胡雅輝，孫書娥，高陽

（1.湖南省植物保護研究所，湖南 長沙 410125；2.中南大學 隆平分院，湖南 長沙 410125）

煙粉虱常常對黃瓜、番茄、茄子、蘿卜、紅菜薹、甘藍等蔬菜造成危害，同時也為害棉花。依據煙粉虱的寄主范圍、為害習性、傳毒能力的差異等，煙粉虱被分為多種生物型，其中B型和Q型為常見生物型[1-3]，是近年來從國外傳入并在中國廣大地區(qū)為害的入侵種群。對煙粉虱生物型的鑒定方法有4種[4]，即銀葉反應、酯酶電泳分析、提取煙粉虱DNA進行隨機多態(tài)性DNA擴增、進行區(qū)段基因的測序等。筆者于2009—2010年對長沙市煙粉虱的種群動態(tài)進行了調查，并通過線粒體細胞色素氧化酶I基因COI測序，對長沙市煙粉虱的生物型進行了鑒定，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 煙粉虱種群調查

于2009年4—11月和2010年4—10月，每半個月對長沙市東郊的番茄、黃瓜、棉花、甘藍和紅菜薹等作物葉片上的煙粉虱進行1次調查，每次調查3～4種，每種寄主植物隨機調查10株，每株隨機調查2片葉，記錄寄主植物葉片上的煙粉虱成蟲數量。

1.2 煙粉虱mtDNACOⅠ基因序列測定

從長沙市芙蓉區(qū)湖南省植物保護研究所的棉花和湖南省蔬菜研究所的大棚黃瓜分別采集煙粉虱成蟲100頭，研磨后，加入200 μL DNA提取液（長沙維爾生物技術公司產品），研磨成勻漿，8 000 r/min離心3 min，收集上清液，加入1倍體積的冷卻無水乙醇，顛倒6次，靜置3 min，吸棄溶液，加入75%乙醇洗1次，吸棄溶液，加入100 μL無菌雙蒸水，－4 ℃保存，備用。

通用引物對 C1-J-2195[5-6]（5′-TTBATTTTT TGGTCATCCAGAAGT-3′）和 R2819[6]（5′-CTGA ATATCGAGGCATTCC-3′） 用于擴增Q型煙粉虱的COI基因片段；引物對 C1-J-2195和 L2-N-3014[5]（5'-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA -3'）用于擴增B型煙粉虱的COI基因片段，引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應總體積為20 μL，反應體系為：10×Buffer 2 μL，25 mmol/L Mg2+1 μL，0.25 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L的引物各1 μL，5 U/μL的Taq酶0.2 μL，2 μL模板，雙蒸水10.3 μL。反應程序為：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR結束后，取8 μL擴增產物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物直接送長沙維爾生物技術公司測序。

1.3 數據分析

對主要寄主植物葉片上煙粉虱成蟲數量平均值作煙粉虱種群季節(jié)動態(tài)圖。將從煙粉虱中擴增的基因片段測序結果在NCBI網頁上進行Blast搜索，找出數據庫中相似度高的煙粉虱的COI基因序列。

2 結 果

2.1 長沙市煙粉虱種群動態(tài)

圖1 長沙煙粉虱種群發(fā)生動態(tài)Fig. 1 Population dynamic of Bemisia tabaci from host plant leaves in Changsha

2009年和2010年，長沙市煙粉虱均有2個發(fā)生高峰，第1個高峰發(fā)生在5—6月，第2個高峰發(fā)生在9月（圖1），2年種群發(fā)生動態(tài)基本一致，2010年煙粉虱種群發(fā)生比2009年略早。2010年煙粉虱種群密度為每葉2～30頭，比2009年（每葉1～23頭）高，2010年5月下旬和6月上旬煙粉虱成蟲數量與2009年相比，差異明顯，其余月份差異不大。

2.2 長沙市煙粉虱的生物型

將第1對引物C1-J-2195和R2819對煙粉虱DNA進行 PCR擴增，經凝膠電泳檢測，成功擴增出1段600 bp左右的基因片段（圖2），而將第2對引物C1-J-2195和L2-N-3014對煙粉虱DNA進行PCR擴增，則無擴增條帶。擴增的目的基因測序結果與NCBI上杭州煙粉虱COI（GU384316.1）、呼和浩特煙粉虱COI（GU384318.1）、武漢煙粉虱COI（GU384314.1）序列同源性為 100%，與美國 Frolida煙粉虱COI（FJ188570.1）序列僅相差1個堿基（圖3），而杭州、呼和浩特、武漢和美國Frolida煙粉虱種群均為Q型，因此推斷長沙煙粉虱種群生物型為Q型。

圖2 PCR產物瓊脂糖電泳結果Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of PCR products

圖 3 長沙煙粉虱與其他地區(qū)Q型煙粉虱COⅠ基因部分片段序列對比Fig.3 Contrast of COI gene sequences between from B. tabaci in Changsha and Q biotype B. tabaci in other region

3 討 論

長沙市露地蔬菜和棉花上煙粉虱種群發(fā)生高峰在春、秋兩季，主要是因為溫度適宜煙粉虱種群的發(fā)生和繁殖。長沙冬季氣溫在5 ℃以下、夏季氣溫在35 ℃以上，都將直接導致煙粉虱發(fā)育停滯[7]?；诖?，5月初如發(fā)現(xiàn)煙粉虱，需及時防治，一旦錯過時機，煙粉虱很有可能在短時間內暴發(fā)為害。值得注意的是，溫室大棚內蔬菜上煙粉虱的種群密度往往高于露地蔬菜，尤其到10、11月，露地寄主植物上煙粉虱種群密度下降時，溫室大棚內黃瓜上的煙粉虱成蟲種群密度還可維持在每葉 500頭以上。

由于用B型煙粉虱COI基因的特異PCR引物無法擴增出目的基因，因此，斷定從湖南省植物保護研究所和湖南省蔬菜研究所采集的煙粉虱標本里沒有B型煙粉虱。而第1對引物擴增出來的目的基因序列與其他Q型煙粉虱的COI基因序列同源性超過99%，因此可以判定長沙市煙粉虱種群生物型為Q型。2006年以前，湖南省內煙粉虱生物型為B型和非B型[4]，并沒有發(fā)現(xiàn)Q型。但是，隨著時間的推移，長沙市煙粉虱的生物型已經發(fā)生了變化，可見，在長沙Q型煙粉虱較B型煙粉虱更具競爭力。有結果顯示，Q型煙粉虱在其他省份也有逐步取代B型煙粉虱的趨勢[8]。

關于煙粉虱不同生物型的競爭機制，有過一些研究[9]，比較B型和Q型煙粉虱的生物學特性發(fā)現(xiàn)，Q型煙粉虱雌蟲產卵量、化蛹數、成蟲羽化率等明顯比B型煙粉虱高；Q型煙粉虱在17 ℃和33 ℃時平均世代歷期（分別為46、17 d）比B型煙粉虱的（分別為49、18 d）要短[10]。在番茄上，Q型煙粉虱比B型煙粉虱均具有更強的危害性[11]。還有一些研究[12]表明，在沒有農藥選擇壓力下，Q型煙粉虱對新類煙堿農藥的抗性比較穩(wěn)定，而B型煙粉虱對新類煙堿農藥的抗性則會急劇下降[12]。根據Q型煙粉虱的這些生物學特性，應當較多考慮非化學的防治措施，比如懸掛黃板等，以免產生抗藥性；不應當依賴化學農藥，以免再生猖獗。

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