趙莉群,陳中偉,張 偉,王希良,于三科*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西楊陵712100;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100071)

淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,Ng)又稱淋球菌,是淋病的病原體。近年來由于新型耐藥菌株的不斷出現(xiàn)[1-2],使得本菌感染率呈上升趨勢(shì)?？椎鞍?porin PI)是淋球菌主要外膜蛋白,占外膜蛋白總量的60%以上,在淋病的發(fā)病機(jī)制中有重要作用?？椎鞍紫鄬?duì)于淋球菌其他表面抗原成分有很大的優(yōu)勢(shì),如持續(xù)表達(dá)、相對(duì)保守、可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體且能在恢復(fù)期患者陰道分泌液和血清中檢出、能激活補(bǔ)體介導(dǎo)的殺菌活性,還能保護(hù)上皮細(xì)胞免受淋球菌的侵襲[3-4];除此以外,孔蛋白還具有免疫佐劑活性,已成為淋球菌疫苗研制的首選對(duì)象[5]。根據(jù)多肽的定位和對(duì)蛋白酶的敏感性不同,可將PI分為PIA和PIB兩類,PIA和PIB由同一等位基因編碼,其氨基酸序列在不同分離株間的相似性為65%～80%[6]。

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是淋球菌表面唯一的碳水化合物抗原,由于缺少重復(fù)O抗原,又稱為脂寡糖(lipid oligosaccharide,LOS),有資料顯示在正常人血清中存在能與淋球菌脂寡糖結(jié)合的抗體[7]。由于LOS具有強(qiáng)烈的毒性,加之其與宿主碳水化合物有部分相似性,要將純化的淋球菌LOS用于疫苗研究是比較困難的。Gulati等鑒定出淋球菌LOS的保守表位,因可以被Mab2C7識(shí)別,又稱為2C7表位[8]。2C7表位是由Hep1、Hep2及與其相連的半乳糖鏈構(gòu)成的,Mab2C7可以識(shí)別不同淋球菌菌株的LOS。Ngampasutadol等通過大腸埃希菌隨機(jī)肽庫篩選了7個(gè)能與Mab2C7結(jié)合的短肽并證明其中之一PEP1能夠產(chǎn)生由正常人血清介導(dǎo)的補(bǔ)體殺傷作用[9]。本課題組通過人工合成技術(shù)合成上述7個(gè)短肽,經(jīng)抗體效價(jià)及殺菌活性檢測(cè)篩選出保護(hù)性較好的3個(gè)短肽(表位),分別命名為PEP1PEP2PEP7[10]。

本研究克隆淋球菌孔蛋白(PIA、PIB)基因,通過重疊PCR技術(shù)將其與篩選的LOS 2C7優(yōu)勢(shì)表位連接,導(dǎo)入原核表達(dá)載體pET32a,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá),以期為孔蛋白生物活性的研究提供依據(jù)也為淋球菌融合蛋白疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、培養(yǎng)基和質(zhì)粒 淋球菌標(biāo)準(zhǔn)株CMCC29400和CMCC29403均購自中國藥品生物制品檢驗(yàn)檢定所,并按其要求配制淋球菌巧克力培養(yǎng)基及肉湯保存液;E.coil DH5a、E.coil BL21(DE3)、pET32a(+)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所免疫學(xué)研究室保存;PEP1-PEP2-PEP7-PUC57基因由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.1.2 主要試劑 蛋白Marker(low)、DNA Marker DL 2 000、DL 15 000、各類工具酶、pMD-18T vector、膠回收試劑盒以及質(zhì)粒提取試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.3 引物 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司北京合成部合成,共設(shè)計(jì)5條引物:

P1、P2為PIA、PIB共用上下游引物,其中PIA為907 bp,PIB為970 bp;P5、P6為表位引物,片段大小為485 bp;P1、P4、P5、P6為融合基因PIA-表位及PIB-表位共用引物,其中PIA-表位為1 392 bp,PIB-表位為1 455 bp,P1為PIA、PIB上游引物,P6為表位下游引物,P4、P5為PIA/PIB與表位重疊部分引物。下劃線部分分別是BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn),粗體部分為引物的重疊部分。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的培養(yǎng)與收獲 將淋球菌劃線接種于巧克力瓊脂平板,置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h～48 h,每一平板的菌落刮入600 μ L的肉湯保存液中,滴加20%～30%甘油于—70℃保存。

1.2.2 PI基因及PI-表位融合基因的擴(kuò)增 取—70℃保存的淋球菌菌液為模板。PIA、PIB PCR反應(yīng)體系均為25 μ L,其中上游引物P1 10 pmol,下游引物P210 pmol,dNTP 0.4 nmol,10×Ex Buffer 2.5 μ L,Ex Taq 1 U,菌液1 μ L,ddH2O 17 μ L,反應(yīng)參數(shù)為,94℃5 min,94℃1 min,64℃1 min,72℃90 s,循環(huán)29次,72℃7 min。通過重疊PCR技術(shù)[11]構(gòu)建PIA-表位、PIB-表位融合基因,所用引物為P1、P4、P5、P6,反應(yīng)體系、參數(shù)同PIA、PIB。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),純化回收PCR產(chǎn)物。將擴(kuò)增片段分別與克隆載體pMD-18T連接,送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司北京分公司完成測(cè)序。

1.2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切pMD18T-PIA、pMD18T-PIB、pMD18T-PIA-表位、pMD18T-PIB-表位及pET32a后膠回收各片段,所得PIA、PIB、PIA-表位、PIB-表位與pET32a在T 4 DNA連接酶作用下連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH 5α,經(jīng)氨芐青霉素平板、雙酶切、PCR鑒定得陽性重組表達(dá)質(zhì)粒,送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司北京分公司測(cè)序。

1.2.4 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將陽性pET32a-PIA、pET32a-PIB、pET32a-PIA-表位、pET32a-PIB-表位重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3),隨機(jī)挑選單個(gè)白色菌落接種于5mL Amp+LB液體培養(yǎng)基中,37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h～16 h。取少量菌液質(zhì)粒提取,PCR、雙酶切鑒定。取鑒定正確的菌液50 μ L加入5 mL Amp+LB液體培養(yǎng)基中,37℃200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD660為0.6～0.8,加IPTG至終濃度為0.5 mmol/mL,以未加IPTG的菌液作對(duì)照,30℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)4 h,離心收集菌體,SDS-PAGE初步鑒定。

2 結(jié)果

2.1 PI、表位基因及PI-表位融合基因的獲得

擴(kuò)增獲得PIA、PIB表位基因及PIA-表位、PIB-表位及融合基因。瓊脂糖凝膠電泳顯示兩條介于900～1 000 bp的條帶,與PI預(yù)期的片段大小相符;兩條1 000～2 000 bp的條帶,與融合基因PI-表位預(yù)期的片段大小相符;一條450 bp～500 bp的條帶,與表位片段大小相符(圖1)。

圖1 PIA、PIB、PIA-表位、PIB-表位基因及表位PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products of PIA,PIB,PIA-epitope,PIB-epitope and epitope

2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

純化的PCR產(chǎn)物與pMD-18T載體連接,取陽性克隆測(cè)序,對(duì)所得序列進(jìn)行比對(duì)分析證實(shí)無密碼子突變或缺失。pMD18T-PIA、pMD18T-PIB、pMD18T-PIA-表位、pMD18T-PIB-表位經(jīng)BamHⅠ、HindⅢ雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的pET32a連接,PCR、雙酶切均能得到預(yù)期的目的片段(圖2)。結(jié)果表明pET32a-PIA、pET32a-PIB、pET32a-PIA-表位、pET32a-PIB-表位原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖2 PIA、PIB、PIA-表位、PIB-表位基因雙酶切檢測(cè)圖Fig.2 Enzyme digestion products of PIA,PIB and PIA-epitopes and PIB-epitopes

2.3 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果顯示,在40 ku左右出現(xiàn)一條目的條帶,與PIA蛋白大小一致(圖3);在43 ku左右出現(xiàn)一條目的條帶,與PIB蛋白大小一致(圖4);在63 ku左右出現(xiàn)一條目的條帶,與PIA-表位融合蛋白大小一致(圖5);在66 ku左右出現(xiàn)一條目的條帶,與PIB-表位融合蛋白大小一致(圖6)。

圖3 PIA超聲波破碎蛋白SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of ultrasonic PIA proteins

圖4 PIB超聲波破碎蛋白SDS-PAGE圖Fig.4 SDS-PAGE analysis of ultrasonic PIB proteins

圖5 PIB-表位超聲波破碎蛋白SDS-PAGE圖Fig.5 SDS-PAGE analysis of ultrasonic PIB-epitope proteins

圖6 PIA-表位超聲波破碎蛋白SDS-PAGE圖Fig.6 SDS-PAGE analysis of ultrasonic PIA-epitope proteins

3 討論

選擇合適的抗生素治療對(duì)于控制淋病來說是個(gè)很重要的措施,而近10年來,淋球菌對(duì)多種抗生素的耐藥性不斷增強(qiáng)[12,13]。在美國,曾用氟喹諾酮及阿奇霉素等口服類抗生素進(jìn)行治療,而現(xiàn)在已不被推薦使用,原因是考慮到藥物的耐藥性及臨床治療中的不足[14]。疫苗接種無疑是預(yù)防及控制淋病最為有效的措施。然而,淋球菌抗原的高度變異性一直是阻撓疫苗研制的一大難題,那些僅能激發(fā)機(jī)體保護(hù)性免疫同時(shí)又高度保守的淋球菌抗原是解決這一難題的關(guān)鍵所在,孔蛋白就是這樣一種具有應(yīng)用前景的候選抗原。本研究從淋球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株中擴(kuò)增出孔蛋白基因PIA、PIB,通過重疊PCR技術(shù)將PEP1-PEP2-PEP7基因串聯(lián)構(gòu)建在PIA、PIB上形成融合基因PIA-表位、PIB-表位,導(dǎo)入克隆載體pMD-18T,經(jīng)PCR鑒定、核苷酸測(cè)序證實(shí)融合基因構(gòu)建成功。測(cè)序結(jié)果與GenBank中已知序列進(jìn)行比較,同源性為100%,表明擴(kuò)增的PIA和PIB基因序列相當(dāng)保守。在表達(dá)載體方面,我們選擇pET32a載體是因?yàn)槠涫且宰陨硭鶐鹗济艽a子ATG與6個(gè)組氨酸和外源基因表達(dá)為融合蛋白的,并且含有可以改善目的蛋白的溶解性及正確折疊的硫氧還蛋白標(biāo)簽(T rx-tag),為了方便目的蛋白分離及純化,pET32a載體還帶有His°Tag與S°Tag兩個(gè)標(biāo)簽蛋白。在本研究中,pET32a與目的基因連接后,經(jīng)酶切分析、PCR鑒定及核苷酸測(cè)序證實(shí)原核表達(dá)載體構(gòu)建成功,這為后續(xù)的蛋白純化奠定了很好的基礎(chǔ)。在蛋白表達(dá)方面,我們對(duì)IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、溫度等條件進(jìn)行了一系列摸索,但PIA、PIB始終以包涵體形式表達(dá)且在30℃、IPTG為0.5 mmol/mL的情況下誘導(dǎo)4 h表達(dá)量最大,而融合蛋白PIA-表位、PIB-表位無論在何種條件下,上清中均有表達(dá),但在30℃、IPTG為0.5 mmol/mL的情況下誘導(dǎo)4 h時(shí)上清中表達(dá)量最大,沉淀中幾乎沒有,這種情況的出現(xiàn)可能與加入表位后引發(fā)的PIA、PIB蛋白質(zhì)空間構(gòu)象發(fā)生改變,從而形成可溶性的融合蛋白PIA-表位、PIB-表位有關(guān)。

綜上所述,本研究成功構(gòu)建了淋球菌外膜蛋白PI和脂寡糖優(yōu)勢(shì)表位融合基因的原核表達(dá)載體,并能有效表達(dá)PI-表位融合蛋白,為后續(xù)的包涵體變性復(fù)性、蛋白純化及動(dòng)物免疫原性評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ),也為淋球菌亞單位疫苗的研制提供依據(jù)。

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