楊雅茹，黃 艷，李 俊，呂雄文，金 涌，熊自忠，張 磊，劉 紅

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽天然藥物活性研究省級實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230032;2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染病科，安徽合肥 230022)

肺纖維化(pulmonary fibrosis)是多種病因引起的一種慢性炎性間質(zhì)性肺疾病，主要病理特點(diǎn)是早期的彌漫性肺泡炎、肺泡上皮受損和后期大量肺成纖維細(xì)胞的病理性增生及基質(zhì)膠原進(jìn)行性積聚并取代正常的肺組織結(jié)構(gòu)［1］。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，肺纖維化發(fā)病率、死亡率不斷上升，5年生存率＜50%。目前臨床上仍以糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑及細(xì)胞毒性藥物為主，但療效均不理想，且具有明顯的毒副作用［2］。肺成纖維細(xì)胞的過度增生和分泌膠原在肺纖維化形成過程中扮演了重要的角色。因此，尋找有效藥物抑制肺成纖維細(xì)胞的過渡增生是防治肺纖維化的重要手段之一。

枇杷葉三萜酸(triterpene acids of loquat，TAL)是從枇杷葉中提取的主要活性部位，具有抗炎、抗氧化、止咳平喘和免疫調(diào)節(jié)等作用［3-4］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)［5］TAL對慢性支氣管炎大鼠有良好的防治作用。近年來又發(fā)現(xiàn)其具有抗纖維化的作用，劉娟等［6］研究發(fā)現(xiàn)給肺纖維化模型大鼠灌注TAL可有效降低肺內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的生成。本實(shí)驗(yàn)觀察TAL對人胚肺成纖維細(xì)胞(HFL-Ⅰ)活化、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)、膠原生成及其對ERK通路的影響。

1 材料

1.1 主要藥物與試劑人胚肺成纖維細(xì)胞(HFL-Ⅰ):中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;TAL由安徽省安泰醫(yī)藥生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，批號080601，純度可達(dá)到 ＞80%。MTT(3，4，5-dimethylthiazo-2-yl-2，5-diphenyltetrazolium bromide)粉，美國 Sigma公司產(chǎn)品。DMSO(二甲基亞砜)、碘化丙啶(PI):北京科海軍舟有限公司;α-MEM培養(yǎng)液:Gibco公司;胎牛血清:杭州四季青。

1.2 主要儀器Napeo-6100型細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國杜邦公司產(chǎn)品;PowerPac HC電泳儀，Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)儀器均由伯樂公司生產(chǎn);酶標(biāo)儀:美國BD公司;冷凍離心機(jī)TGL-18R，珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。PCR擴(kuò)增儀為Eppendorf公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 枇杷葉三萜酸配制用雙蒸水溶解TAL粉劑，加少量無水乙醇(體積分?jǐn)?shù)小于3%)作為助懸劑，用雙蒸水配制成 1 g·L-1的母液，0.22 μm 膜過濾除菌，-20℃保存，臨用前解凍，2周有效。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)將傳代細(xì)胞接種于含10%胎牛血清α-MEM培養(yǎng)液(100 U·ml-1青、鏈霉素)的25 cm2培養(yǎng)瓶中，接種濃度為1×109·L-1，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h貼壁后，用含0.5%小牛血清的 α-MEM培養(yǎng)液換液，再在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 細(xì)胞增殖測定(MTT法)根據(jù)參考文獻(xiàn)［7］，用含10%胎牛血清α-MEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/孔接種于96孔板，12 h后換含0.5%小牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的TAL，其終濃度分別為0.05、0.5、5、50 和500 mg·L-1，對照組只加等量的α-MEM液，每組設(shè)7平行孔，將培養(yǎng)板置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中，2 h之后，模型組和實(shí)驗(yàn)組加入細(xì)胞刺激因子TGF-β1(終濃度10 μg·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，在培養(yǎng)結(jié)束前4 h 每孔加入20 μl MTT，吸去上清液，加入 DMSO，每孔200 μl，混勻10 min后，于自動酶標(biāo)儀570 nm處測定各孔吸光度A值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，根據(jù)MTT的吸光度A值計算出MTT細(xì)胞增生抑制率。增生抑制率/%=(對照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對照組A值×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2.4 RT-PCR 法檢測各組 HFL-Ⅰ中 CTGF、α-SMA、CⅠ、CⅢ mRNA的表達(dá)

2.4.1 總RNA的提取 將 HFL-Ⅰ分5組(n=3/組):對照組、TGF-β1(10 μg·L-1)刺激組、TGF-β1+TAL5、50和500 mg·L-1組。TAL給藥后2 h加入 TGF-β1(10 μg·L-1)共培養(yǎng)24 h，采用 TRIzol一步法提取細(xì)胞總RNA。

2.4.2 RT-PCR 反應(yīng) 按照 Promega Corporation提供的Reverse Transcription System進(jìn)行。引物序列:CTGF(503 bp)，forward:5＇-CATGCCATGTCTCCGTA CATC-3＇，reverse:5＇-CCGACTGGAAGACACGTTTGG-3＇;α-SMA(373 bp)，forward:5＇-GGAAGGACCTCTAT GCTAAC-3＇，reverse:5＇-CATAGGTAACGAGTCAGAG C-3＇;COL-1(458 bp)，forward:5＇-TGGTGACAAGGGT GAGACAG-3＇，reverse:5＇-GGATGTTCTCGATCTGCTG G-3＇;COL-3(493 bp)，forward:5＇-GAATGCCTGGAGA AAGAGGA-3＇，reverse:5＇-GGGTTACCATTACTACCA GG-3＇;β-actin(205 bp)，forward:5＇-CCCACACTGTGC CCATCTACG-3＇，reverse:5＇-GCCATCTCTTGCTCGAA GTCC-3＇;PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94℃，5 min;94℃，40 s;51℃，40 s;72℃，1 min;72℃，10 min，35 個循環(huán)。

2.5 Western blot法檢測各組 HFL-Ⅰ ERK、p-ERK的蛋白的表達(dá)TAL給藥后2 h加入TGF-β1(10 μg·L-1)共培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基，每瓶加入1 ml RIPA裂解液(每1 ml裂解液中加10 μl PMSF)，冰上裂解 30 min。4℃，12 000 r·min-1離心 10 min，取上清。加入上樣緩沖液，100℃，加熱5 min使蛋白變性。每孔上樣15 μl總蛋白，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(濃縮膠電壓80V，分離膠120V)。電泳結(jié)束后用半干轉(zhuǎn)儀器將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，電壓15V，時間25 min。膜在室溫下用含50 g·L-1脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉2 h。膜清洗后加入一抗，一抗的稀釋濃度為:ERK、p-ERK(1 ∶400 稀釋)、β-actin(1 ∶500 稀釋)，4℃過夜。再分別加入與一抗相匹配的二抗(1∶2 000稀釋)，室溫放置1 h。ECL發(fā)光試劑盒顯影，分析條帶吸光值。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果以±s表示，使用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件中單因素方差分析程序檢驗(yàn)各組間差異的顯著性。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度的TAL對人胚肺成纖維細(xì)胞增殖的影響體外培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞，將HFL-Ⅰ按如下分組:對照組、TGF-β1(10 μg·L-1)刺激組、不同濃度的 TAL給藥組(TGF-β1刺激 +不同濃度的TAL)。MTT比色法檢測結(jié)果如下Tab 1，由表中我們可以看出隨著TAL濃度的增大，或孵育時間的延長，在570 nm處的吸光度A值都越來越小。由Tab 1分析可以得知，與對照組相比，TGF-β1刺激組HFL-Ⅰ細(xì)胞增殖明顯(P＜0.01)。濃度為50 mg·L-1時變化最明顯(P ＜0.01)，500 mg·L-1時抑制率最高。同一濃度TAL作用下與24 h相比較，48 h抑制率差異有顯著性(P＜0.05)。

Tab 1 Effect of TAL on the proliferation of HFL-Ⅰstimulated by TGF-β1(±s，n=7)

Tab 1 Effect of TAL on the proliferation of HFL-Ⅰstimulated by TGF-β1(±s，n=7)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，TAL group vs TGF-β1-stimulated group at the same time;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs 24 h group at the same dose;##P ＜0.01，TGF-β1-stimulated group vs control group

Group Dose/mg·L-1 24 h/A570 48 h/A570 72 h/A570 Control - 0.209 ±0.020 0.217 ±0.016 0.249 ±0.024 TGF-β1 - 0.706 ±0.018## 0.712 ±0.011## 0.717 ±0.032##TAL 0.05 0.701 ±0.031 0.699 ±0.021 0.692 ±0.028*0.5 0.698 ±0.027 0.693 ±0.013* 0.673 ±0.022*5 0.694 ±0.042* 0.690 ±0.010* 0.649 ±0.017＊＊△50 0.607 ±0.035＊＊ 0.564 ±0.019＊＊△0.525 ±0.012＊＊△△500 0.594 ±0.036＊＊ 0.533 ±0.033＊＊△0.486 ±0.018＊＊△△

不同濃度 TAL對 TGF-β1刺激后 HFL-Ⅰ細(xì)胞的抑制率如Fig 1，從圖中可知，給藥組HFL-Ⅰ增殖的生長抑制率均隨著TAL濃度的增大或TAL與HFL-Ⅰ細(xì)胞共孵育時間的延長而逐漸增大，呈濃度-時間依賴性。

3.2 TAL 對 TGF-β1 刺激 HFL-Ⅰ后 CTGF、α-SMA、CⅠ、CⅢ mRNA表達(dá)的影響采用RT-PCR法進(jìn)一步檢測 TAL 對 TGF-β1(10 μg·L-1)刺激HFL-Ⅰ 后 CTGF、α-SMA、CⅠ、CⅢ mRNA 表達(dá)的影響。結(jié)果如Fig 2，3所示:與對照組比較，TGF-β1刺激組 HFL-Ⅰ中 α-SMA、CTGF、CⅠ、CⅢ mRNA 明顯表達(dá)，且差異有顯著性(P＜0.01)。而與 TGF-β1刺激組比較，TAL(50 mg·L-1)能明顯降低α-SMA、CTGF、CⅠ、CⅢ mRNA 的表達(dá)(P ＜0.01)。

Fig 1 Time-inhibition curve of TAL on the proliferation of HFL-Ⅰ stimulated by TGF-β1

3.3 TAL 對 TGF-β1刺激 HFL-Ⅰ后ERK、p-ERK蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測ERK、p-ERK結(jié)果如Fig 4所示，TGF-β1刺激 HFL-Ⅰ 48 h后，與對照組比較，TGF-β1刺激組HFL-Ⅰ 的p-ERK蛋白表達(dá)明顯增加，且差異具有顯著性(P＜0.01)。與TGF-β1刺激組比較，TAL(50 mg·L-1)組明顯抑制了TGF-β1刺激 HFL-Ⅰ后 p-ERK蛋白表達(dá)(P＜0.01)。

4 討論

肺纖維化的形成與肺的反復(fù)損傷后的過度修復(fù)有關(guān)，表現(xiàn)為肺細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成與降解穩(wěn)態(tài)失衡，尤其是膠原代謝失衡［8］。ECM過度沉積與許多因素有關(guān)，其中細(xì)胞因子起到主要調(diào)控作用，轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)被認(rèn)為是一種強(qiáng)效的致纖維化細(xì)胞因子，在ECM過度沉積和肺纖維化中起到關(guān)鍵作用［9］，因此以 TGF-β1誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞作為體外肺纖維化模型。肺成纖維細(xì)胞(FB)是肺纖維化過程的主要效應(yīng)細(xì)胞，其活化、過度增殖及合成膠原等細(xì)胞外基質(zhì)增多是肺纖維化的基本特征。已有研究證實(shí)［10］，成纖維細(xì)胞的活化是肺纖維化形成的關(guān)鍵步驟和中心環(huán)節(jié);肺成纖維細(xì)胞在病理情況下或受到刺激時表現(xiàn)出增殖、分泌細(xì)胞因子、合成大量ECM，這一系列變化被稱為成纖維細(xì)胞的活化。

Fig 2 Effect of TAL on expression of α-SMA，CTGF，CⅠ，CⅢmRNA in HFL-Ⅰstimulated by TGF-β1(±s，n=3)

Fig 3 Effect of TAL on expression of ERK，p-ERK protein in HFL-Ⅰstimulated by TGF-β1(±s，n=3)

枇杷葉是薔薇科枇杷屬枇杷的葉，是傳統(tǒng)的藥用植物。前期研究發(fā)現(xiàn)TAL對慢性支氣管炎大鼠有良好的防治作用［11］，近來研究還提示 TAL具有抗肺纖維化作用［6］。本課題以人胚肺成纖維細(xì)胞(HFL-Ⅰ)為研究對象，在體外初步探討了TAL對HFL-Ⅰ增殖、活化、膠原生成及ERK磷酸化的影響，以進(jìn)一步研究TAL防治肺纖維化的作用機(jī)制。我們選擇MTT比色法測定TAL對HFL-Ⅰ的增殖抑制率。結(jié)果表明，TAL對HFL-Ⅰ的增殖具有抑制作用，并具有時間依賴性和濃度依賴性。

活化后的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞能表達(dá)平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，因此，成纖維細(xì)胞表達(dá) α-SMA 是其活化及損傷的標(biāo)志［12］。已有報道發(fā)現(xiàn)［13］TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。另有實(shí)驗(yàn)研究表明［14-15］TGF-β1誘導(dǎo)結(jié)締組織生長因子(CTGF)表達(dá)，CTGF編碼的蛋白具有明顯的絲裂原性和趨化性，可誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞增殖分化，從而介導(dǎo)ECM沉積;CTGF刺激細(xì)胞后，能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ERK1/2的磷酸化。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TGF-β1能刺激成纖維細(xì)胞α-SMA基因表達(dá)，使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞;TGF-β1還能刺激成纖維細(xì)胞過度表達(dá)CTGF、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原，提示發(fā)生表型轉(zhuǎn)變的成纖維細(xì)胞能合成和分泌大量膠原等ECM成分，與此同時，TAL(5～500 mg·L-1)可以抑制這一進(jìn)程。

絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)通路是信號從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)部的重要途徑，主要包括ERK、JNK、p38 通路［16-17］。MAPK 家族在調(diào)控細(xì)胞生長、發(fā)育、分裂及細(xì)胞間功能的同步性等多種生理功能中起著重要作用。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)通路是迄今研究最為透徹的一條MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，它的激活同許多細(xì)胞因子密切相關(guān)［18］。前期的動物實(shí)驗(yàn)已表明，許多細(xì)胞因子及激酶參與了肺纖維化的形成，包括TGF-β1、腫瘤壞死因子(TNF-α)等。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，MAPK激酶信號參與了TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，TGF-β1同ERK信號通路的活化有密切關(guān)系［18-19］。胡永斌等［19］在研究中發(fā)現(xiàn)TGF-β1可以使HLF細(xì)胞內(nèi)ERK、p38激酶磷酸化而活化，但沒有檢測到JNK激酶信號分子的活化。徐芳等［18］通過免疫組化及Western blot蛋白定量的方法研究該通路中重要信號蛋白ERK在肺纖維化大鼠模型肺組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各時間段ERK1、ERK2及p-ERK表達(dá)明顯增加，明顯高于同期對照組，說明信號蛋白ERK無論是在早期的肺泡炎，還是在最后的纖維化階段都發(fā)揮了重要作用，提示ERK信號通路參與了肺纖維化的發(fā)病過程。本實(shí)驗(yàn)我們可觀察到，TGF-β1刺激HFL-Ⅰ組p-ERK1/2蛋白表達(dá)較對照組明顯增加;與TGF-β1刺激組比較，TAL組明顯降低了p-ERK1/2蛋白的表達(dá)，而ERK無變化。提示，ERK1/2信號途徑參與了TGF-β1刺激成纖維細(xì)胞活化的過程，并且TAL可能通過抑制ERK1/2蛋白磷酸化這一環(huán)節(jié)來發(fā)揮作用。

綜上，TAL能抑制HFL-Ⅰ的增殖，同時也能使活化后 HFL-Ⅰ中的α-SMA生成減少，CTGF、膠原和p-ERK1/2表達(dá)降低。提示，TAL可能通過抑制α-SMA基因表達(dá)來阻斷成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化;可能通過降低 CⅠ、CⅢ、CTGF的過度表達(dá)，減少ECM的沉積;可能通過抑制ERK1/2蛋白磷酸化環(huán)節(jié)阻斷ERK通路等3個機(jī)制阻斷肺纖維化進(jìn)程，發(fā)揮其抗肺纖維化的作用。

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