(中國水產科學研究院 黃海水產研究所,山東 青島 266071)

刺參(Apostichopus japonicus)因其營養(yǎng)價值和保健作用極高而名列海產八珍之首。進入21世紀,隨著我國國民經濟的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展和水產品消費水平的提高,刺參的增養(yǎng)殖業(yè)得到迅速發(fā)展。2008年全國刺參苗種年生產能力達 273多億頭,刺參增養(yǎng)殖面積約112 468 ha,產量達到92 567 t,行業(yè)經濟總產值達到 200多億元,是目前我國重要養(yǎng)殖經濟水產品中單一經濟總量最大的養(yǎng)殖品種。刺參增養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展亟需刺參遺傳學研究和育種工作的開展。染色體制備是細胞遺傳學研究的一項基本技術,是倍性檢測、雜種鑒定、基因定位等育種工作的基礎。

目前,對刺參染色體制備的研究已有報道。許偉定等[1]首次對刺參的染色體核型進行了分析,報道刺參染色體數(shù)目為2n=40。Okumura等[2]以不同發(fā)育時間的刺參胚胎為材料,采用敲片法對刺參染色體數(shù)目進行了研究,得出結果刺參染色體數(shù)目為2n=44。以上研究均以刺參胚胎為材料,在取樣時間上存在限制,得出的結果也不盡相同。而且,貝類的雜交育種工作證明,雜種鑒定要得到可靠的結果需要對成體的染色體組成進行分析[3-4]。因此,有必要開展以成體組織為材料的刺參染色體制備工作。本文以刺參胚胎、成體呼吸樹、成體腸為材料,采用常規(guī)方法、去受精膜法、植物血球凝集素(PHA)注射法等方法,對刺參染色體制備進行了研究,建立以刺參成體組織為材料的染色體制備方法,對不同材料不同方法的效果進行了比較,為染色體基因定位和染色體原位雜交等刺參遺傳育種后續(xù)工作提供基礎材料。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗用的刺參精卵及各期胚胎通過人工催產和授精獲得,親參來自蓬萊刺參育苗廠。所用刺參成體于2008年10月底取自煙臺,為6月齡的幼參,體質量2.5 g左右,取回后于實驗室中暫養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 胚胎制片

以胚胎為材料進行染色體制備采用3種方法。

1.2.1.1 常規(guī)方法

選擇發(fā)育良好的親本刺參,通過人工催產促其產卵。人工授精后,受精卵按3～4個/mL的孵化密度進行孵化,孵化溫度控制在20～22℃。

從授精后3 h開始取樣,以后每隔1 h取樣1次,至授精后24 h結束。取樣時,取刺參的胚胎20個左右與過濾海水一起裝入 10 mL的試管中,以質量分數(shù)為0.08%的秋水仙素處理1 h,7%檸檬酸鈉溶液低滲 40 min,加入甲醇固定 1次后再加入卡諾氏固定液(甲醇與冰醋酸體積比為 3 ：1)進行固定兩次,每次15 min。取適量固定的胚胎,加入50%的冰醋酸后用吸管吹打進行解離,熱滴片法滴片,自然干燥后用質量分數(shù)為5%吉姆薩染色液染色1 h,顯微鏡觀察,統(tǒng)計染色體數(shù)目,進行顯微攝影。同時在 100×顯微鏡下,隨機統(tǒng)計 30個視野,計算細胞的有絲分裂指數(shù)。

1.2.1.2 二硫蘇糖醇(DTT)去受精膜法

參考胡慶明[5]制備海膽染色體的方法。將刺參未受精卵用3 mmol/L濃度的DTT處理10 min,之后用自然海水漂洗,將經海水漂洗的未受精卵進行人工授精,然后受精卵于常溫海水中培養(yǎng)。其余步驟同常規(guī)方法。

1.2.1.3 機械方法去受精膜法

參考Saotome[6]制備海膽染色體的方法。將刺參卵子吸入盛有海水的培養(yǎng)皿中,加進 1滴精液行人工授精。10 min后,傾去多余海水,加入5～10倍的無鈣海水。待受精膜舉起膨脹到最大時用吸管吹打使受精膜破裂。去膜胚胎用海水洗滌兩次,培養(yǎng)于海水中。其余步驟同常規(guī)方法。

1.2.2 成體組織制片

以成體組織為材料進行染色體制備采用兩種方法。

1.2.2.1 常規(guī)方法

解剖刺參取出呼吸樹及腸組織,取長度為2～3 mm的腸組織及適當大小呼吸樹,分別用質量分數(shù)為0.04%的秋水仙素處理1 h,其余步驟同胚胎制片。

1.2.2.2 PHA體內注射法

參考魚類染色體研究中常用的PHA體內注射法,每克體質量注射PHA 10 μg于刺參體腔中,處理18～24 h后,解剖刺參取出呼吸樹及腸組織,其余步驟同常規(guī)方法。

2 結果

2.1 胚胎受精膜的去除

用DTT對刺參未受精卵進行處理,人工授精后,鏡檢觀察卵子發(fā)生畸形,并不發(fā)生卵裂,不能夠獲得早期胚胎。而采用機械方法去除刺參受精卵受精膜時,用吸管吹打刺參受精卵后,鏡檢發(fā)現(xiàn)受精膜很難去除,滴片后也沒有發(fā)現(xiàn)分裂相。因此參考海膽染色體制備方法制備刺參染色體不成功。

2.2 不同方法和材料效果的比較

以胚胎為材料采用常規(guī)方法時,從授精后 18 h至24 h所取樣品均能觀察到中期分裂相,其中以授精后21 h所取胚胎為材料時有絲分裂指數(shù)最高。以刺參成體腸和呼吸樹組織為材料采用常規(guī)方法制片,很難獲得細胞的中期分裂相。在體內注射 PHA后,可有效提高分裂指數(shù),獲得分裂相。

對以胚胎、腸、呼吸樹為材料進行染色體制片的效果進行比較。結果如表1和圖1所示。其中原腸后期胚胎為受精后21 h的胚胎,成體呼吸樹和成體腸是采用PHA體內注射法獲得的結果?？梢钥闯?以胚胎為材料獲得的有絲分裂指數(shù)最高,以胚胎和呼吸樹為材料獲得的分裂相較清晰,而以腸為材料獲得的分裂相較模糊。

圖1 不同材料制備的刺參染色體Fig.1 Chromosomes of A.japonicus prepared by different materials

表1 不同材料制備的刺參染色體有絲分裂指數(shù)比較Tab.1 Mitotic division index with the different chromosome prepared materials of A.japonicus

2.3 刺參染色體二倍體數(shù)目

對 100個圖像清晰、染色體分散良好的中期分裂相進行染色體數(shù)目統(tǒng)計,具46條染色體的分裂相為 55個,占分裂相總數(shù)的 55%,由此可以確定刺參的染色體基數(shù)為n=23,2n=46(表2)。

表2 刺參染色體二倍體計數(shù)結果Tab.2 Diploid chromosome number of A.japonicus

3 討論

動物胚胎發(fā)育期的細胞分裂最旺盛,并且采用早期胚胎為制備染色體的材料,因其卵黃少、細胞大,在染色體制備過程中,可獲得大量的分裂相,并且試驗重復性好,用做染色體的制片常常會收到很好的效果,因此胚胎是許多水產動物染色體研究的首選材料。在棘皮動物的染色體的研究方面,海膽染色體的研究是開展得最早的。前期的海膽染色體研究主要以早期胚胎為材料采用切片法和壓片法制備分裂相[7-10],但這些研究都沒有得到滿意的結果,難以得出準確的染色體數(shù)目。由于棘皮動物受精卵的受精膜在海水中鈣化后非常有韌性,并且很難除去,因此在染色體的制片方面很難達到理想的效果。自20世紀80年代以來,研究人員通過藥物處理或者機械方法除去海膽、海星受精卵的受精膜后進行染色體分裂相的制備取得了較好的效果[11-15]。本研究參考胡慶明[5]的方法,用 DTT處理刺參未受精卵后進行人工授精,鏡檢觀察卵子發(fā)生畸形,并不發(fā)生卵裂,不能夠發(fā)育至胚胎。這可能是因為刺參的卵膜被DTT破壞,影響了刺參的精卵識別,阻止了卵子受精。而參考Saotome[6]的方法通過吹打去除刺參受精膜,發(fā)現(xiàn)刺參受精卵受精膜很難去除,滴片后也沒有發(fā)現(xiàn)分裂相,這可能是因為刺參受精卵的受精膜比海膽受精卵的受精膜更為堅韌,難以通過機械方法去除。因此本研究通過去受精膜的方法制備刺參的染色體不成功,只有以脫膜上浮以后的胚胎即囊胚后期和原腸期胚胎為材料,采用常規(guī)方法,能得到較好的分裂相。

PHA作為致有絲分裂原在細胞體外短期培養(yǎng)中的廣泛應用,使專供魚類染色體制片的血培養(yǎng)、鱗培養(yǎng)、以及腎細胞培養(yǎng)等短期培養(yǎng)方法先后建立。林志浩首次采用PHA體內注射刺激腎細胞的有絲分裂,建立了一種快速簡捷的魚類染色體的制備方法[16],在魚類染色體的研究中得到廣泛的應用[17-19]。此后,PHA注射法制備染色體被應用到貝類染色體的制備,并得到較好的效果[20-22]。刺參成體的呼吸樹和腸組織分裂指數(shù)低,不易得到分裂相,為此將 PHA注射法應用到刺參的染色體制備中,有效促進了刺參呼吸樹和腸組織細胞的分裂。

本研究得到刺參染色體數(shù)目為 2n=46條,與許偉定報道刺參的染色體數(shù)目為 2n=40以及Okumura報道刺參的染色體數(shù)目為 2n=44不一致。Okumura認為其實驗結果與許偉定得到結果不同的原因是刺參染色體存在著種內變異。筆者認為造成這種實驗結果的差異更可能的原因是各研究者制片時的處理條件不同。在取樣材料上,本研究與許偉定一致,均以原腸后期胚胎為材料時,獲得最好結果,而Okumura以未脫膜上浮的囊胚期胚胎為材料獲得有絲分裂中期分裂相,以原腸后期胚胎為材料時反而得不到中期分裂相。而且,各研究間秋水仙素處理濃度差異較大,本研究秋水仙素質量分數(shù)為 0.08%與許偉定的0.1%接近,而Okumura秋水仙素質量分數(shù)為 0.005%,這說明,實驗處理條件不同,對結果影響較大。此外,我們在研究中發(fā)現(xiàn),刺參染色體極易丟失,這可能是造成本研究與許偉定得出的結果不同的原因。實驗室在進行刺參DNA的提取時,DNA極易降解,常林瑞在進行刺參 DNA的提取時,遇到同樣的問題[23]。而染色體主要由DNA和蛋白質這兩類化學物質所組成,所以DNA的降解與染色體的丟失有必然的聯(lián)系。這可能是因為刺參在受到外界刺激或外界環(huán)境變化時,細胞內核酸內切酶激活,基因組的DNA在核小體連接區(qū)發(fā)生非隨機性降解,產生寡核小體片段,造成DNA的降解和染色體的丟失。本研究參考 Saotome制備海星染色體的方法,低滲時用7%檸檬酸鈉處理40 min,固定后馬上進行解離滴片,縮短了藥物處理的時間,有效避免了DNA降解造成的染色體丟失。而許偉定低滲時間為2 h,固定后樣品于冰箱中冷藏后再進行滴片,增加的處理時間加大了DNA降解和染色體丟失的可能性。此外,本研究與許偉定在對樣品進行固定時的處理也有所不同。刺參體內富含的膠質、酸性黏多糖等成分使得固定的材料極難解離,造成解離時吹打力量過大使細胞破碎,是刺參染色體易丟失的另一可能原因。Korthof[24]在進行人外周血淋巴細胞染色體制備時發(fā)現(xiàn),純甲醇固定處理人外周血淋巴細胞對中期細胞染色體的收獲率沒有影響。經純甲醇處理的細胞固定更徹底,對機械作用力的敏感性下降,因而在收獲過程中細胞不容易破裂,不易造成染色體丟失。但純甲醇固定處理不利于染色體的分散,作者對Korthof的方法做了調整。在純甲醇固定處理后,再用常規(guī)的固定液(甲醇 ：冰醋酸=3 ：1)對樣品再進行兩次固定,從而避免純甲醇固定產生的不利影響,也一定程度上避免了因解離時細胞破裂造成的染色體丟失。

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