(中國(guó)科學(xué)院 煙臺(tái)海岸帶可持續(xù)發(fā)展研究所 山東 煙臺(tái),264003)

21世紀(jì)是海洋開(kāi)發(fā)的世紀(jì),我國(guó)將更加關(guān)注在可持續(xù)發(fā)展前提下的海洋資源的合理開(kāi)發(fā)和海洋環(huán)境保護(hù),特別是更多地關(guān)注近海生態(tài)環(huán)境的監(jiān)測(cè)和保護(hù)。用于海洋監(jiān)測(cè)的生物傳感器技術(shù)是一種基于生物敏感元件對(duì)污染物的生理、生化、細(xì)胞反應(yīng)而建立起來(lái)的海洋生物監(jiān)測(cè)技術(shù),有很高的靈敏度,并可與生物個(gè)體的生長(zhǎng)、繁殖、代謝、存活等指標(biāo)直接聯(lián)系起來(lái),從而有可能就污染對(duì)生物種群、群落乃至整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的影響做出評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)[1]。監(jiān)測(cè)水質(zhì)新型赤潮預(yù)警系統(tǒng)——冷光藻青菌生物傳感器的研制成功,突出顯示了生物傳感器應(yīng)用于海洋監(jiān)測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。迄今為止,人們已經(jīng)開(kāi)發(fā)了很多用于環(huán)境監(jiān)測(cè)的傳感器(生物傳感器和其他類型傳感器),生物傳感器具有特異性好、靈敏度高、分析速度快、能在復(fù)雜體系中在線連續(xù)監(jiān)測(cè)等特點(diǎn),被廣泛用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、食品安全及環(huán)境監(jiān)測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域。其中,在環(huán)境檢測(cè)中的應(yīng)用尤為令人矚目。人們已經(jīng)開(kāi)始研究用于海洋監(jiān)測(cè)的生物傳感器,本文將對(duì)生物傳感器在海洋監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用做一總結(jié)。

1 生物傳感器定義及分類[2]

生物傳感器是一門集微電子學(xué)、材料科學(xué)、生物技術(shù)等學(xué)科為一體的高新技術(shù)。它是由分子識(shí)別元件(感受器)和與之結(jié)合的信號(hào)轉(zhuǎn)換器(換能器)兩部分組成的分析工具或系統(tǒng)。前者可以是生物體成分(酶、抗原、抗體、激素、DNA)或生物體本身(細(xì)胞、細(xì)胞器、組織),它們能特異地識(shí)別各種被測(cè)物質(zhì)并與之反應(yīng);后者主要有電化學(xué)電極、離子敏感場(chǎng)效應(yīng)晶體管、熱敏電阻器、光電管、光纖、壓電晶體等,其功能為將敏感元件感知的生物化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓽y(cè)量的電信號(hào)。生物傳感器按所用分子識(shí)別元件的不同,可分為酶?jìng)鞲衅鳌⑽⑸飩鞲衅?、組織傳感器、細(xì)胞傳感器、免疫傳感器等;按信號(hào)轉(zhuǎn)換元件的不同,可分為電化學(xué)生物傳感器、半導(dǎo)體生物傳感器、測(cè)熱型生物傳感器、測(cè)光型生物傳感器、測(cè)聲型生物傳感器等;按對(duì)輸出電信號(hào)的不同測(cè)量方式,又可分為電位型生物傳感器、電流型生物傳感器和伏安型生物傳感器。本文按檢測(cè)對(duì)象的不同對(duì)生物傳感器(技術(shù))在海洋監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行簡(jiǎn)要總結(jié)。

2 應(yīng)用于海洋領(lǐng)域的生物傳感技術(shù)研究進(jìn)展

2.1 營(yíng)養(yǎng)鹽的檢測(cè)

氮、磷、硅等植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量過(guò)多所引起的水質(zhì)污染現(xiàn)象——富營(yíng)養(yǎng)化,能夠加速水生生物特別是藻類的大量繁殖,使生物種群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,生物多樣性破壞,從而導(dǎo)致水體生態(tài)平衡遭到破壞。這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括硝酸鹽、亞硝酸鹽、銨鹽、磷酸鹽、硅酸鹽等,及時(shí)監(jiān)控這些營(yíng)養(yǎng)鹽的含量對(duì)于預(yù)警赤潮等是非常必要的。已有多篇酶[3-7]和微生物[8-10]傳感器用于檢測(cè)硝酸鹽和亞硝酸鹽的報(bào)道。檢測(cè)硝酸鹽和亞硝酸鹽的酶?jìng)鞲衅髦饕褂孟跛猁}和亞硝酸鹽的還原酶,這些酶?jìng)鞲衅鞯氖褂弥饕芟抻诿傅目衫枚纫约懊傅某杀綶11],硝酸鹽和亞硝酸鹽還原酶已經(jīng)可以從很多生物源中分離出來(lái)[12-14],利用溶膠-凝膠固定酶可以避免酶活性的損失[14]。Larsen等[15]在傳感器中固定反硝化細(xì)菌(不含一氧化二氮還原酶),反硝化細(xì)菌將硝酸鹽還原為一氧化二氮,使用電化學(xué)檢測(cè)一氧化二氮,鑒于該傳感器在淡水和海水中對(duì)亞硝酸鹽和硝酸鹽均有良好的響應(yīng),因此,已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商品化(http：//www.unisense.com)。用于檢測(cè)銨鹽的生物傳感器并不多,比較常見(jiàn)的是檢測(cè)銨鹽的離子選擇性電極和化學(xué)傳感器,但是,由于海水中高濃度的干擾離子使這些傳感器不能直接應(yīng)用于海水的檢測(cè)。目前文獻(xiàn)中還未見(jiàn)有關(guān)硅酸鹽離子傳感器的報(bào)道。Amine 等[16]綜述了有關(guān)檢測(cè)磷酸鹽、硝酸鹽等的生物傳感器,檢測(cè)磷酸鹽的生物傳感器主要是基于各種磷酸酯酶的生物傳感器。盡管已有諸多的傳感器用于檢測(cè)磷酸鹽,據(jù)我們所知,至今沒(méi)有一臺(tái)傳感器能夠用于海水中磷酸鹽的檢測(cè)(因海水中多種離子的存在,會(huì)對(duì)磷酸鹽的檢測(cè)造成干擾)。開(kāi)發(fā)能夠用于海水中磷酸鹽檢測(cè)的生物傳感器將會(huì)填補(bǔ)該領(lǐng)域的一項(xiàng)空白。

2.2 生物物種檢測(cè)

分子生物學(xué)以及相關(guān)生物傳感器的迅速發(fā)展,拓展了它們?cè)诃h(huán)境微生物多相分類中的應(yīng)用。尤其在識(shí)別幼小的物種或者形態(tài)不明顯的菌株等方面發(fā)揮了重要作用。同時(shí)它們?cè)谏镂锓N資源的分子系統(tǒng)和進(jìn)化的研究、新的生物物種資源的發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)利用,如特殊生態(tài)環(huán)境中新的未知生物類群的發(fā)現(xiàn)、分類鑒定及應(yīng)用等方面也開(kāi)始大顯身手。

Lee[17]等報(bào)道了基于化學(xué)發(fā)光的生物傳感器用于檢測(cè)赤潮生物海洋褐胞藻(Chattonella marina)。2-甲基-6-(p-甲氧苯基)-3,7-二氫咪唑并[1,2-α]吡嗪-3-酮在超氧陰離子存在的情況下可以作為化學(xué)發(fā)光探針,褐胞藻能夠釋放超氧陰離子,通過(guò)檢測(cè)超氧陰離子來(lái)間接測(cè)定褐胞藻的濃度。他們還用該傳感器測(cè)定了赤潮異彎藻 (Heterosigma akashiwo),骨條藻(Skeletonema costatum),角毛藻(Chaetoceros sociale),紫球藻(Porphyridium cruentrum)和褐胞藻(Chattonella antique)。其結(jié)果是該傳感器只對(duì)褐胞藻類有特征響應(yīng),對(duì)其他藻類沒(méi)有響應(yīng)。目前,人們研發(fā)了很多基于核酸雜交技術(shù)的生物傳感器、DNA芯片和陣列,利用雜交探針來(lái)識(shí)別物種的特異序列。已有多篇綜述[18-22]概括了這些傳感器、芯片和陣列的研究進(jìn)展。Monterey 海灣水產(chǎn)研究所一直致力于研究“環(huán)境樣品處理器”,現(xiàn)在該儀器第二代已經(jīng)研究成功并投入使用(http：//www.mbari.org/ESP)(圖1和圖2),該儀器的核心技術(shù)就是利用DNA探針陣列實(shí)時(shí)原位的檢測(cè)微生物及其基因產(chǎn)物,其中最常用的技術(shù)就是夾心雜交測(cè)定和酶聯(lián)免疫測(cè)定。研究該儀器主要目的是利用基因技術(shù)識(shí)別海洋微生物,以此進(jìn)一步研究它們?cè)谏锏厍蚧瘜W(xué)循環(huán)中的作用。目前,該儀器可以原位收集和分析海洋下層水樣,使用分子探針自動(dòng)識(shí)別微生物和它的基因產(chǎn)物。另外,該儀器已經(jīng)實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)程控制,可以實(shí)時(shí)、在線、長(zhǎng)期在海水中進(jìn)行作業(yè)。該儀器的研制成功,不但節(jié)約了收集樣品的時(shí)間,也大大降低了人們?cè)诤Ｑ笊锓矫嫜芯康某杀?為海洋生物分類識(shí)別的研究提供了更有利的技術(shù)支撐。

圖1 環(huán)境樣品處理(http：//www.mbari.org/ESP)

圖2 第二代環(huán)境樣品處理器核心部件(http：//www.mbari.org/ESP)

2.3 污染物的檢測(cè)

海洋污染物主要指經(jīng)由人類活動(dòng)直接或間接進(jìn)入海洋環(huán)境,并能產(chǎn)生有害影響的物質(zhì)或能量。海洋中的污染物種類多,數(shù)量大,且危害深遠(yuǎn)。因此,需要嚴(yán)格控制這些污染物的排放,這些污染物主要包括石油及其產(chǎn)品,農(nóng)藥,防污物料,重金屬離子,毒素等。

2.3.1 有機(jī)農(nóng)藥

Kr?ger等[23]描述了生物傳感器在海洋監(jiān)測(cè)要素如營(yíng)養(yǎng)鹽、抗生物污染試劑、殺蟲劑、激素干擾劑以及分子生物分類系統(tǒng)中的應(yīng)用。分析和預(yù)測(cè)了將來(lái)用于海洋監(jiān)測(cè)的傳感體系所需要的條件以及可能面臨的挑戰(zhàn)。最近, Hildebrandt等[24]制作了一種便攜式傳感器,該傳感器可以檢測(cè)海水以及食品中的氯吡硫磷(有機(jī)磷的一種)和氨基甲酸酯。他們將乙酰膽堿酯酶固定于絲網(wǎng)印刷電極上,這樣使得成本較低,利于大批量生產(chǎn)和一次性使用。Zhang等[25]利用層層自組裝技術(shù)修飾的多壁碳納米管和乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)了海水中的蟲螨威(氨基甲酸酯的一種),其檢測(cè)限可達(dá)到10-11g/L。用于檢測(cè)殺蟲劑的生物傳感器大部分是基于乙酰膽堿酯酶的抑制傳感器[26-27],其主要原因是乙酰膽堿酯酶的成本較低。另外,還有一些免疫傳感器也可用于殺蟲劑的檢測(cè),如 Penalva等[28]制作的檢測(cè)包含 Irgarol的殺蟲劑的免疫傳感器,可用于有機(jī)提取物和海水樣品檢測(cè)。Mallat等[29-30]研發(fā)了用于檢測(cè)河口水樣品中的百草枯和異丙隆的生物傳感器,檢測(cè)限可達(dá)到0.1 μg/L。一些細(xì)胞傳感器[31-32]可用于莠去津、西瑪津、異丙隆、敵草隆等的檢測(cè),其檢測(cè)限可達(dá)1 μg/L。利用細(xì)胞傳感器檢測(cè)這些物質(zhì)不但比較靈敏,而且能夠得到有關(guān)生物利用度和生理反應(yīng)的一些信息,缺點(diǎn)是這些傳感器不像酶?jìng)鞲衅?只對(duì)一種物質(zhì)有特異性響應(yīng),通常被一些重金屬所干擾,所以也有不利的一方面。

2.3.2 含油污水

海洋監(jiān)控的另一個(gè)主要方向是污染海洋環(huán)境的油氣田采出水(也叫油氣田含油污水)和油井的鉆井液。通常,采出水的成分非常復(fù)雜,其中包含防沫劑、生物殺滅劑、阻蝕劑和破乳劑等,這些物質(zhì)均能產(chǎn)生一系列急性的或者慢性的毒性效應(yīng)。對(duì)于這樣一個(gè)復(fù)雜的體系,若使用相關(guān)的化學(xué)或者物理技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè),雖然比較靈敏和準(zhǔn)確,專一性也較好,但是它們不能提供這些污染物的生物相容性數(shù)據(jù)和污染物對(duì)生物體系的影響以及對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。而生物傳感體系非常適用于微生物的一般毒性測(cè)試,從而可以得到一系列與生物體系和環(huán)境相關(guān)的數(shù)據(jù)。如LaGier等[33]報(bào)道的電化學(xué)生物傳感器用于檢測(cè)微生物污染物以及毒藻和 S?rensen等報(bào)道細(xì)胞傳感器用于毒性的測(cè)試等[34]。

2.3.3 防污物料

另一個(gè)廣泛污染海水水體和沉積物的污染物是防污物料——有機(jī)錫化合物如三丁基錫(TBT)。有報(bào)道稱ng/L級(jí)濃度的有機(jī)錫即會(huì)對(duì)水中生物產(chǎn)生毒害作用[35],因此這些化合物已被國(guó)際海事組織禁止使用。有機(jī)錫致毒濃度很低,但是目前所研究的生物傳感器對(duì)有機(jī)錫的最低檢測(cè)限還不能檢測(cè)到致毒的最低濃度,仍有待于進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)研究。Durand等[36]報(bào)道的基于細(xì)菌生物發(fā)光技術(shù)的生物傳感器對(duì) TBT的檢測(cè)限為26 μg/L,對(duì)DBT(二丁基錫)的檢測(cè)限為0.03 μg/L。Thouand等在第8次世界生物傳感器大會(huì)上報(bào)道的在流動(dòng)體系內(nèi)將細(xì)菌固定于芯片上,采用發(fā)光檢測(cè)的生物傳感器對(duì) TBT的檢測(cè)限可達(dá)到325 ng/L。這已經(jīng)是報(bào)道的最低檢測(cè)限,由此看來(lái),用于檢測(cè)有機(jī)錫的生物傳感器技術(shù)仍需進(jìn)一步提升。

2.3.4 重金屬污染物

海洋環(huán)境中的痕量金屬具有雙重作用：在海洋的某些區(qū)域,它們是促進(jìn)藻類生長(zhǎng)的必需物質(zhì),而在其他的一些環(huán)境中又可以造成污染。文獻(xiàn)中報(bào)道了很多生物傳感器可用于金屬離子的檢測(cè),例如,Zeng等[37-38]報(bào)道的使用基于熒光的光纖生物傳感器實(shí)時(shí)檢測(cè)海水中游離的 Cu2+濃度,檢測(cè)限可以達(dá)到0.1 pmol/ L。但是此傳感器測(cè)量幾個(gè)小時(shí)后,由于生物污染以及Zn或者Hg的干擾而不穩(wěn)定;Cathy等[39]制作的 Parabactin生物傳感器對(duì) Fe(III)的檢測(cè)限為1 nmol/L;使用algae C.vulgaris細(xì)胞制作的傳感器用來(lái)檢測(cè)鎘離子[40];酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)鋅離子[41];DNA傳感器檢測(cè)鉛離子[42]。在海洋化學(xué)中,痕量金屬的形態(tài)與分析是一個(gè)很廣闊的領(lǐng)域,鑒于海水中存在多種元素,痕量金屬的分析常常受到基體效應(yīng)和其他共存離子的干擾,因此研究選擇性好的檢測(cè)限低的生物傳感器是未來(lái)的發(fā)展方向。

2.3.5 生物毒素

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展和有害赤潮的頻繁爆發(fā),藻類和貝類的生物毒素成為人們?nèi)諠u關(guān)注的問(wèn)題。Campàs等[43]在近期發(fā)表的關(guān)于生物傳感器檢測(cè)海洋毒素——評(píng)價(jià)海產(chǎn)品的安全性中介紹了海洋毒素的分類以及他們所產(chǎn)生的毒性效應(yīng),海洋毒素主要包括：腹瀉性貝毒(DSP),麻痹性貝毒(PSP),記憶缺損性貝毒(ASP),神經(jīng)性貝毒(NSP),Azaspiracid shellfish poisoning (AZP) toxins(一種新毒素,主要分布在歐洲),雪卡毒素(CFP),河豚毒素(PFP)等幾大類型,綜述了用于檢測(cè)這些毒素的生物/分析技術(shù),著重描述了生物傳感器在檢測(cè)這些毒素方面的一些應(yīng)用。這些生物傳感器主要包括：Na+離子通道生物傳感器用于檢測(cè) PSP類貝毒;免疫傳感器用于檢測(cè)剛田酸(DSP的一種);酶抑制傳感器用于檢測(cè)剛田酸等。展望了生物傳感器作為篩選海產(chǎn)品毒素生物工具的美好前景。近期,Steven等[44]報(bào)道的檢測(cè)軟骨藻酸的 SPR(表面等離子共振)便攜式生物傳感體系檢測(cè)限可達(dá) 3 μg/L,定量范圍在4～60 μg/L,此傳感體系可用于濃縮的海藻提取液和海水中高濃度軟骨藻酸的檢測(cè)。Marquette等[45]制作了一種化學(xué)發(fā)光免疫傳感器用于檢測(cè)貝類中的剛田酸。目前,在絲網(wǎng)印刷電極上的酶聯(lián)免疫測(cè)定是毒素測(cè)定的一個(gè)重要發(fā)展方向,這主要是因?yàn)榻z網(wǎng)印刷電極成本低,適于一次性和室外環(huán)境中使用,同時(shí),檢測(cè)限可以達(dá)到μg/L級(jí)甚至更低。生物傳感技術(shù)在海洋監(jiān)測(cè)的應(yīng)用及潛在應(yīng)用總結(jié)在表1中。

表1 海洋中的分析物和使用的傳感器類型總結(jié)

3 總結(jié)

現(xiàn)代傳感技術(shù)是發(fā)展海洋監(jiān)測(cè)高技術(shù)的發(fā)展方向,是海洋現(xiàn)場(chǎng)快速自動(dòng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的核心部件,也是制約海洋監(jiān)測(cè)技術(shù)水平的主要因素之一。雖然已有很多的傳感體系對(duì)海洋分析具有潛在的應(yīng)用價(jià)值,然而專門為海洋測(cè)定而設(shè)計(jì)的傳感器的數(shù)目非常少[46-47]。傳感器的應(yīng)用仍然主要集中在醫(yī)療診斷,過(guò)程控制,制藥產(chǎn)品,食品安全分析和國(guó)防等方面。到目前為止,真正用于海洋環(huán)境現(xiàn)場(chǎng)在線監(jiān)測(cè)的傳感器只有溶解氧、電導(dǎo)率、氧化還原電位、濁度、氨氮,而且這些傳感器還有不少技術(shù)問(wèn)題需要解決,特別是用于定點(diǎn)連續(xù)長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)的傳感器。開(kāi)發(fā)和研究適用于海洋監(jiān)測(cè)的生物傳感器,不但可以滿足監(jiān)測(cè)要素的特別需要,還可以反映海洋復(fù)雜多變的現(xiàn)狀。通過(guò)選擇新的微生物物種以及基因工程和分子生物學(xué)的引入,可以大幅度推動(dòng)生物傳感器的發(fā)展。生物傳感器在海水中進(jìn)行作業(yè),迫使生物傳感器必須提高其選擇性、穩(wěn)定性、靈敏度等,另外,多種信息的同時(shí)獲得要求生物傳感器向集成化發(fā)展。總之,大部分用于海洋監(jiān)測(cè)的生物傳感技術(shù)主要存在以下問(wèn)題：(1)由于海水中多種離子的存在,導(dǎo)致傳感器對(duì)某種檢測(cè)物的靈敏度和選擇性不夠;(2)海水的高鹽度會(huì)對(duì)傳感器的外殼以及探頭等造成腐蝕,對(duì)用于定點(diǎn)長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)的傳感器必須解決這一問(wèn)題;(3)要想監(jiān)測(cè)海洋復(fù)雜多變的情況,必須同時(shí)監(jiān)測(cè)多個(gè)要素,這就要求傳感器要集成大量器件以獲得多個(gè)參數(shù)。

[1]朱光文.我國(guó)海洋監(jiān)測(cè)技術(shù)研究和開(kāi)發(fā)的現(xiàn)狀和未來(lái)發(fā)展 [J].海洋技術(shù),2002,21(2)：45-46.

[2]費(fèi)學(xué)寧.現(xiàn)代水質(zhì)監(jiān)測(cè)分析技術(shù) [M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2004：367-367.

[3]Aylott J W,Richardson,D J,Russell,D A.Optical biosensing of nitrate ions using a sol-gel immobilized ni-trate reductase [J].Analyst,1997,122(1)：77-80.

[4]Chen H,Mousty C,Cosnier S,et al.Highly sensitive nitrite biosensor based on the electrical wiring of nitrite reductase by [ZnCr-AQS]LDH [J].Electrochemistry Communications,2007,9：2240-2245.

[5]Zhang Z Q,Xia S Q,Leonard D,et al.A novel nitrite biosensor based on conductometric electrode modified with cytochrome c nitrite reductase composite membrane [J].Biosensors and Bioelectronics,2009,24(6)：1574-1579.

[6]Almeida M G,Silveira C M,Moura J J G.Biosensing nitrite using the system nitrite redutase/Nafion/methyl viologen - A voltammetric study [J].Biosensors and Bioelectronics,2007,22(11)：2485-2492.

[7]Zhang Z Q,Xia S Q,Leonard D,et al.A novel nitrite biosensor based on conductometric electrode modified with cytochrome c nitrite reductase composite membrane [J].Biosensors and Bioelectronics,2009,24(6)：1574-1579.

[8]Mbeunkui F,Richaud C,Etienne A L,et al.Bioavailable nitrate detection in water by an immobilized luminescent cyanobacterial reporter strain[J].Applied Microbiology and Biotechnology ,2002,60(3)：306-312.

[9]Nielsen M,Larsen L H,Jetten M S M,et al.Bacterium-based NO2- biosensor for environmental applications [J].Applied and Environmental Microbiology,2004,70(11)：6551-6558.

[10]DeAngelis K M,Ji P S,Firestone M K,et al.Two novel bacterial biosensors for detection of nitrate availability in the rhizosphere [J].Applied and Environmental Microbiology,2005,71(12)：8537-8547.

[11]Dutt J,Davis J.Current strategies in nitrite detection and their application to field analysis [J].Journal of Environmental Monitoring,2002,4(3)：465-471.

[12]Sasaki S,Karube I,Hirota N,et al.Application of nitrite reductase from Alcaligenes faecalis S-6 for nitrite measurement [J].Biosensors and Bioelectronics,1998,13(1)：1-5.

[13]Wu Q,Storrier G D,Pariente F,et al.A nitrite biosensor based on a maltose binding protein nitrite reductase fusion immobilized on an electropolymerized film of a pyrrole-derived bipyridinium[J].Analytical Chemistry,1997,69(23)：4856-4863.

[14]Ferretti S,Lee S K,MacCraith B D,et al.Optical biosensing of nitrite ions using cytochrome cd1 nitrite reductase encapsulated in a sol-gel matrix [J].The Analyst,2000,125(11)：1993-1999.

[15]Larsen L H,Kjaer T,Revsbech N P.A Microscale NO3-biosensor for environmental applications [J].Analytical Chemistry,1997,69(17)：3527-3531.

[16]Amine A,Palleschi G.Phosphate,nitrate,and sulfate biosensors [J].Analytical Letters,2004,37(1)：1-19.

[17]Lee T,Gotoh N,Niki E,et al.Chemiluminescence detection of red tide phytoplanktonChattonella marina[J].Analytical Chemistry,1995,67(1)：225-228.

[18]Khanna V K.Existing and emerging detection technologies for DNA (deoxyribonucleic acid) finger printing,sequencing,bio- and analytical chips：a multidisciplinary development unifying molecular biology,chemical and electronics engineering [J].Biotechnology Advances,2007,25(1)：85-98.

[19]Drummond T G,Hill M G,Barton J K.Electrochemical DNA sensors [J].Nature Biotechnology,2003,21(10)：1192-1199.

[20]Teles F R R,Fonseca L R.Trends in DNA biosensors[J].Talanta,2008,77(2)：606-623.

[21]Palchetti I,Mascini M.Nucleic acid biosensors for environmental pollution monitoring [J].Analyst,2008,133(7)：846-854.

[22]Kerman K,Kobayashi M,Tamiya E.Recent trends in electrochemical DNA biosensor technology [J].Measurement Science and Technology,2004,15(2)：R1-R11.

[23]Kr?ger S,Piletsky S,Turner A P F.Biosensors for marine pollution research,monitoring and control [J].Marine Pollution Bulletin,2002(1-12),45：24-34.

[24]Hildebrandt A,Bragós R,Lacorte S,et al.Performance of a portable biosensor for the analysis of organophosphorus and carbamate insecticides in water and food [J].Sensors and Actuators B：Chemical,2008,133(1)：195-201.

[25]Zhang S,Shan L,Zheng Y,et al.Study of enzyme biosensor for monitoring carbamate pesticides in seawater[C]//Peng Y,Weng X.IFMBE Proceedings,19.Beijing：Springer Berlin Heidelberg,2008：323-325.

[26]Istamboulie G,Fournier D,Marty J L,et al.Phosphotriesterase：A complementary tool for the selective detection of two organophosphate insecticides：chlorpyrifos and chlorfenvinfos [J].Talanta,2009,77(5)：1627-1631.

[27]Stoytcheva M,Zlatev R,Velkova Z,et al.Hybrid electrochemical biosensor for organophosphorus pesti-cides quantification [J].Electrochimica Acta,2009,54(6)：1721-1727.

[28]Penalva J,González-Martinez M A,Puchades R,et al.Immunosensor for trace determination of Irgarol 1051 in seawater using organic media [J].Analytica Chimica Acta,1999,387(3)：227-233.

[29]Mallat E,Barzen C,Abuknesha R,et al.Fast determination of paraquat residues in water by an optical immunosensor and validation using capillary electrophoresis-ultravioletdetection [J].Analytica Chimica Acta,2001,427(2)：165-171.

[30]Mallat E,Barzen C,Abuknesha R,et al.Part per trillion level determination of isoproturon in certified and estuarine water samples with a direct optical immunosensor [J].Analytica Chimica Acta,2001,426(2)：209-216.

[31]Tonnina D,Campanella L,Sammartino M P,et al.Integral toxicity test of sea waters by an algal biosensor[J].Annali di Chimica,2002,92(2)：477-484.

[32]Vedrine C,Leclerc J C,Durrieu C,et al.Optical whole-cell biosensor usingChlorella vulgarisdesigned for monitoring herbicides [J].Biosensors and Bioelectronics,2003,18(4)：457-463.

[33]LaGier M J,Jack W F B,Goodwin K D.Electrochemical detection of harmful algae and other microbial contaminants in coastal waters using hand-held biosensors[J].Marine Pollution Bulletin,2007,54(6)：757-770.

[34]S?rensen S J,Burm?lle M,Hansen L H.Making bio-sense of toxicity：new developments in whole-cell biosensors[J].Current Opinion in Biotechnology,2006,17(1)：11-16.

[35]Matthiessen P,Gibbs P E.Critical appraisal of the evidence for tributyltin-mediated endocrine disruption in mollusks [J].Environmental Toxicology and Chemistry,1998,17(1)：37-43.

[36]Durand M J,Thouand G,Dancheva-Ivanova T,et al.Specific detection of organotin compounds with a recombinant luminescent bacteria [J].Chemosphere,2003,52(1)：103-111.

[37]Zeng H H,Thompson R B,Maliwal B P,et al.Real-time determination of picomolar free Cu(II) in seawater using a fluorescence-based fiber optic biosensor [J].Analytical Chemistry,2003,75(24)：6807-6812.

[38]Thompson R T,Zeng H H,Fierke C A,et al.Real-timein situdetermination of free Cu(II) at picomolar levels in sea water using a fluorescence lifetime-based fiber optic biosensor[J].Proc SPIE,2002,4625：137-143.

[39]Chung Chun Lam C K S,Jickells T D,Richardson D J,et al.Fluorescence-based siderophore biosensor for the determination of bioavailable iron in oceanic waters [J].Analytical Chemistry,2006,78(14)：5040-5045.

[40]Chouteau C,Dzyadevych S,Chovelon J M,et al.Development of novel conductometric biosensors based on immobilised whole cellChlorella vulgarismicroalgae [J].Biosensors and Bioelectronics,2004,19(9)：1089-1096.

[41]Thompson R B,Jones E R.Enzyme-based fiber optic zinc biosensor [J].Analytical Chemistry,1993,65(6)：730-734.

[42]Lu Y,Liu J,Li J,et al.New highly sensitive and selective catalytic DNA biosensors for metal ions [J].Biosensors and Bioelectronics,2003,18(5-6)：529-540.

[43]Campàs M,Prieto-Simón B,Marty J L.Biosensors to detect marine toxins：Assessing seafood safety [J].Talanta,2007,72(3)：884-895.

[44]Stevens R C,Soelberg S D,Eberhart B T L,et al.Detection of the toxin domoic acid from clam extracts using a portable surface plasmon resonance biosensor [J].Harmful Algae,2007,6(2)：166-174.

[45]Marquette C A,Coulet P R,Blum L J.Semi-automated membrane based chemiluminescent immunosensor for flow injection analysis of okadaic acid in mussels [J].Analytica Chimica Acta,1999,398(2-3)：173-182.

[46]Kr?ger S,Law R J.Biosensors for marine applications We all need the sea,but does the sea need biosensors? [J].Biosensors and Bioelectronics,2005,20(10)：1903-1913.

[47]Kr?ger S,Law R J.Sensing the sea [J].Trends in Biotechnology,2005,23(5)：250-256.