張 歡, 叢麗娜, 侯英敏, 李愛民, 謝三群, 王 丹

(大連工業(yè)大學(xué), 遼寧 大連 116034)

海洋枯草芽孢桿菌HS-A38產(chǎn)直鏈脂肽活性物質(zhì)的初步檢測

張 歡, 叢麗娜, 侯英敏, 李愛民, 謝三群, 王 丹

(大連工業(yè)大學(xué), 遼寧 大連 116034)

從海參腸道中分離得到了一株海洋枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HS-A38, 將其發(fā)酵上清液經(jīng)鹽酸沉淀、有機溶劑萃取得到具有廣譜抗菌活性的代謝物質(zhì)。采用薄層層析和茚三酮顯色檢測到4種物質(zhì), 分別命名為化合物1、2、3和4; 應(yīng)用層析板覆蓋指示菌的生物自顯影技術(shù)對其抗菌活性成分進行追蹤、檢測, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物1和2具有顯著抑制弧菌的作用。進一步檢測分析表明, 化合物1、2和 4具有很強的熱穩(wěn)定性, 初步推斷它們屬于直鏈的脂肽類化合物, 并且這 4種物質(zhì)出現(xiàn)在不同的發(fā)酵代謝時期, 這將為研究群體效應(yīng)提供基礎(chǔ)檢測依據(jù)。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis); 抗菌活性; 生物自顯影; 直鏈脂肽化合物

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)能夠產(chǎn)生多種抗菌代謝產(chǎn)物, 被認為是具有潛在的、能有效抑制病原菌并促進動植物生長的有益菌[1], 具有很高的農(nóng)用及醫(yī)用價值[2]。近年來, 微生態(tài)制劑的研究日益受到重視, 關(guān)于水產(chǎn)養(yǎng)殖中有益菌抑菌特性的研究也陸續(xù)有見報道。儲衛(wèi)華等[3]將海洋致弧菌(Bdellovibrio)應(yīng)用于南美白對蝦養(yǎng)殖中疾病的防治,發(fā)現(xiàn)該菌能有效預(yù)防蝦弧病的發(fā)生。郭秀春等[4]研究證明了海綿共棲細菌 NJ6-3-1的代謝物質(zhì)與種內(nèi)和種間存在群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)。因此, 研究該類菌的抑菌成分, 了解代謝物分泌的基本特點, 這對從水產(chǎn)養(yǎng)殖安全角度考慮利用微生物之間的拮抗作用, 以及探索代謝物產(chǎn)出的生物群體效應(yīng)研究具有重要意義。

目前已知的枯草芽孢桿菌大多產(chǎn)生環(huán)脂肽類(Cyclic lipopeptides)的抗菌物質(zhì), 包括枯草菌表面活性素(Surfactin)、伊枯草素(Iturin)和芬枯草素(Fengycin), 這些環(huán)肽物質(zhì)在茚三酮染色前需要酸水解才能顯色, 而對于直鏈的脂肽類物質(zhì)則可以用茚三酮直接顯色[5,6]。目前對于直鏈脂肽類抗菌物質(zhì)的報道很少見。本實驗室近年來從海參腸道中篩選得到一株枯草芽孢桿菌HS-A38, 本研究首先檢測了該菌株活性粗提物質(zhì)的抑菌譜; 應(yīng)用薄層色譜(TLC),茚三酮直接染色和生物自顯影技術(shù), 檢測到其中的4種物質(zhì)能與茚三酮直接顯色, 而且其中的兩種化合物具有明顯的抑菌效果。接著檢測了這 4種物質(zhì)的溫度耐受性和它們產(chǎn)生的代謝時期。這些結(jié)果將為下一步活性物質(zhì)的純化分析和結(jié)構(gòu)確定, 以及生物種內(nèi)的群體效應(yīng)的研究提供翔實依據(jù)。另外, 該海洋枯草芽孢桿菌 HS-A38的研究和開發(fā), 為今后在水產(chǎn)養(yǎng)殖中生產(chǎn)安全有效的益生菌打下應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HS-A38為實驗室自行分離, 其16S rDNA序列在GenBank的檢索號為GQ 466597。

供試指示菌： 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtili)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、志賀菌(Shigellaspp.)、大腸桿菌(Escherichia coli)、副溶血性弧菌(Vibrio parachaemolyticus), 均由本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌株 HS-A38發(fā)酵培養(yǎng)基： 葡萄糖 5 g/L, 豆粕粉12 g/L, 尿素1 g/L, 酵母膏0.6 g/L, K2HPO44 g/L,ZnSO40.09 g/L ; pH 7.2～7.4。

指示菌液體培養(yǎng)基： 牛肉膏 3 g/L, 蛋白胨10 g/L, 氯化鈉 5 g/L, pH 7.2～7.4。

指示菌固體培養(yǎng)基： 在指示菌液體培養(yǎng)基中另加入1.5%～2.0%的瓊脂粉。

1.1.3 主要試劑和儀器

茚三酮、氯化三苯基四氮唑(TTC), 均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司, 其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。E41型紫外掃描儀, 清華紫光股份有限公司;TLC分析板(20 cm×20 cm silica gel 60F254, 德國Merck公司); 制備型硅膠板(10 cm×5 cm, 0.5 mm,青島海洋化工有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株HS-A38抗菌粗品的制備

將菌株HS-A38種子液按5%的接種量分別接入5個 1 L搖瓶中, 裝液量為 200 mL, 共 1 000 mL,30℃、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min下培養(yǎng)48 h后, 將發(fā)酵液8 000 r/min離心20 min除去菌體, 上清液用6 mol/L HCl調(diào)至 pH 2.0, 放置于 4℃冰箱中過夜; 然后8 000 r/min離心10 min收集沉淀, 用甲醇充分溶解沉淀, 過濾得棕色液體提取物, 接下來蒸干該提取物, 再用丙酮洗滌3次, 得到黃色液體產(chǎn)物; 再濃縮該產(chǎn)物后用飽和正丁醇萃取 3次, 最后取出正丁醇層, 濃縮后得到淺棕色固粗提物體, 即抗菌物質(zhì)。

1.2.2 菌株HS-A38抗菌粗品的抑菌譜測定

采用紙片擴散法測定菌株 HS-A38抗菌粗品對指示菌的抗菌活性。分別在平板上接種不同的病原指示菌, 涂布均勻, 然后在上面放上無菌濾紙片, 再向紙片上加入過濾除菌的粗品水溶液 20 μL, 并以無菌水作空白對照。經(jīng)37℃培養(yǎng) 24 h后, 用游標卡尺測定平板上出現(xiàn)抑菌圈的直徑。做3次平行試驗,取平均值。

1.2.3 菌株 HS-A38抗菌粗品的茚三酮和生物自顯影分析

稱取0.1 g活性粗提物溶解于2 mL的甲醇, 各取5 μL點樣于兩塊TLC分析板上, 分別同時在展層缸中展開(氯仿： 甲醇： 水=65： 25： 4); 干燥后, 其中一塊薄板用 0.5%茚三酮水溶液直接染色, 高溫吹干顯色, 掃描并保存。另一塊采用生物自顯影技術(shù)[7,8], 并針對本實驗的特點進行方法改良： 即將薄板置入紫外燈下滅菌 20 min, 然后放入無菌培養(yǎng)皿中, 再將一定濃度的弧菌菌懸液均勻涂布在上面, 37℃培養(yǎng)18 h, 再在薄板上噴上無菌的 0.005%TTC溶液, 接著繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h, 觀察顯影斑點并照相。

1.2.4 化合物1和2的分離及活性檢測

為了分離大量的活性化合物1和2, 采用制備型層析板制取技術(shù)。取上述粗提物質(zhì)甲醇溶解液 100 μL, 點樣在制備板上, 每點取10 μL; 該板經(jīng)展開劑(氯仿： 甲醇： 水=65： 25： 4)展開后, 干燥; 以其中一個點樣的茚三酮顯色區(qū)域為標準, 確定化合物1和2的位置, 再將與此斑點對應(yīng)的制備板區(qū)域的硅膠刮取出來, 用甲醇充分溶解, 離心除去硅膠粉, 得到待檢測的活性物質(zhì)。將該提取物分別點樣于兩塊 TLC板, 用原粗提物甲醇溶解液作為對照, 展層后干燥,其中一塊板經(jīng) 0.5%茚三酮水溶液染色, 高溫顯影,照相并保存, 另一塊板采用上述生物自顯影技術(shù)顯影檢測活性。

為了進一步驗證化合物1和2是否具有活性, 分別將這兩種化合物的甲醇溶解液過濾除菌, 然后自然揮發(fā)甲醇, 得到的化合物 1和2再用無菌水溶解;接著采用平板對峙法檢測其活性[9]： 即在均勻涂布含弧菌的平板上, 放置 0.8 cm滅過菌的濾紙片, 在濾紙片上滴加15 μL的活性樣品1和2, 并以無菌水為對照, 37℃培養(yǎng)24 h后觀察是否出現(xiàn)抑菌圈。

1.2.5 脂肽類物質(zhì)溫度耐受性的檢測

取上述粗提物的甲醇溶解液各 100 μL, 加入 5支無菌 EP管中, 分別置于 40、60、80、100℃保溫30 min, 余下的一支管放入滅菌鍋, 經(jīng)1×105Pa滅菌20 min。然后, 每樣取15 μL點樣于TLC板上, 以未處理的樣品為標準, 展層干燥后再茚三酮染色顯影。根據(jù)顯影情況推斷 4種脂肽類物質(zhì)對溫度的耐受性。

1.2.6 脂肽類產(chǎn)物發(fā)酵代謝時期的測定

將斜面保存的HS-A38菌種接種到30 mL液體培養(yǎng)基, 30℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)16 h。培養(yǎng)液經(jīng)8 000 r/min離心20 min, 收集菌體。用20 mL無菌生理鹽水稀釋該菌體, 然后取稀釋的菌體液按照5%的接種量接種于50 mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中, 30℃,160 r/min振蕩培養(yǎng)19 h。之后每隔3 h取樣6 mL, 其中1 mL用稀釋涂布法測各樣品的菌體濃度, 以繪出HS-A38的生長曲線; 剩下的5 mL發(fā)酵液樣品, 按照1.2.3的方法萃取得到含活性物質(zhì)的正丁醇萃取液,然后點樣于 TLC分析板, 展層干燥后茚三酮顯影,以檢測4種脂肽類物質(zhì)分泌產(chǎn)生的發(fā)酵時段。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株HS-A38抗菌粗品的抑菌譜

采用紙片法對菌株 HS-A38 的粗體物水溶液進行抑菌譜實驗?？咕钚越Y(jié)果(表1)表明, 該粗提物質(zhì)對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、志賀菌、枯草芽孢桿菌和溶壁微球菌均有很強的抑制作用, 并且對革蘭氏陰性菌大腸桿菌和副溶血性弧菌也具有較好的抑菌作用。

表1 菌株HS-A38粗品的抑菌活性Tab. 1 Antimicrobial activity of the crude extract from Strain HS-A38

2.2 茚三酮染色和生物自顯影分析

根據(jù)化合物 N端的游離氨基酸能與茚三酮發(fā)生顏色反應(yīng), 實驗首先采用茚三酮染色直接顯影技術(shù)。結(jié)果如圖1所示, 共有4個斑點, 將各斑點對應(yīng)的物質(zhì)分別命名為化合物1、2、3和4。根據(jù)枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物的報道, 初步推斷這 4種物質(zhì)為直鏈的肽類化合物[10]。為了驗證這 4種物質(zhì)是否具有生物活性, 采用生物自顯影技術(shù)跟蹤, 以 TTC溶液作為檢測指示菌活細胞的生物顯色劑, 即一定濃度的TTC和活菌體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶反應(yīng), 生成紅色的還原產(chǎn)物, 使菌落變紅色[11]。通過抑菌斑點檢測這些化合物在層析板上的位置及活性大小。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在A到B區(qū)間內(nèi)有明顯的抑菌斑點, 而A與 B區(qū)間對應(yīng)的為化合物 1和 2(圖2)。因此初步推斷, 化合物1和2即為活性成分。

2.3 化合物1和2的分離及活性檢測

為了確定化合物1和2是否具有抗菌活性, 采用制備型層析板, 得到化合物質(zhì)1和2。再用甲醇溶解樣品, 經(jīng)TLC檢測, 分離結(jié)果如圖3所示。在TLC板上能明顯觀察到化合物1和2的單一斑點, 這說明這兩種物質(zhì)已得到了很好的分離; 另一塊板再經(jīng)生物自顯影檢測化合物1和2的抑菌活性, 結(jié)果如圖4所示。化合物1和2點樣的b和c泳道均出現(xiàn)了抑菌斑點, 表明這兩種物質(zhì)確實有生物活性存在。

為了進一步驗證自顯影技術(shù)的可靠性, 再采用紙片法檢測并驗證化合物的活性。以弧菌作為指示菌, 將化合物1和2滴加在無菌的濾紙片上, 培養(yǎng)一段時間后, 這兩種物質(zhì)各自的周圍均出現(xiàn)了抑菌圈(圖5)。從而表明化合物1和2確實具有抗菌活性, 而且生物自顯影技術(shù)能夠直接檢測到活性物質(zhì)的位點。

圖1 菌株HS-A38粗提物質(zhì)TLC圖譜Fig. 1 TLC of the crude extract of Strain HS-A38

圖2 菌株HS-A38粗提物質(zhì)生物自顯影Fig. 2 TLC-Bioautography of the crude extract of Strain HS-A38

2.4 脂肽類物質(zhì)溫度耐受性的影響

在確定了活性物質(zhì)在TLC板上的遷移率和顯影特點后, 采用 TLC法檢測活性物質(zhì)經(jīng)不同溫度處理后的顯影情況。如圖 6所示, 對比未處理過的樣品a, 各樣品在經(jīng)過40、60、80、100℃處理后, 活性物質(zhì)1和2、化合物3和4仍然能夠保持顯影特性, 這說明大部分的脂肽類物質(zhì)具有很好的抗熱性; 同時, 樣品在 121℃高溫高壓處理后, 僅有物質(zhì) 3的顯影消失,活性物質(zhì)1和2、化合物4的顯影斑點只是變淺, 說明大部分的脂肽類物質(zhì)還具有耐高溫和高壓力的特性。

圖3 化合物1和2的TLC圖譜Fig. 3 TLC of the active substances

圖4 化合物1和2的生物自顯影Fig. 4 TLC-Bioautography of the active substances

2.5 脂肽類物質(zhì)發(fā)酵代謝時期分析

通過TLC板檢測和分析菌株HS-A38發(fā)酵產(chǎn)生活性物質(zhì)和代謝時期的關(guān)聯(lián)性。根據(jù)測定的菌株HS-A38部分生長曲線(圖 7)和對應(yīng)的不同時期發(fā)酵液活性物質(zhì)檢測的TLC圖譜(圖8), 可知活性物質(zhì)1和 2出現(xiàn)在發(fā)酵生長的末期, 因此它們屬于次級代謝產(chǎn)物; 而化合物3出現(xiàn)在發(fā)酵的對數(shù)期末期, 化合物 4出現(xiàn)在發(fā)酵穩(wěn)定期, 因此這兩種化合物均屬于初級代謝產(chǎn)物。實驗表明, 應(yīng)用 TLC技術(shù)和茚三酮顯影可以直接檢測到直鏈化合物的分泌時期, 這將為后期的代謝物群體效應(yīng)的研究提供檢測依據(jù)。

圖5 化合物1和2對副溶血弧菌的抑制作用Fig. 5 Antimicrobial activities of the compounds 1 and 2 against V. parachaemolyticus

圖6 溫度對脂肽類物質(zhì)的影響Fig. 6 Effect of temperature on the liner lipopeptides

3 結(jié)論與展望

菌株 HS-A38分離來自海參腸道, 屬于枯草芽孢桿菌(B. subtilis), 其發(fā)酵液通過鹽酸沉淀、有機溶劑萃取分離, 采用茚三酮直接染色, 發(fā)現(xiàn)4種化合物,并應(yīng)用生物自顯影技術(shù)快速跟蹤、檢測, 發(fā)現(xiàn)兩個具有抗弧菌的活性物質(zhì)1和2。這4種物質(zhì)能與茚三酮直接顯色, 表明其結(jié)構(gòu)上含有游離的氨基酸, 初步說明它們是線性的脂肽類化合物。進一步研究表明這類化合物對溫度耐受性高, 這一點在對化合物進行加工過程中因加熱而減少損失極為有利。近年來,關(guān)于耐藥基因的報道使人們越來越關(guān)注和意識到水產(chǎn)和畜牧業(yè)中細菌抗藥性的產(chǎn)生直接威脅了人類健康和生命安全[12]。本實驗產(chǎn)生菌來自可食用的生物活體體內(nèi), 具有安全, 可靠的特點, 而且屬于水產(chǎn)有益菌常見芽孢桿菌屬, 并表現(xiàn)出廣譜的抗菌活性,因而是具有很大潛能的有益菌。在研究代謝物質(zhì)產(chǎn)生與發(fā)酵時期的關(guān)聯(lián)性時, 發(fā)現(xiàn)其中化合物3和4出現(xiàn)在發(fā)酵對數(shù)期, 而活性物質(zhì)出現(xiàn)在發(fā)酵末期, 這可能存在一種群體感應(yīng)信號刺激代謝物的產(chǎn)生, 這一類研究群體種內(nèi)和種間與抗菌代謝物分泌效應(yīng)的調(diào)控機制已成為現(xiàn)在研究的熱點[13]。本次實驗找到了一種跟蹤活性物質(zhì)發(fā)酵代謝的檢測方法, 這將為進一步的提取和檢測提供依據(jù)。

圖7 菌株HS-A38生長曲線Fig. 7 Growth curve of Strain HS-A38

圖8 脂肽類物質(zhì)代謝時期TLC檢測Fig. 8 TLC detection of liner lipopeptides at various fermentation stages

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Antimicrobial activity of liner lipopeptides produced byBacillus subtilisHS-A38

ZHANG Huan, CONG Li-na, HOU Ying-min, LI Ai-min, XIE San-qun, WANG Dan
(Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China)

Oct., 11, 2010

Bacillus subtilis; antimicrobial activity; bioautography; liner lipopeptides

A marineBacillus subtilisstrain HS-A38 was isolated from the sea cucumber intestine. The crude extract of fermentation broth was prepared by methods of hydrochloric acid precipitation and solvent extraction. The extract showed broad-spectrum antimicrobial activity using the paper disc agar diffusion method.Four components, named as compound 1, 2, 3, and 4 were found by the thin layer chromatography and ninhydrin color printing. The compounds with antimicrobial activity were detected and tracked by bioautography ofVibrio parahaemolyticusand triphenyltetrazolium chloride (TTC) coloration on the plate of thin layer chromatography. Two inhibition spots were found, corresponding to compound 1 and 2. The further study showed that the compound 1, 2, and 4 were stable at high temperature. Therefore, it was preliminarily deduced that the four compounds were all straight-chain lipopeptide produced at different phase of fermentation.

S917.1

A

1000-3096(2011)08-0037-06

2010-10-11;

2011-03-02

國家自然科學(xué)基金項目(31072224) , 遼寧省教育廳創(chuàng)新團隊資助項目(LT2010012); 遼寧省自然科學(xué)基金項目(20102009)

張歡(1984-), 男, 湖北孝感人, 碩士研究生, 研究方向：海洋微生物生物活性物質(zhì), E-mail： lsm52421@yahoo.com.cn; 叢麗娜,通信作者, E-mail： congln@dlpu.edu.cn

康亦兼)