李萌萌 劉曉丹 曹夢瑤 張肖雅 劉華晶

東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院 黑龍江省 哈爾濱市 150030

DNA分子標記在食用菌研究中的應用

李萌萌 劉曉丹 曹夢瑤 張肖雅 劉華晶

東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院 黑龍江省 哈爾濱市 150030

隨著分子生物學的發(fā)展，越來越多的DNA分子標記技術不斷涌現(xiàn)并應用于在食用菌遺傳育種、菌種和菌株鑒定、遺傳多樣性分析、基因定位和克隆等研究中。本文對DNA分子標記RAPD、SCAR、ISSR等方法的原理、特點和其在食用菌遺傳多樣性鑒定方面的研究進展進行了重點闡述。

分子標記技術是20世紀80年代發(fā)展起來的一類遺傳標記技術。分子標記是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳變異的直接反映。至今已經(jīng)發(fā)展了20多種基于DNA多態(tài)性的分子標記技術。這些DNA標記技術可綜合為4大類：一是以Southern雜交為基礎的標記技術，如RFLP；二是以PCR為基礎的標記技術，如RAPD、ISSR等；三是酶切和PCR相結合的標記技術，如AFLP、CAPS等；四是其他DNA分子標記，如SNP。與其他幾種遺傳標記相比，分子標記具有很多優(yōu)越性，如大多數(shù)分子標記是共顯性遺傳，對隱性的農(nóng)藝性狀的選擇十分便利；在生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標記分析；分子標記直接揭示來自DNA的變異。

1 RAPD(隨機擴增多態(tài)性)標記技術

RAPD技術是1990年由Williams和Welsh領導的兩個研究小組幾乎同時獨立發(fā)展起來的。它是建立在PCR基礎之上,使用一系列具有10個堿基的單鏈隨機引物，對整個基因組DNA進行PCR擴增以檢測多態(tài)性。由于不同引物擴增出的DNA片段不同，因此存在著大量的RAPD標記。由于整個基因組內存在眾多反向重復序列，因此需對每一隨機引物單獨進行PCR，單一引物結合在反向重復序列上，在其之間的區(qū)域內,若遺傳特性發(fā)生變化,經(jīng)PCR擴增后， 則導致一系列PCR產(chǎn)物表現(xiàn)差異性，由于使用一系列引物，幾乎整個基因組差異都會顯露出來，經(jīng)聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離后，通過EB染色或放射自顯影就可檢測出被擴增的DNA多態(tài)性。

目前對多種食用菌的生活史和遺傳背景還不十分清楚，這給食用菌遺傳研究工作帶來很大困難。以往菌株的親緣關系和食用菌遺傳資源受環(huán)境因素影響，往往難以對形態(tài)差異較小的種間和種內菌株加以鑒別，給雜交親本的選擇帶來很大困難。利用RAPD分子標記技術選擇親本可克服傳統(tǒng)方法的缺點，利用分子標記所揭示的多態(tài)性通過各種數(shù)量分析方法計算相似系數(shù)，進行聚類和排序分析，確立供試菌株的親緣關系或進行種內遺傳多樣性研究[1]。種質鑒定和雜交種的鑒別是育種研究工作中的一個關鍵問題。運用RAPD技術對融合子和親本進行聚類分析和相似系數(shù)分析,可以判斷原生質體融合是否成功,染色體是否發(fā)生交換。

2 ISSR (簡單重復序列間擴增)標記技術

ISSR是一種新型的分子標記，是1994年由zietkiewicz等創(chuàng)建的一種簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性分子標記。ISSR標記利用植物基因組中廣泛存在的簡單重復序列設計引物，引物由1～4bp組成的串聯(lián)重復序列和幾個非重復序列的錨定堿基組成，使引物與基因組DNA中SSR的5’或3’末端結合，對反向排列、間隔不太大的重復序列間基因組進行PCR擴增。ISSR標記具有如下特點:(1)直接利用SSR對基因組DNA進行PCR擴增,適用于任何物種。(2)符合孟德爾遺傳規(guī)律,多為顯性標記。(3)穩(wěn)定性和可重復性高。(4)引物具有通用性。ISSR標記結合了RAPD和SSR方法的優(yōu)點，具有模板用量少、多態(tài)性豐富、無需試劑盒等優(yōu)點,但多為顯性標記,不適于研究交配系統(tǒng)、計算雜合度和父系分析等問題。ISSR標記可廣泛應用于動植物種質鑒定、遺傳作圖和基因定位,尤其在分子遺傳學基礎貧乏的作物研究中顯示出極大的優(yōu)勢。梁宇采用ISSR標記對外生菌根菌隱花青鵝膏菌的居群遺傳結構進行了研究,分析結果表明,遺傳變異主要表現(xiàn)在同年生子實體內,隔年生子實體的變異情況也較明顯。此外，在其他如菊科作物中ISSR技術也被應用在種質資源鑒定[2]。

3 SCAR (特征性片段擴增區(qū)域)標記技術

1993年,PARAN I和MICHELMORE RW在RAPD標記基礎上提出了SCAR標記。該標記以特異RAPD片段序列為基礎,根據(jù)兩端序列設計1對18～24個堿基的引物，在較高的退火溫度下進行特異性擴增，實現(xiàn)由RAPD標記到SCAR標記的轉化。它直接采用專一性特異引物進行PCR擴增,排除了隨機引物結合位點之間的競爭，且避免了篩選引物、估算樣品間遺傳相似性和聚類分析等繁瑣過程,使穩(wěn)定性和重復性得以顯著提高。SCAR標記一般表現(xiàn)為擴增片斷的有無,適合于大量個體的快速檢測,便捷可靠；目前SCAR標記已被廣泛應用于許多重要農(nóng)林經(jīng)濟作物的種質鑒定、分子標記輔助育種、遺傳連鎖圖譜構建和基因定位等方面研究。SCAR標記需要根據(jù)目的片段的兩端序列設計引物,無法進行直接分析,一般是對RAPD或AFLP標記進行克隆、測序后轉換為SCAR標記。由于RAPD擴增過程中堿基并非嚴格匹配,錯配率較高，且一般RAPD標記片段同源性較高,從而導致SCAR標記的轉換成功率較低。在食用菌研究中,如果能獲得各個菌株的特異SCAR標記,不僅能對種質資源的遺傳多樣性進行系統(tǒng)地分析評估,可以從分子水平上進行偽劣菌種辨別。熊芳等為有效解決鮑魚菇市場菌種名稱異?；靵y的現(xiàn)象,對全國16株常用鮑魚菇栽培菌株進行SRAP-PCR、RAPD-PCR擴增,從電泳圖譜上選取特異片段,成功轉化成SCAR標記,通過構建的4對SCAR特異性引物,將這16株鮑魚菇菌株分為5類,有效地解決了鮑魚菇市場上常見的同種異名、同名異種現(xiàn)象[3]。

4 結語

對于食用菌種質群鑒定和多樣性評價,RAPD是一個簡單、經(jīng)濟、快捷的技術工具。RAPD分析便于繪制簡單的數(shù)量性狀圖譜,已經(jīng)被用于分析這些基因,鑒定與性狀相連鎖的分子標記； ISSR標記與RAPD等標記技術相比，具有更強的專一性、重復性和可操作性；SCAR標記技術因其具有穩(wěn)定性高、重復性好，成本低廉，操作簡單方便等特點，已經(jīng)廣泛應用于各種農(nóng)作物的品種鑒定、輔助選擇育種、基因定位等方面，在食用菌菌株鑒定中也開始受到重視。

總之，隨著分子標記技術的深入，更多的食用菌功能基因將被標記，更高密度、更為實用有效的遺傳連鎖圖譜將被建立，大量重要的基因將被定位、分離和克隆，這將為進一步培育高產(chǎn)、優(yōu)質、抗病、耐貯等新品種奠定良好的基礎。

[1]呂長武,呂杰,陳恒雷 等. RAPD分子標記在食用菌研究中的應用[J].中國生物工程雜志.2006, 26(1): 77~80

[2]曾麗,趙梁軍,孫佳 等.萬壽菊屬品種資源遺傳關系的ISSR分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學.2010,43(1):215-222

[3]熊芳, 鄭閩江, 劉新銳 等. 鮑魚菇種質資源SCAR標記的建立及其初步應用[J]. 中國農(nóng)學通報.2010,26

(11):330-335

東北農(nóng)業(yè)大學大學生科技創(chuàng)新基金，東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院青年基金

10.3969/j.issn.1001-8972.2011.02.029

李萌萌（19890206），女，東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院應用生物科學專業(yè)08級本科生；

劉華晶（19790212），女，東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院講師。

ISSR；SCAR；RAPD；食用菌