趙文君 邢國(guó)勝 于順祿 魏學(xué)磊 張 凱 陸 蕓 郭 剛

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種進(jìn)行性的關(guān)節(jié)炎性破壞，以滑膜增生及關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞為特征的系統(tǒng)性自身免疫病。慢性炎癥過(guò)程及細(xì)胞因子引起的自身免疫過(guò)程可誘發(fā)關(guān)節(jié)破壞。白細(xì)胞介素（IL）-23是新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，主要由活性單核巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞分泌，具有十分復(fù)雜的生物學(xué)功能。本研究旨在檢測(cè)RA患者滑膜組織、RA滑膜成纖維細(xì)胞(synovial fibro?blasts，SF)中IL-23p19 mRNA的表達(dá)，并與骨性關(guān)節(jié)炎(osteoporosis arthritis，OA)滑膜組織、OASF中IL-23p19 mRNA相比較，并分析RA患者滑膜組織、RASF中IL-23p19 mRNA與IL-1β mRNA的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所有滑膜組織均來(lái)源于2008年10月—2009年9月天津醫(yī)院關(guān)節(jié)科行滑膜切除術(shù)及關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者，其中RA患者6例，男2例，女4例，年齡51～61歲，平均（54.0± 3.5）；OA患者6例，男1例，女5例，年齡54～77歲，平均（63.7± 7.9）。診斷符合美國(guó)風(fēng)濕學(xué)會(huì)1987年修訂的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)及1986年制定的OA診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)術(shù)后病理學(xué)證實(shí)。所有患者均無(wú)腫瘤以及其他與免疫相關(guān)的疾病。術(shù)中無(wú)菌切取的滑膜組織分兩部分：一部分用于SF體外培養(yǎng)，一部分液氮保存用于RNA提取。

1.2 方法

1.2.1 SF體外培養(yǎng) DMEM和胎牛血清均購(gòu)自Gibco公司。無(wú)菌切取的滑膜組織，Hank’s反復(fù)沖洗，去除表面的滑液。修剪成1 mm3左右的小塊，置于0.25%胰酶，37℃消化30 min，棄上清，在剩余組織塊中加入1 g/LⅡ型膠原酶，37℃消化2 h。200目紗網(wǎng)過(guò)濾，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞擴(kuò)增至一定濃度，常規(guī)消化，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 RNA提取及RT-PCR Trizol購(gòu)自invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑及PCR相關(guān)試劑均購(gòu)自TaKaRa公司，DNA Marker為DL2000。取液氮中凍存的滑膜組織約100 mg及培養(yǎng)的第2代SF，分別加入1 mL Trizol，提取步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中所用耗材均經(jīng)過(guò)無(wú)RNA酶處理。取RNA 4 mg，oligo(dT)181 μL，加DEPC水補(bǔ)足至5 μL，70℃孵育5 min，取出迅速置于冰盒內(nèi)，按順序加入5×RT buffer 4 μL，10 mmol/L dNTP 4 μL，RNA酶抑制劑0.5 μL，反轉(zhuǎn)錄酶1 μL。42℃孵育1 h，95℃，5 s，-20℃保存，用于PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)總體積25 μL，其中10×buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，TaqDNA聚合酶0.25 μL，三蒸水18.25 μL，模板1 μL。循環(huán)參數(shù)：95℃3 min變性，95℃1 min，56℃40 s，72℃1 min，最后延伸72℃7 min，35個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.3 PCR產(chǎn)物結(jié)果分析 取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，EB染色。凝膠自動(dòng)成像分析系統(tǒng)掃描成像，并測(cè)定條帶灰度值，以目的基因與內(nèi)參基因GAPDH比值作為目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料描述用M（P25,P75），2組間比較采用秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Pearson直線相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA與OA患者滑膜組織中IL-23p19 mRNA的表達(dá) 6例RA滑膜組織在260 bp處均表達(dá)明亮、清晰的特異性條帶，6例OA滑膜組織中有4例在260 bp處表達(dá)較弱的特異性條帶；RA滑膜組織中的表達(dá)量為0.306 5（0.244 0，0.380 5），明顯高于OA滑膜組織中陽(yáng)性標(biāo)本的表達(dá)量0.125 4（0.117 5,0.134 0），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（T=10,P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 RA與OA組織IL-23p19 mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 RASF與OASF中IL-23p19 mRNA表達(dá) RASF中6例均在260 bp處表達(dá)明亮、清晰的特異性條帶，OASF中4例在260 bp處表達(dá)較弱的特異性條帶。RASF中陽(yáng)性表達(dá)量為0.287 0（0.251 5，0.310 7）明顯高于OASF中的0.087 9（0.021 5，0.134 2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（T=10,P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 RASF與OASF中IL-23p19 mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3 IL-1β mRNA在RA滑膜組織與RASF中的表達(dá)及與IL-23p19 mRNA的相關(guān)性 6例滑膜RA組織和6例RASF在233 bp處均表達(dá)明亮、清晰的IL-1β特異性條帶，見(jiàn)圖3。在RA滑膜組織中IL-23p19 mRNA的表達(dá)量與IL-1βmRNA的表達(dá)量0.127 0（0.078 6，0.411 4）呈正相關(guān)（r=0.900，P＜0.05），RASF中IL-23p19 mRNA的表達(dá)量與IL-1β mRNA的表達(dá)量0.083 5（0.063 8，0.115 4）呈正相關(guān)（r= 0.883，P＜0.05）。

3 討論

圖3 RA滑膜組織與RASF中IL-1βmRNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

IL-23主要來(lái)源于一些抗原提呈細(xì)胞，如激活的樹(shù)突狀細(xì)胞，被革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌及病毒產(chǎn)物刺激后的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。IL-23可刺激Th17細(xì)胞分泌前炎癥細(xì)胞因子IL-17[1]，而IL-17也可刺激IL-23p19亞單位的生成[2]，該作用通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、細(xì)胞核因子（NF）-κB和磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)通路發(fā)揮作用[3]。IL-23、IL-17A和IL-17F在T細(xì)胞觸發(fā)的炎癥中發(fā)揮著重要作用，如RA、多發(fā)性硬化癥和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫性疾病，這些因子可上調(diào)另外一些參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子和化學(xué)因子的分泌。Brentano等[4]對(duì)滑膜組織進(jìn)行原位雜交，結(jié)果顯示RA滑膜組織有大量的IL-23p19 mRNA表達(dá)，OA滑膜組織不表達(dá)或微量表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，6例RA患者滑膜組織中均有IL-23p19 mRNA的表達(dá)，主要由于RA滑膜組織中含有大量的免疫炎性細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等，激活的單核巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞能分泌大量的IL-23p19。同時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)體外分離培養(yǎng)的RA患者滑膜成纖維細(xì)胞也均表達(dá)IL-23p19 mRNA。Brentano等[4]認(rèn)為體外培養(yǎng)的RA滑膜成纖維細(xì)胞在沒(méi)有刺激因素存在的情況下是不表達(dá)IL-23p19 mRNA的，這可能是由于他們選擇的是4～8代滑膜細(xì)胞，細(xì)胞分化程度與體內(nèi)有所不同；而本研究使用的第2代細(xì)胞，更接近于體內(nèi)細(xì)胞狀態(tài)。本研究中，6例OA滑膜組織和OASF中的4例表達(dá)IL-23p19 mRNA，且所有陽(yáng)性標(biāo)本的相對(duì)表達(dá)量也明顯低于RA患者。這是由于OA患者滑膜組織中也存在少量的淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞，但明顯少于RA患者，炎性表現(xiàn)較弱，而OA滑膜成纖維細(xì)胞由于在體內(nèi)受到較少的炎性細(xì)胞刺激，其表達(dá)IL-23p19 mRNA會(huì)相應(yīng)地減少或減弱。

激活的嗜酸性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞能分泌前炎癥細(xì)胞因子IL-1β。RA中高表達(dá)的IL-1β參與免疫反應(yīng)的啟動(dòng)，介導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨的破壞降解及骨破壞。IL-1β作為前炎癥細(xì)胞因子有利于中性粒細(xì)胞在組織中的浸潤(rùn)，在RA免疫反應(yīng)的啟動(dòng)中發(fā)揮重要作用。IL-1β通過(guò)抑制基質(zhì)的合成在關(guān)節(jié)軟骨的降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用。除此之外，IL-1β在介導(dǎo)免疫性疾病外周組織的破壞中發(fā)揮重要作用。RA滑膜組織與RASF中兩者均呈正相關(guān)，表明RA的發(fā)病過(guò)程中IL-23與IL-1β的分泌存在密切關(guān)系，IL-23很可能也通過(guò)IL-1β發(fā)揮其在RA致病中的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)IL-23p19 mRNA在RA患者滑膜組織、SF中的表達(dá)量明顯高于OA患者，這與兩者的發(fā)病機(jī)制及滑膜炎癥的病理表現(xiàn)不同有關(guān)。IL-23很可能是RA發(fā)病過(guò)程中重要的促炎因子之一，并且除了在滑膜組織中的單核巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等炎性細(xì)胞表達(dá)外，SF也能表達(dá)；RA滑膜組織與RASF表達(dá)的IL-23p19 mRNA與IL-1β mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系表明SF分泌的IL-23也參與了RA的發(fā)病過(guò)程，除通過(guò)調(diào)節(jié)IL-17的分泌外，調(diào)節(jié)IL-1β的分泌很可能是其發(fā)揮作用的方式之一。這種致炎因子的多來(lái)源性及作用方式的多樣性在RA免疫啟動(dòng)和放大中發(fā)揮重要作用。

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