雙 寶，李 明，李 慧，矯洪濤，王 晴，劉忠華，向文勝*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)司法鑒定中心，哈爾濱 150030）

白細(xì)胞介素-1（IL-1）是最早被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子之一，人們對(duì)它的認(rèn)識(shí)已有三十多年了[1]。隨著分子生物學(xué)和現(xiàn)代免疫學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)IL-1的認(rèn)識(shí)也在不斷加深。目前認(rèn)為IL-1不僅僅具有十分重要的免疫調(diào)節(jié)作用，而且和許多疾病的發(fā)生、發(fā)展有著十分密切的關(guān)系。特別是作為炎癥反應(yīng)中的一個(gè)關(guān)鍵因子，它在各類炎性疾病中的作用更不容忽視。大量的研究結(jié)果表明，人類的許多疾病都伴有局部或全身的IL-1水平升高[2-5]。IL-1Ra是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的天然存在的細(xì)胞因子拮抗劑，是體內(nèi)天然存在的拮抗IL-1生物活性的一種糖蛋白，由152個(gè)氨基酸組成，具有與IL-1Beta相似的結(jié)構(gòu)，但結(jié)合于IL-1受體后不會(huì)引起IL-1效應(yīng)[6]。它為人類進(jìn)一步了解細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)機(jī)制提供了新的思路。而其獨(dú)特的生物學(xué)活性，為人類征服由于IL-1異常升高而導(dǎo)致的各類疾病提供了新的治療手段。

本試驗(yàn)克隆、表達(dá)了IL-1Ra，為IL-1Ra重組菌的高密度發(fā)酵提供了菌株，為IL-1Ra的進(jìn)一步研究應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 胎盤組織

取新鮮的胎盤組織（由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)提供），總量200 mg。取出后置-70℃保存，一周內(nèi)使用。

1.2 菌株和質(zhì)粒

pGEM-T vector（購于Promega公司）；pBV220質(zhì)粒載體和菌株E.coli XL1-Blue及E.coli DH5α是本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 工具酶和試劑

總RNA提取試劑盒TRIzol Reagent、RT-PCR一步反應(yīng)試劑盒（購自GIBCO-BRL公司）；DEPC（購自Invitrogen公司）；DNAmarker DL2000（購自大連寶生物）；pp20-低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)marker II（購自Tiangen博邁德生物）；其他試劑均為Sigma公司或國產(chǎn)分析純生化試劑。

1.4 PCR引物

根據(jù)已報(bào)道的人IL-1Ra基因序列g(shù)i:32576的成熟肽設(shè)計(jì)PCR引物，引物在上海生工合成。其中5′引物中導(dǎo)入Eco RⅠ酶切位點(diǎn)，3′引物中導(dǎo)入PstⅠ酶切位點(diǎn)（劃線部分）。

1.5 胎盤組織總RNA的制備

取胎盤組織100 mg放入1.5mL EP管中，加入1mL TRIzol溶液，冰浴中勻漿數(shù)次后靜置5 min，2～8 ℃ 12000 r·min-1離心10 min，取下層勻漿液移至新EP管中加入200μL氯仿，快速震蕩15 s后室溫放置3 min，2～8 ℃ 11000 r·min-1離心15 min，吸取水相，加入500μL異丙醇，混勻后室溫放置10 min，2～8 ℃ 11000 r·min-1離心10 min，75%乙醇1mL洗滌沉淀，2～8 ℃ 7500 r·min-1離心5 min，棄乙醇真空抽干，溶于20μL無RNA酶的水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）

取5μL所提取的胎盤組織總RNA為模板，利用RT-PCR一步反應(yīng)試劑盒進(jìn)行RT-PCR。

RT-PCR反應(yīng)體系（50μL）:2×Reaction Mix 25μL、 5'引 物（10μmol·L-1）1μL、 3'引 物（10μmol·L-1）1μL、RT/Taq Mix 1μL、模板 5μL、加水到50μL。

反應(yīng)步驟:50℃反應(yīng)20 min；94℃2 min后進(jìn)入以下程序:變性94℃15 s，退火55℃30 s，72℃延伸45 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)后72℃延伸15 min。

1.7 RT-PCR產(chǎn)物回收

依照鼎國生物工程公司DNA片段快速回收試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.8 測(cè)序質(zhì)粒構(gòu)建

將獲得的人IL-1Ra基因PCR回收產(chǎn)物連入測(cè)序載體中。

連接反應(yīng)體系（10μL）:pMD18-T Vector 1μL、純化的IL-1Ra PCR產(chǎn)物4μL、SolutionⅠ 5μL。以上連接體系16℃反應(yīng)30 min后轉(zhuǎn)化XL1-Blue感受態(tài)細(xì)菌，37℃培養(yǎng)過夜。

1.9 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

分別將測(cè)序正確的pGEM-IL-1Ra質(zhì)粒和大腸桿菌pBV220載體質(zhì)粒用Eco RⅠ、PstⅠ進(jìn)行雙酶切，37℃酶切過夜，回收片斷，進(jìn)行片斷連接；轉(zhuǎn)化XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞后提取質(zhì)粒，通過PCR和Eco RⅠ-PstⅠ雙酶切鑒定。

1.10 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將經(jīng)PCR和Eco RⅠ-PstⅠ雙酶切鑒定正確的pBV220-IL-1Ra陽性克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆分別接種含100μg·mL-1氨芐青霉素（Amp）的液體LB培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)6 h后，42℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況。陰性對(duì)照為在同等條件下30℃培養(yǎng)的菌體，具體制樣過程見1.11。

1.11 SDS-PAGE樣品的制備

取0.6mL誘導(dǎo)后及對(duì)照的菌懸液，12000 r·min-1離心收集菌體，棄上清，用0.05mL的蒸餾水懸浮菌體，加入等體積的2倍上樣緩沖液，輕輕混勻，沸水浴10 min，瞬時(shí)離心，取上清用作上樣樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 人IL-1Ra基因的克隆

以人胎盤組織中所提取的總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)一條長度約460bp的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，與預(yù)期大小相符（見圖1）?；厥誖T-PCR產(chǎn)物，與pGEM Vector連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XL1-Blue，中間載體命名為pGEM-IL-1Ra。采用PCR（見圖2）和Eco RⅠ-PstⅠ酶切（見圖3）方法鑒定，取1個(gè)含有插入片斷的陽性克隆。

圖1 RT-PCR的結(jié)果Fig.1 Result of RT-PCR

圖2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.2 PCR assay of recombinant plasmid

圖3 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.3 Digest assay of recombinant plasmid by Eco RⅠ-PstⅠ

2.2 測(cè)序得到的結(jié)果及軟件預(yù)測(cè)

用pGEM Vector的上游通用M13-47引物進(jìn)行測(cè)序（由上海生工完成），結(jié)果見圖4。

測(cè)序結(jié)果與基因序列g(shù)i:32576完全一致。該基因可編碼152個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)序列，通過軟件DNAmaN預(yù)計(jì)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為17 ku?？偘被釘?shù):152，分子質(zhì)量=17089 ku，最大開放閱讀框起始于152氨基酸（456堿基）氨基酸位點(diǎn)1（或DNA位點(diǎn)1）。

圖4 測(cè)序結(jié)果Fig.4 Sequence result

2.3 原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將pGEM-IL-1Ra和表達(dá)載體pBV220用Eco RⅠ-PstⅠ消化后膠回收，連接、轉(zhuǎn)化，重組載體命名為pBV220-IL-1Ra。PCR鑒定出陽性質(zhì)粒pBV220-IL-1Ra兩個(gè)（見圖5），再用雙酶切鑒定確定了這2個(gè)確為陽性質(zhì)粒（見圖6）。

圖5 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.5 PCR assay of recombinant plasmid

圖6 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.6 Digest assay of recombinant plasmid by Eco RⅠ-PstⅠ

2.4 重組人IL-1Ra蛋白在大腸桿菌DH5α中的表達(dá)

將質(zhì)粒pBV220-IL-1Ra轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆接種到含100μg·mL-1氨芐青霉素（Amp）的LB液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)6 h后，42℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況，鑒定表達(dá)產(chǎn)物。陰性對(duì)照為在同等條件下30℃培養(yǎng)的菌體。通過SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白占菌體總蛋白的情況。由圖6可知，誘導(dǎo)后的菌體蛋白在分子質(zhì)量18 ku左右處有一特異性表達(dá)帶，與預(yù)期的17 ku相符，而未經(jīng)誘導(dǎo)的菌體蛋白在相應(yīng)位置上沒有特異性蛋白條帶，說明我們將目的基因在原核生物中成功表達(dá)。再通過成像系統(tǒng)的灰度分析，我們得出，表達(dá)的目的蛋白占總蛋白的20%左右。

圖7 表達(dá)蛋白SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of expression protein

3 討論

細(xì)胞因子一直是人們研究的熱點(diǎn)。2009年朱慧萌等研究了人白細(xì)胞介素17及其家族[7]。同年，姜文博等研究了雞IL-18基因的克隆表達(dá)[8]。IL1-Ra可以與IL1競(jìng)爭(zhēng)受體從而緩解炎癥反應(yīng)，有望成為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，結(jié)膜炎以及其他各種炎癥的新型藥物。所以摸索出一套大量制備IL1-Ra從而用于臨床試驗(yàn)的方法十分重要。在國內(nèi)，許多學(xué)者都對(duì)IL1-Ra進(jìn)行了大量研究。李逸松等研究了人白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑基因轉(zhuǎn)染人顳頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的基因表達(dá)[9]，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)有白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑基因的細(xì)胞與正常細(xì)胞相比有一定差異，但是關(guān)于該蛋白在真核細(xì)胞中的表達(dá)量和表達(dá)后對(duì)細(xì)胞的具體意義卻缺乏探討。李樹剛等對(duì)人白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑蛋白進(jìn)行了初步的分離純化及包涵體的變復(fù)性[6]，結(jié)果得到了有部分活性的蛋白，然而他們對(duì)菌株的信息和誘導(dǎo)的方法描述不夠。張學(xué)述對(duì)人白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑進(jìn)行和克隆和表達(dá)，但是蛋白的表達(dá)量不是很理想[10]。

本研究采用RT-PCR技術(shù)人從胎盤組織提取總RNA，克隆到了人IL1-Ra cDNA，序列分析顯示與其他學(xué)者的研究結(jié)果相同。構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pBV220-IL1-Ra。將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)30℃培養(yǎng)，42℃誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測(cè)所獲得的目的蛋白與預(yù)期一致，目的蛋白的表達(dá)效率在20%以上，得到了IL1-Ra高產(chǎn)菌株。這就為IL1-Ra的大量制備提供了前提。雖然原核表達(dá)的真核蛋白缺少一些特定位點(diǎn)的糖基化，但是只影響蛋白部分的活性[6]，所以本研究結(jié)果為通過高密度發(fā)酵大量制備IL1-Ra以及IL1-Ra的進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本文以人胎盤組織為材料，以從中所提取的總RNA為模板，通過RT-PCR克隆了IL1-Ra成熟肽的編碼基因，總大小為456bp，其測(cè)序結(jié)果與基因序列g(shù)i:32576完全一致。將該基因重組表達(dá)于大腸桿菌中后，得到了大小約為18 ku的蛋白質(zhì)，與推測(cè)的17 ku相符，經(jīng)灰度比較發(fā)現(xiàn)該蛋白約占菌體總蛋白的20%左右。

說明我們成功的在大腸桿菌中高效表達(dá)了IL1-Ra，為IL-1Ra的進(jìn)一步研究及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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