m3）抗體（Abcam）、組蛋白H3乙?；贵w（Upstate）、抗小鼠Ig-G磁珠（BioLabs）；（3）超聲儀器Bioruptor（Diagenode）、Nanodrop（Agilent）、TaKaRa PCR Thermal Cycler（寶生生物工程有限公司）、ABI 7700 Realtime PCR儀（ABI）；（4）引物設計軟件：Primer 5.0。

1.2 細胞的準備

1.2.1 mES細胞的培養(yǎng)：預先準備由明膠包被的六孔板培養(yǎng)器皿，飼養(yǎng)層細胞是經(jīng)γ射線照射處理的第3代昆明小鼠胚胎成纖維細胞。加入解凍后的mES細胞懸液和129/J小鼠胚胎干細胞完全培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2、80％相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。復蘇后的第2天換用DMEM完全培養(yǎng)液，定期更換培養(yǎng)液，當mES細胞克隆較大或克隆間出現(xiàn)融合時，予傳代。培養(yǎng)時間為2周。

1.2.2 NIT-1細胞的培養(yǎng)：將解凍后細胞懸液移入培養(yǎng)器皿中，加入足量的DMEM完全培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2、80％相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。復蘇后第2天更換培養(yǎng)液，待細胞長滿培養(yǎng)器皿80％后進行傳代。培養(yǎng)時間為2周。

1.2.3 NIH 3T3細胞的培養(yǎng)：方法同NIT-1細胞。

1.3 實驗方法

1.3.1 CHIP-PCR技術檢測組蛋白修飾

CHIP-PCR技術是研究蛋白與DNA之間在染色質環(huán)境下相互作用的一種常用方法，用于檢測每個候選靶基因的啟動子區(qū)域是否存在能與組蛋白及特定轉錄因子結合的特定DNA序列。一般有兩種方法，一種是使用標準微球菌核酸酶來消化細胞核；另一種是在細胞中加入甲醛或將細胞暴露在紫外射線使得染色質發(fā)生交聯(lián)。接著用超聲波將染色質切成300bp到1000bp之間的小片段，然后加入組蛋白修飾抗體以及偶聯(lián)Ⅱ抗磁珠進行孵育反應，利用磁鐵的吸引力將組蛋白修飾的DNA片段從待測樣品分離出來，采用酚-氯仿法純化DNA片段。最后用定量PCR法擴增DNA片段，其擴增產(chǎn)物的量即可反映該啟動子區(qū)中組蛋白修飾水平。

1.3.1.1 組蛋白修飾檢測樣本的制備：將3種細胞（1×107個細胞/瓶）分別用胰酶消化，用Bioruptor進行超聲處理后于2％瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖1。將斷裂后的DNA片段分成兩份，一份進行免疫共沉淀反應，一份作為input對照（不做任何處理直接進行PCR反應）。在第一份DNA樣品中其余依次加入組蛋白H3K4m3抗體（或組蛋白H3K9m3抗體，或組蛋白H3乙?；贵w）、G蛋白磁珠、抗小鼠IgG磁珠（磁珠偶聯(lián)Ⅱ抗），孵育后，緩沖液洗滌，去除未結合的DNA片段，蛋白酶K消化抗體，用酚-氯仿溶液進行DNA純化后，Nanodrop測DNA濃度。

圖1 DNA超聲處理后電泳圖Fig.1 DNA after ultrasonic treatment Electrophoresis

1.3.1.2 實時熒光定量聚合酶聯(lián)反應擴增目的基因啟動子區(qū)：將3種細胞純化的DNA進行實時定量PCR。采用ABI 7700 Realtime PCR儀對免疫沉淀中MafA基因和MLH1基因的DNA、input control和陰性對照進行擴增。測定標準曲線和熔解曲線，確保擴增的準確性和專一性，用Ct值表示樣品中模板的相對含量，數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進行分析。引物設計如下：MafA（mm9_cpgIslandExt_CpG：187.chr15：75576482-75578594.長度185bp）：5′-CCTTGTACAGGTCCCGCTC-3′，5′-GGAGGTCATCC GACTGAAAC-3′；MLH1（mm9_cpgIslandExt_CpG：117.chr9：11117496 4-111175156.長度193bp）：5′-TTAACCGAGCCAGGGACTTT-3′，5′-GCTTCCAG AATTGCCGACAT-3′。所有基因PCR程序一致，均如下：95℃、10min，40個PCR循環(huán)（95℃、15s，60℃、60s，收集熒光）。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴增反應結束后，95℃、2min，60℃、20s，99℃、10s，并從60℃緩慢加熱到99℃，退火溫度59℃。實驗重復3次。

1.3.2 實時定量逆轉錄PCR：檢測3種細胞MafA和MLH1基因的表達水平。Trizol抽提RNA，鑒定RNA純度及定量后，RNA逆轉錄成cDNA。以GAPDH基因作為內參。設計引物序列如下：MafA：5′-AAAGCGGTGCTGGAGGAT-3′，5′-GGTTCAGGTG GTGCTGGTA-3′；MLH1：5′-GC GGTTAGTCGAGAAC TGATA-3′，5′-AGTGAACTTCGTGCTTGGTG-3′；GAP DH：5′-GTCCAT GCCATCACTGCCAC-3′，5′-ATGA CCTTGCCCACAGCCTT-3′。熒光定量PCR反應體系及擴增條件與前相同。測定標準曲線和熔解曲線，確保擴增的準確性和專一性，用Ct值表示樣品中模板的相對含量，數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進行分析。實驗重復3次。

1.3.3 統(tǒng)計學分析：數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS軟件13.0統(tǒng)計，采用單因素方差分析，兩兩比較則用t檢驗，進行相關分析。

2 結果

2.1 組蛋白修飾的檢測結果

用染色質免疫共沉淀法檢測3種細胞中基因的組蛋白修飾的狀況。以mES細胞為參照，結果提示：NIT-1細胞中MafA基因轉錄起始區(qū)的H3乙?；虷3K4m3修飾水平明顯增高（P＜0.05），H3K9m3修飾水平明顯降低（P＜0.05）；基因MLH1轉錄起始區(qū)的H3乙?；揎椝浇档投鳫3K4m3修飾水平增高，但無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在NIH 3T3細胞中，MafA基因轉錄起始區(qū)的H3乙?；虷3K9m3修飾水平明顯增高（P＜0.05），H3K4m3修飾水平明顯降低（F=0.277，P=0.013）；管家基因MLH1轉錄起始區(qū)的H3K9m3修飾水平增高（P＜0.05）（表1）。

表1 基因在不同細胞中組蛋白修飾的比較（±s，n=3）Tab.1 Gene histone modifications in different cells comparisons（±s，n=3）

表1 基因在不同細胞中組蛋白修飾的比較（±s，n=3）Tab.1 Gene histone modifications in different cells comparisons（±s，n=3）

注：a.P＜0.05與NIT-1細胞比較；b.P＜0.05與NIH3T3細胞比較Note：a.P＜0.05 vs NIT-1 cell.b.P＜0.05 vs NIH3T3 cell

組蛋白修飾 基因 小鼠胚胎干細胞 NIT-1細胞 NIH3T3細胞Histone modification Genes mES cell NIT-1 cell NIH3T3 cell H3乙?；揎椝剑ǎィ?MafA 0.42±0.02a b 1.10±0.07 0.93±0.17 Levels of H3 acetylation acetylation modification（％） MLH1 2.47±0.35 1.91±0.29 1.69±0.19 H3K4m3修飾水平（％） MafA 1.69±0.14a，b 10.64±0.87 0.94±0.10 Levels of H3K4m3 modification（％） MLH1 8.37±0.49 12.91±1.63 7.87±1.41 H3K9m3修飾水平（％） MafA 0.17±0.003a.b 0.03±0.005 0.39±0.06 Levels of H3K9m3 modification（％） MLH1 0.66±0.06b 0.48±0.08 2.36±0.43

2.2 基因mRNA的表達水平

實時定量逆轉錄PCR檢測基因表達，MafA在NIT-1細胞表達，而在NIH 3T3和mES細胞基本不表達，前者與后兩者存在統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。MLH1在3種細胞均表達，3者之間的表達水平無統(tǒng)計學差異（表2）。

表2 基因在不同細胞中mRNA表達水平比較（±s，n=3）Tab.2 mRNA expression level of gene in different cells comparisons（±s，n=3）

表2 基因在不同細胞中mRNA表達水平比較（±s，n=3）Tab.2 mRNA expression level of gene in different cells comparisons（±s，n=3）

注：★P＜0.05 3者之間存在統(tǒng)計學差異Note：★P＜0.05 statistical differences among three type cells

基因 小鼠胚胎干細胞 NIT-1細胞 NIH3T3細胞Genes mES cell NIT-1 cell NIH3T3 cell MafA 4.89E-05±0.24E-05 4.72E-03±0.17E-03★1.15E-04±0.19E-04 MLH1 1.10E-03±0.22E-03 1.21E-03±0.27E-03 0.97E-03±0.25E-03

2.3 相關分析

對基因的組蛋白修飾和基因表達進行相關分析。結果表明，MafA基因的表達與H3K4m3修飾存在直線相關（相關系數(shù)0.995，P＜0.01）；與H3K9m3修飾存在直線負相關（相關系數(shù)-0.751，P＜0.05），與H3乙?；揎棢o相關性。管家基因MLH1的表達與所檢測的組蛋白修飾無相關性。

3 討論

NIT-1細胞來源于NOD小鼠，是由SV40和大鼠胰島素基因的啟動子經(jīng)轉基因方式產(chǎn)生永生化的β細胞系，具有與正常β細胞相似的基因表型，在葡萄糖的刺激下能夠分泌胰島素［4］。由于大量高純度的β細胞在獲取上存在困難，本實驗采用NIT-1細胞代替正常β細胞作為研究對象。

組蛋白修飾是表觀遺傳學的重要組成部分，可在基因的DNA序列不發(fā)生改變時，使特異性基因的表達發(fā)生改變，并且這種改變還能通過有絲分裂和減數(shù)分裂進行遺傳［5］。在機體中，細胞基本生命活動所必需的管家基因可在各個細胞中表達；特異性基因MafA雖存在于所有的細胞，隨著胰腺的發(fā)育，其表達最終僅局限在β細胞［6］，提示組蛋白修飾可能參與其中的調控。

組蛋白有多種共價修飾方式，其中H3乙?；3K4m3和H3K9m3是修飾基因轉錄調控的重要機制［7］。H3乙酰化修飾使DNA與組蛋白間的靜電引力和空間位阻增大，兩者間的相互作用減弱，DNA易于解聚，染色質呈轉錄活性結構，進而激活基因轉錄。H3K4m3使組蛋白和DNA的結構由緊變松，靶基因才能和轉錄復合物相互作用，基因得以轉錄。H3K9m3能使組蛋白形成一個異染色質蛋白HP1（heterochromatin protein 1）或其他抑制性染色質因子的結合位點，HP1的結合進而會導致DNA分子上特定CpG島的甲基化和穩(wěn)定的基因沉默。不同組蛋白修飾可依次發(fā)揮作用或組合在一起，形成一個修飾的級聯(lián)，它們通過協(xié)同或拮抗來共同發(fā)揮作用［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，MafA基因在mES、NIT-1和NIH 3T3三種細胞中的差異表達與H3K9m3修飾存在直線負相關；與H3K4m3修飾存在直線相關。MafA基因的表達與H3乙酰化修飾無相關性，這可能跟H3K9m3和H3乙?；揎梼烧唛g存在競爭性有關［9］。而MLH1基因的表達與組蛋白修飾不存在相關性。結果表明，H3K9m3與H3K4m3修飾能協(xié)同作用于MafA基因轉錄起始區(qū)，調控其表達。

MafA基因的表達可在β細胞分化的最后階段檢測到，其除了與Pdx-1和BE-TA2一起協(xié)同刺激胰島素基因表達［10］，還參與Pdx-1基因的表達調控，，是一個關鍵的基因特異性表達的調節(jié)器［11］。Zhao等［12］發(fā)現(xiàn)MafA基因敲除小鼠出生時的胰島在形態(tài)學上是正常的，但隨著年齡的增長，小鼠表現(xiàn)為葡萄糖刺激胰島素分泌受損和胰島組織結構的異常?？梢?，MafA基因與β細胞的分化密切相關。在胚胎干細胞分化過程中，隨著轉錄起始區(qū)H3K9m3與H3K4m3修飾水平的改變，MafA基因選擇性轉錄，胚胎干細胞能向β細胞定向分化；當MafA基因選擇性失活時，胚胎干細胞則失去向β細胞定向分化的能力。因而，在胚胎干細胞向β細胞分化過程中，MafA基因的H3K4m3與H3K9m3修飾調控機制具有重要的作用。

綜上所述，H3K4m3與H3K9m3修飾能相互協(xié)調，共同調控MafA基因的表達，對胚胎干細胞向β細胞分化具有重要的意義。

［1］SternerDE，Berger SL.Acetylation of histones and transcription related factors［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2000，64（2）：435-45

［2］Kuras L.Charaeterization of protein-DNA associationin vivoby chromatinimmunoprecipitation.［J］.Methods Mol Bio，2004， 284：147-162.

［3］Coolen M，Sii-Felice K，Bronchain O，et al.Phylogenomic analysis and expression pattern of large Maf genes inXenopus tropicalisprovide new insights into the functional evolution of the gene family in osteichthyans.［J］.Dev Genes Evol，2005，215（7）：327-329.

［4］Hamaguchi K，GaskinsHR，LeiterEH，etal.NIT-1，a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/L tmouse［J］.Diabetes，1991，40（7）：842-849.

［5］Peterson CL，Laniel MA.Histones and histone modifications［J］.Curr Biol，2004，14（14）：546-551.

［6］Matsuoka TA，ArtnerI，HendersonE，etal.TheMafA transcription factor appears to be responsible for tissuespecific expression of insulin.［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（9）：2930-2933.

［7］Jenuwein T，Allis CD.Translating the histone code［J］.Science，2001，293（5532）：1074-1080.

［8］Strahl BD，Allis CD.The language of covalent histone modifications［J］.Nature，2000，403（6765）：41-45.

［9］Litt MD，Simpson M，Gaszner M，et al.Correlation between histone lysine methylation and developmental changes at the chicken beta-globin locus［J］.Science，2001，293（5539）：2453-2455.

［10］Aramata S，Han SI，Yasuda K，et al.Synergistic activation of the insulin gene promoter by the β cell enriched transcription factors MafA，Beta2，and Pdx1［J］.Biochim Biophys Acta，2005，1730：41-46.

［11］Samaras SE，Zhao L，Means A，et al.The islet beta cellenriched RIPE3b1/Maftranscription factorregulates pdx-1 expression［J］.Biol Chem，2003，278：12263-12270.

［12］Zhao L，Gao M，Matsuoka TA，et al.The islet beta cellenriched MafA cativator is a key regulator of insulin gene transcription［J］.JBiolChem，2005，280（12）：11887-11894.