何金花，陳順儀，王 莉，陳武嘉，黃俊杰，蔣建偉

(1.廣東省廣州市番禺中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 511400;2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化教研室，廣東 廣州 510630)

研究表明，消化系腫瘤的發(fā)病與腫瘤細(xì)胞凋亡的減少有密切關(guān)系。通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞使其重新恢復(fù)凋亡，比殺死腫瘤細(xì)胞更符合人體生理性細(xì)胞死亡過程，可以明顯減少或消除當(dāng)前治療藥物所導(dǎo)致的毒副作用。因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為腫瘤研究的一個(gè)熱點(diǎn)。凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)編碼一組結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)，能抑制Caspase依賴的細(xì)胞凋亡途徑。在人類發(fā)現(xiàn)的 IAPs家族有8個(gè)成員，其中 survivin、xiap、BRUCE/apollon、livin是其中的主要成員，抑制細(xì)胞凋亡作用較強(qiáng)［1］。因此人們提出IAPs家族基因可能是腫瘤治療的分子靶點(diǎn)。

目前有一些靶向采用 survivin、xiap、apollon、livin基因的反義核酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASO)或siRNA抑制腫瘤細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)文章，但是，在IAPs家族的這些基因中反義抑制哪個(gè)基因的表達(dá)效果更好呢，尚未見這方面的實(shí)驗(yàn)報(bào)道。為此本文擬采用 survivin、xiap、apollon、livin反義核酸作用于人肝癌、結(jié)腸癌、胃癌細(xì)胞，比較它們對(duì)細(xì)胞的增殖與凋亡的作用，為消化系腫瘤基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1.1 主要試劑及細(xì)胞 DMEM/F12培養(yǎng)基購自Gibco公司，脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000、Annexin VPI雙染試劑盒購自美國BD公司，CCK-8(Cell Count Kit-8)試劑購自日本同仁化學(xué)研究所。人肝癌HepG2細(xì)胞、胃癌 MGC-803細(xì)胞、結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 反義核酸 4條IAP家族各成員反義核酸序列均是文獻(xiàn)［2－5］已經(jīng)證實(shí)能高效特異性抑制靶基因表達(dá)，由賽百盛生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，全硫代修飾，PAGE純化，凍存于－20℃，使用前用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液配制成100 μmol·L－1的濃度備用。反義核酸及隨機(jī)寡核苷酸序列如下，見Tab 1。

Tab 1 Sequence of antisense oligodeoxynucleotide of targeting gene

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人肝癌HepG2細(xì)胞、胃癌MGC-803細(xì)胞、結(jié)腸癌 Lovo細(xì)胞培養(yǎng)體系:DMEM/F12培養(yǎng)液含10%新生牛血清，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，每2～3天用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、臺(tái)盼藍(lán)拒染率＞95%的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)時(shí)按照脂質(zhì)體lipofectamineTM2000(μl)∶ASO(μg)為 2.5∶1的比例配制，先用DMEM/F12液分別將脂質(zhì)體和ASO稀釋至等體積，室溫孵育5 min，然后將脂質(zhì)體與ASO在室溫下混合20 min，再將混合物逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)板中。

1.2.2 WST法檢測(cè)3種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2、MGC-803和Lovo細(xì)胞，用含10%新生牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為4×107個(gè)·L－1，接種到96孔板。12 h后，吸盡上清，更換為無血清DMEM/F12培養(yǎng)液。將配好的脂質(zhì)體與ASO混合物逐滴加入到孔板中，ASO的作用濃度分別設(shè)為 0.1、0.2 μmol·L－1。將細(xì)胞培養(yǎng)板放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h后，每孔加入含10%小牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。另設(shè)空白對(duì)照組(control)、隨機(jī)寡核苷酸對(duì)照組(RODN，終濃度為0.2 μmol·L－1)。48 h 后，每孔加入 CCK-8 試劑10 μl，室溫孵育90 min，多功能酶標(biāo)儀(Bio-Rad)測(cè)定吸光度A450nm(激發(fā)波長(zhǎng)450 nm，參比波長(zhǎng)655 nm)，計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率/%=(對(duì)照組吸光度－實(shí)驗(yàn)組吸光度)/對(duì)照組吸光度×100%。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度為 1 ×108·L－1，接種于 12 孔板，總體積 1 ml，12 h后加入藥物，設(shè)①control組，②RODN組(終濃度0.2 μmol·L－1)，③ASO 組(終濃度 0.2 μmol·L－1)等3組，培養(yǎng)48 h后，消化收集細(xì)胞，以染色緩沖液(binding buffer)重懸，加入FITC標(biāo)記的AnnexinV試劑和PI試劑，混勻后避光孵育15 min，加入200 μl染色緩沖液，立即使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，AnnexinV-FITC+，PI–的細(xì)胞群(即LR細(xì)胞群)為早期凋亡細(xì)胞。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析(one-way ANOVA)分析組間差異的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 4種ASOs對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用IAPSASO作用于HepG2細(xì)胞48 h后，濃度為0.1、0.2 μmol·L－1的 ASO 可抑制細(xì)胞的增殖，隨著ASO濃度的增高，對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率越高，抑制率明顯高于RODN組(P＜0.01)，并呈劑量依賴效應(yīng)。其中，在作用濃度為 0.2 μmol·L－1時(shí)，survivin ASO、xiap ASO和apollon ASO對(duì) HepG2細(xì)胞的增殖抑制的作用最強(qiáng)，抑制率超過80%(Tab 2)。

Tab 2 Effect of the 4 ASOs on the proliferation inhibition of HepG2 cells(±s，n=3)

Tab 2 Effect of the 4 ASOs on the proliferation inhibition of HepG2 cells(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs control respectively，##P ＜0.01 vs RODN respectively，－:not detected.IR:inhibitory rate

Group 0.1 μmol·L －10.2 μmol·L －1 A450 IR/%A450 IR/%Control 1.764 ±0.034 0 1.764 ±0.034 0 RODN － － 1.567 ±0.024 11.22 ±1.67 survivin ASO 0.464 ±0.017 74.13 ±0.93＊＊ 0.279 ±0.025 84.23 ±1.38##livin ASO 0.618 ±0.014 65.03 ±0.78＊＊ 0.379 ±0.009 77.51 ±0.47##xiap ASO 0.441 ±0.013 75.04 ±0.77＊＊ 0.297 ±0.020 83.23 ±0.85##apollon ASO 0.503 ±0.015 71.50 ±0.83＊＊ 0.327 ±0.023 81.54 ±1.26##

2.2 4種ASOs對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖抑制作用IAPSASO作用于MGC-803細(xì)胞48 h后，濃度為0.1、0.2 μmol·L－1的 ASO 可抑制細(xì)胞的增殖，隨著ASO濃度的增高，對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率越高，抑制率明顯高于RODN組(P＜0.01)，并呈劑量依賴效應(yīng)。其中，在作用濃度為0.1 μmol·L－1時(shí)，xiap ASO抑制MGC-803細(xì)胞增殖的作用最強(qiáng);在作用濃度為 0.2 μmol·L－1時(shí)，xiap ASO 和 survivin ASO對(duì)MGC-803細(xì)胞的增殖抑制作用最強(qiáng)，抑制率超過80%(Tab 3)。

2.3 4種ASOs對(duì)結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞的增殖抑制作用IAPSASO作用于Lovo細(xì)胞48 h后，濃度為0.1、0.2 μmol·L－1的 ASO 均可明顯抑制細(xì)胞的增殖，并呈劑量依賴效應(yīng)。其中，在作用濃度為0.1 μmol·L－1或 0.2 μmol·L－1時(shí)，均以 survivin ASO抑制細(xì)胞增殖的作用最強(qiáng);在作用濃度為0.2 μmol·L－1時(shí)，survivin ASO對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制率超過80%(Tab 4)。

Tab 3 Effect of the 4 ASOs on the proliferation inhibition of MGC-803 cells(±s，n=3)

Tab 3 Effect of the 4 ASOs on the proliferation inhibition of MGC-803 cells(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs control respectively;##P＜0.01 vs RODN respectively，－:not detected.IR:inhibitory rate

Group 0.1 μmol·L －10.2 μmol·L －1 A450 IR/%A450 IR/%Control 1.632 ±0.029 0 1.632 ±0.029 0 RODN － － 1.480 ±0.029 9.08 ±1.43 survivin ASO 0.851 ±0.035 50.14 ±2.10＊＊ 0.304 ±0.051 81.40 ±2.92##livin ASO 0.939 ±0.036 42.50 ±1.88＊＊ 0.399 ±0.032 75.66 ±1.92##xiap ASO 0.422 ±0.020 74.22 ±1.13＊＊ 0.221 ±0.035 86.56 ±2.27##apollon ASO 0.994 ±0.016 39.09 ±0.92＊＊ 0.591 ±0.016 63.79 ±0.98##

Tab 4 Effect of the 4 ASOs on the proliferation inhibition of Lovo cells(±s，n=3)

Tab 4 Effect of the 4 ASOs on the proliferation inhibition of Lovo cells(±s，n=3)

＊＊P ＜0.01 vs control respectively，##P ＜0.01 vs RODN respectively，－:not detected.IR:inhibitory rate

Group 0.1 μmol·L －10.2 μmol·L －1 A450 IR/%A450 IR/%Control 1.684 ±0.056 0 1.684 ±0.056 0 RODN － － 1.565 ±0.009 7.22 ±0.67 survivin ASO 0.742 ±0.017 55.90 ±1.23＊＊ 0.292 ±0.006 82.61 ±0.35##livin ASO 1.011 ±0.018 39.80 ±1.24＊＊ 0.523 ±0.027 68.82 ±1.67##xiap ASO 0.894 ±0.029 47.84 ±2.24＊＊ 0.454 ±0.029 73.93 ±1.66##apollon ASO 0.871 ±0.035 48.28 ±2.47＊＊ 0.432 ±0.044 74.35 ±2.84##

2.4 4種ASOs對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響各組藥物作用肝癌HepG2細(xì)胞48 h后，利用PI-Annexin V雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率，左下限(LL)為正常細(xì)胞群，右下限(LR)為早期凋亡細(xì)胞群，右上限(UR)為晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞群。與 control組和 RODN組相比，livin ASO、survivin ASO、apollon ASO組細(xì)胞早期凋亡率大幅度增加，凋亡率分別為27.4%、19.8%、14.1%，晚期凋亡分別為 27.9%、22.5%、23.7%(Fig 1)。

2.5 4種ASOs對(duì)結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞凋亡的影響各組藥物作用于結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞48 h后，利用PIAnnexin V雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率。與control組和RODN組相比，4種ASOs均誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。其中survivin ASO和livin ASO組細(xì)胞早期凋亡率大幅度增加，細(xì)胞凋亡率分別為34.9%、33.3%，apollon ASO和xiap ASO組也有一定的促凋亡作用，凋亡率為19.4%、15.9%;晚期凋亡方面，xiap ASO組細(xì)胞晚期凋亡和壞死率最高，為40.9%，livin ASO和survivin ASO組細(xì)胞晚期凋亡和壞死率分別為27.1%和23.1%(Fig 2)。

2.6 4種ASOs對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡的影響各組藥物作用胃癌MGC-803細(xì)胞48 h后，其早期凋亡率高于control組和RODN組，其中apollon ASO促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用最強(qiáng)達(dá)41.1%，各組壞死率大于凋亡率，可能與細(xì)胞狀態(tài)有關(guān)(Fig 3)。

Fig 1 Effect of IAPs ASO on the induction of apoptosis in HepG2 cells

Fig 2 Effect of IAPs ASO on the induction of apoptosis in Lovo cells

Fig 3 Effect of IAPs ASO on the induction of apoptosis in MGC-803 cells

3 討論

細(xì)胞凋亡又稱為程序性細(xì)胞死亡，在機(jī)體發(fā)育分化和維持體內(nèi)平衡中起著十分重要的作用，受細(xì)胞內(nèi)源性基因酶類和信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)控。凋亡受抑制將導(dǎo)致細(xì)胞生存期延長(zhǎng)，并使損傷的或基因突變的細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生［6］。IAPs(inhibitor of apoptosis proteins)是從桿狀病毒中分離出，此后在酵母、昆蟲、人和其它哺乳動(dòng)物組織中都有發(fā)現(xiàn)，是具有抗凋亡作用的蛋白家族，目前共發(fā)現(xiàn)IAP 家族中有 XIAP、c-IAP1、c-IAP2、NAIP、Apollon、Livin、Survivin、ILP-2等8個(gè)成員。IAP主要有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，即BIR、RING、CARD結(jié)構(gòu)域，其中BIR結(jié)構(gòu)域全稱為桿狀病毒重復(fù)序列，為IAP家族抑制細(xì)胞凋亡所必需，所有家族成員至少含有1個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域，而凋亡抑制蛋白發(fā)揮功能是與它密切相關(guān)［6］。

xiap基因定位于染色體Xq25，N末端有3個(gè)BIR，C末端有1個(gè) Ring指結(jié)構(gòu)域［7］。survivin基因位于染色體17q25，在胚胎和發(fā)育的胎兒組織中廣泛表達(dá)，在終末分化的成人組織中不表達(dá)，而在人類各種腫瘤組織中廣泛表達(dá)。彭萬仁等［8］研究丹皮酚抑制肝癌細(xì)胞增殖凋亡的影響，其機(jī)制可能與下調(diào) XIAP，Survivin蛋白有關(guān)。Chen等［9］發(fā)現(xiàn)，人腦瘤SNB-78細(xì)胞有apollon基因的高表達(dá)，顯示對(duì)多種化療藥物不敏感。采用apollon反義核酸抑制Apollon蛋白的表達(dá)，明顯提高SNB-78細(xì)胞對(duì)cisplatin和喜樹堿的敏感性，Apollon蛋白對(duì)SNB-78細(xì)胞具有抗凋亡作用［10］。

本研究選取IAPs家族中抑制凋亡作用較強(qiáng)的4 種蛋白 Survivin、Xiap、Apollon、Livin，通過合成其反義寡核苷酸序列，運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，胃癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞。WST實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在作用濃度為 0.2 μmol·L－1時(shí)，4 種反義核酸對(duì) HepG2、MGC-803、Lovo細(xì)胞增殖均有很強(qiáng)的抑制作用，其中survivin、xiap、apollon反義核酸抑制 HepG2細(xì)胞增殖的作用最強(qiáng)，survivin、xiap反義核酸抑制 MGC-803細(xì)胞增殖的作用最強(qiáng)，survivin反義核酸抑制Lovo細(xì)胞增殖的作用最強(qiáng)。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示，各組藥物作用于HepG2細(xì)胞48 h后，各組細(xì)胞早期凋亡率大幅度增加，其中l(wèi)ivin反義核酸致HepG2細(xì)胞凋亡作用最強(qiáng)，達(dá)27.4%;apollon ASO和survivin ASO組也有一定的促凋亡作用，凋亡率為14.1%、19.8%;同時(shí)以livin、apollon和survivin ASO組細(xì)胞晚期凋亡和壞死率較高，xiap ASO對(duì)HepG2細(xì)胞致凋亡作用較其他3種反義核酸弱。

各組藥物作用于Lovo細(xì)胞48 h后，各組細(xì)胞早期凋亡率大幅度增加，其中l(wèi)ivin ASO和survivin ASO致細(xì)胞早期凋亡作用最強(qiáng)，分別達(dá)33.3%和34.9%;apollon ASO和xiap ASO組也有一定的促凋亡作用，凋亡率為 19.4%、15.9%;同時(shí)以 xiap ASO、livin ASO和survivin ASO組細(xì)胞晚期凋亡和壞死率較高，分別為40.9%、27.1%和23.1%。

各組藥物作用于MGC-803細(xì)胞48 h后，各組細(xì)胞早期凋亡率增加，其中apollon ASO和livin ASO致細(xì)胞早期凋亡作用最強(qiáng)，分別達(dá)41.1%和35.6%;以xiap ASO組細(xì)胞晚期凋亡和壞死率最高。

對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞，xiap ASO的增殖抑制效果很好，而致細(xì)胞凋亡作用一般，可能是因?yàn)閤iap ASO還通過其他方式致細(xì)胞死亡，如細(xì)胞自噬性死亡或直接導(dǎo)致細(xì)胞壞死，這還有待于今后進(jìn)一步證明。IAPs家族不同的基因的反義核酸對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞增殖抑制、致凋亡水平有差異，是由于不同蛋白在不同組織中表達(dá)水平不同，而且這些蛋白雖然屬同一家族，結(jié)構(gòu)上同源，但在功能上還是有區(qū)別的。以靶向 survivin、xiap、apollon、livin 的反義核酸或 siRNA作用于消化系腫瘤細(xì)胞，抑制細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，將為臨床治療消化系腫瘤提供理論依據(jù)。

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