許修宏，孟 琦，劉華晶，李 亮

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大慶分院，黑龍江 大慶 161090）

黑木耳（Auricularia auricula）又稱木耳、細木耳、光木耳、云耳，分類上屬擔(dān)子菌綱，銀耳目，木耳科，木耳屬。它是我國主要栽培的食用菌之一[1]。

1972年荷蘭Vessels首次用裂解酶分離了褶皺菌原生質(zhì)體。原生質(zhì)體技術(shù)開始應(yīng)用于食用菌研究領(lǐng)域[2]。近年來，原生質(zhì)體技術(shù)取得了較大進展，而原生質(zhì)體的制備與再生是研究原生質(zhì)體融合及單核雜交技術(shù)的前提條件。本文研究了黑木耳菌絲分離原生質(zhì)體的主要酶解條件，再生條件及單核化，為以后培育新品種及基因工程研究等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

黑木耳菌株黑29由黑龍江省微生物所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g（煮汁），葡萄糖 20 g，蛋白胨 3 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 2 g加水至1 000 mL用于原生質(zhì)體前菌絲的培養(yǎng)。

液體再生培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g（煮汁），葡萄糖20 g，蛋白胨 3 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 2 g，酵母膏2 g，維生素B110 mg，甘露醇109.3 g加水至1 000 mL用于原生質(zhì)體孵育。

原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基：

RM1：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g；瓊脂20 g加水至1 000 mL；

RM2：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，蛋白胨3 g，MgSO4·7H2O 2 g，瓊脂 20 g加水至1 000 mL；

RM3：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，蛋白胨 3 g，MgSO4·7H2O 2 g，酵母膏 2 g，瓊脂20 g加水至1 000 mL；

RM4：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，蛋白胨3 g，MgSO4·7H2O 2 g，酵母膏2 g，維生素B110 mg，瓊脂20 g加水至1 000 mL；

RM5：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 2 g，酵母膏 2 g，維生素B110 mg，甘露醇109.3 g，瓊脂20 g加水至1 000 mL用于原生質(zhì)體再生；

PDA綜合培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，蛋白胨 3 g，MgSO4·7H2O 2 g，瓊脂20 g加水至1 000 mL。

1.1.3 酶制劑

溶壁酶由廣東微生物所提供。

1.1.4 試劑

KCl、MgSO4、蔗糖、甘露醇濃度：用 0.05 mol·L－1pH 5.8的磷酸鹽緩沖液配制；酶液：用0.05 mol·L－1pH 5.8的磷酸鹽緩沖液配制 0.6 mol·L－1MgSO4，然后用MgSO4溶液配置酶溶液。

1.2 方法

1.2.1 菌絲培養(yǎng)

將試管斜面菌絲塊接種于裝有150 mL PDA液體培養(yǎng)基三角瓶中，25℃搖床培養(yǎng)（121 r·min－1）7～11 d。

1.2.2 原生質(zhì)體的制備

無菌條件下收集黑29菌絲體，無菌水沖洗1次，用 0.6 mol·L－1MgSO4高滲液沖洗后，5 000 r·min－1，離心 10 min，收集的菌絲用 0.6 mol·L－1MgSO4高滲液再沖洗 1 次，5 000 r·min－1，離心 10 min，用無菌濾紙吸干水分。酶液用0.22 um微孔過濾膜過濾后，按菌絲體∶酶液=1∶2（m∶V）的比例添加酶液,震蕩2 min，混勻，在不同溫度下振蕩酶解不同時間，無菌條件下用無菌脫脂棉過濾，無菌管收集濾液，用0.6 mol·L－1MgSO4高滲液沖洗2次，5 000 r·min－1離心 5 min，沉淀用 0.5 mol·L－1MgSO4穩(wěn)滲劑洗滌離心，5 000 r·min－1，5 min 2次，用0.5 mol·L－1MgSO4穩(wěn)滲劑稀釋至一定體積后，血球計數(shù)板計算原生質(zhì)體數(shù)量。

1.2.3 原生質(zhì)體制備最佳條件的選擇

以黑29為供試菌株在不同酶濃度、酶解時間、酶解溫度、滲透壓穩(wěn)定劑種類及其濃度、菌齡、條件下進行酶解脫壁，根據(jù)原生質(zhì)體數(shù)確定最佳條件。

1.2.4 原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基的選擇

將制備的原生質(zhì)體溶液稀釋至2×104個·mL－1后加入等體積的液體再生培養(yǎng)基，25℃靜置孵育24 h，取孵育好的原生質(zhì)體0.1 mL涂培養(yǎng)皿，使每培養(yǎng)皿原生質(zhì)體數(shù)目達到103個，采用不同的再生培養(yǎng)基，25℃下靜置培養(yǎng)15～20 d，觀察培養(yǎng)皿中的再生菌落數(shù)。

原生質(zhì)體再生率計算：再生率（%）=再生菌落數(shù)/原生質(zhì)體總數(shù)×100%。

1.2.5 滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體再生的影響

選擇不同的滲透壓穩(wěn)定劑稀釋原生質(zhì)體后涂皿，25℃下靜置培養(yǎng)20 d，觀察平皿中的再生菌落數(shù)。

1.2.6 原生質(zhì)體再生菌株的培養(yǎng)

挑取涂布于再生培養(yǎng)基中萌發(fā)的菌落，于PDA斜面上25℃培養(yǎng)10 d，將所獲得的菌株編號，4℃保藏備用。

1.2.7 單核鑒定

挑取原生質(zhì)體再生的菌絲接種到PDA綜合培養(yǎng)基的平皿上，25℃靜止培養(yǎng)。待菌絲長滿整個平皿后，用剪刀剪邊長1 cm的正方形大小的透明膠布，用其粘平皿內(nèi)的菌絲并在顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶濃度對原生質(zhì)體數(shù)量的影響

選擇1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3%五種不同的溶壁酶濃度，水浴處理黑木耳菌絲體，結(jié)果為：濃度為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%溶壁酶產(chǎn)生的原生質(zhì)體數(shù)量分別為 8.4×107、9.8×107、11.5×107、10.9×107、10.2×107個·mL－1。濃度 2.0%效果最好，2.5%～3%次之。由此可知，在其他條件不變的情況下，原生質(zhì)體的數(shù)量隨酶濃度的增大而增加，但達到一定產(chǎn)量后，沒有明顯改變。酶中有對原生質(zhì)體有害的酶類，隨著酶量的增加，雜酶的濃度也會隨之增加，當達到一定濃度后，會影響原生質(zhì)體的活性。酶濃度過高會使酶體脫壁過于徹底，會影響原生質(zhì)體的再生能力。

2.2 不同的酶解時間對原生質(zhì)體數(shù)量的影響

由圖1可見，在其他條件不變的情況下，原生質(zhì)體的數(shù)量在酶解4 h時產(chǎn)量達到最高，最高值為11.5×107個·mL－1。4 h 后原生質(zhì)體的數(shù)量基本無明顯降低。若酶解時間過長原生質(zhì)體的產(chǎn)量和再生率都會降低，可能是因為脫壁的時間太久或雜酶的影響。

圖1 酶解時間對原生質(zhì)體釋放量的影響Fig.1 Effect of digesting time on protoplast yield

2.3 溫度對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

黑木耳菌絲加入2.0%的溶壁酶后分別放入27、29、31、33、35℃的水浴中酶解4 h。由圖2可見，浴溫度在31℃時原生質(zhì)體的數(shù)量最多，溫度太高或太低對原生質(zhì)體的數(shù)量都會有影響，原因可能是酶的溫度過高或過低會影響酶的活性。酶解溫度依不同的食用菌和不同的酶而有所不同，對于一般食用菌來講，一般酶解溫度在28～35℃，溫度太高或太低多不利于原生質(zhì)體的釋放。在低于最適酶解溫度時，隨著溫度的升高，原生質(zhì)體制備率不斷提高；高于最適酶解溫度時，原生質(zhì)體的產(chǎn)量明顯減少。在本試驗中，水浴溫度在31℃時原生質(zhì)體的數(shù)量最多，在27～31℃之間，隨著溫度的增加原生質(zhì)體產(chǎn)量逐漸升高，在31～35℃之間，原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著溫度的增高而降低。

圖2 溫度對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of enzymolysis temperature on protoplast yield

2.4 滲透壓穩(wěn)定劑及其濃度對原生質(zhì)體數(shù)量的影響

分別用KCl、MgSO4、蔗糖、甘露醇作為穩(wěn)滲劑，并分別用 0.3、0.5、0.7 mol·L－1濃度對其處理。由圖3可見，0.5 mol·L－1的MgSO4做穩(wěn)滲劑原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高。脫去了細胞壁的原生質(zhì)體是很脆弱的，如果胞外的滲透壓比胞內(nèi)的低，再生質(zhì)體就會因吸水而漲破，所以，需要特定的高滲溶液來懸浮原生質(zhì)體，這類高滲液就是滲透壓穩(wěn)定劑。

圖3 滲透壓穩(wěn)定劑種類及其濃度對原生質(zhì)體釋放量的影響Fig.3 Effect of osmotic pressure stabilizer and its concentration on protoplast yield

無機鹽做滲透壓穩(wěn)定劑較糖及醇合適，這與制備真菌原生質(zhì)體的多數(shù)報導(dǎo)相一致。

2.5 菌齡對原生質(zhì)體數(shù)量的影響

由圖3可見，培養(yǎng)了8 d的菌絲原生質(zhì)體數(shù)量最高。其次分別為7、9、10 d。菌齡影響菌體生理狀態(tài)如細胞壁的結(jié)構(gòu)、菌體的代謝水平與菌體的活力，從而影響原生質(zhì)體形成與再生。從形態(tài)學(xué)上看，新合成的細胞壁物質(zhì)淤積在菌絲的頂尖部位，而新生的細胞壁較薄，易于被降解，所以在菌絲生長速度最快的時期是原生質(zhì)體釋放最有利的階段。培養(yǎng)時間較短的菌絲體，菌絲生長量不夠。不易制得較多原生質(zhì)體，而培養(yǎng)時間過長，菌體老化，細胞壁加厚，比較牢固，不易被酶解。菌體的不同生理狀況直接影響到細胞壁的結(jié)構(gòu)及菌體的活力等，它是影響原生質(zhì)體產(chǎn)量的內(nèi)在因素。

圖4 菌齡對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of culture time on protoplast yield

2.6 再生培養(yǎng)基對原生質(zhì)體再生率的影響

結(jié)果見圖5～6。

圖5 最佳條件下原生質(zhì)體Fig.5 Highest yield of protoplast

RM1、RM2、RM3、RM4、RM5培養(yǎng)基原生質(zhì)體的再生率分別為0.88%、1.27%、1.40%、1.42%、1.63%。其中RM5再生率最高。原生質(zhì)體的再生包括細胞壁的再生和復(fù)原，在分離的原生質(zhì)體中，有的帶有細胞核，有的沒有細胞核，只有具有細胞核的原生質(zhì)體才能再生出新的細胞壁進而恢復(fù)成為一個完整的具有勝利功能的細胞。影響原生質(zhì)體再生的因素很多，例如原生質(zhì)體自身的活性，原生質(zhì)體自身的狀態(tài)，再生是的培養(yǎng)條件等。本試驗通過調(diào)整再生培養(yǎng)基的組分，往里面加一些適于作為細胞壁合成前體的物質(zhì)或可加速細胞合成的營養(yǎng)因子來培養(yǎng)原生質(zhì)體。

圖6 原生質(zhì)體再生菌株Fig.6 Protoplast regeneration

2.7 滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體再生率的影響

分別選用不同的滲透壓穩(wěn)定劑觀察原生質(zhì)體的再生率，蔗糖作為滲透壓穩(wěn)定劑再生率為1.59%，甘露醇做滲透壓穩(wěn)定劑再生率為1.55，硫酸鎂做滲透壓穩(wěn)定劑再生率為1.63%，氯化鉀做滲透壓穩(wěn)定劑再生率達1.43%。結(jié)果表明硫酸鎂做滲透壓穩(wěn)定劑再生率最高。

2.8 再生菌絲單核化

雙核菌絲及單核菌絲表達見圖7～8。單核菌絲經(jīng)過3代培養(yǎng)后觀察菌絲形態(tài)，若仍是單核菌絲即可用于培育新品種及基因工程方面的研究。單核體菌絲生長速度通常慢于雙核體，且菌絲較稀疏，氣生菌絲相對旺盛。通過鎖狀聯(lián)合觀察較容易對再生菌株的單核或雙核菌絲進行判斷。

圖7 雙核菌絲Fig.7 Nuclei of A.auricula dikaryons

圖8 單核菌絲Fig.8 Nuclei of A.auricula monokaryons

3 討 論

影響原生質(zhì)體數(shù)量的因素大小依次為酶解溫度酶濃度、菌齡和酶解時間。選擇RM5培養(yǎng)基及硫酸鎂為滲透壓為穩(wěn)滲劑原生質(zhì)體再生率較高。影響原生質(zhì)體再生的因素還有很多，例如，原生質(zhì)體本身的活性，原生質(zhì)體制備的狀態(tài)，操作方式等都必須考慮。原生質(zhì)體在結(jié)構(gòu)上并不完全等同于缺失了細胞壁的細胞，可能造成許多結(jié)果和功能上的改變，從而影響了自身的活力，造成再生能力的差異。

4 結(jié)論

在本研究中，通過對黑木耳原生質(zhì)體的分離、再生以及對再生后的菌絲單核體的鑒定。試驗結(jié)果表明：液體培養(yǎng) 8 d，以 0.6 mol·L-1MgSO4·7H2O作滲透壓穩(wěn)定劑，加入2.0%溶壁酶在31℃下酶解4 h，分離原生質(zhì)體效果最佳，原生質(zhì)體產(chǎn)量可達11.5×107個·mL-1。對五種不同再生培養(yǎng)基進行比較試驗。結(jié)果表明，再生培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200.0 g，葡萄糖 20.0 g，蛋白胨 3.0 g，KH2PO43.0 g，MgSO4·7H2O 2.0 g，酵母膏 2.0 g，維生素B110.0 mg，甘露醇109.3 g，瓊脂20.0 g加水至1 000 mL的再生培養(yǎng)基原生質(zhì)體再生率最高，再生率可達1.63%。

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