(中國(guó)海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院,山東 青島 266003)

植物雌激素(Phytoestrogen,PE)是一類植物來源的雜環(huán)多酚類化合物,在結(jié)構(gòu)和功能上與 17β-雌二醇(雌二醇)類似,能夠結(jié)合雌激素受體,具有弱的雌激素活性。已發(fā)現(xiàn)的植物雌激素有40多種,主要分布于38科植物中,大致可歸納為10種結(jié)構(gòu)類型,包括黃酮類、苯丙素類、 類、內(nèi)脂或香豆素類、芳香醚類、生物堿類、三萜類、甾醇類、醌類、環(huán)酞類等,其中以異黃酮類最多,主要包括有大豆苷元、金雀異黃素、芒柄花黃素等[1]。

長(zhǎng)期以來,因植物雌激素對(duì)乳腺癌、前列腺癌、更年期綜合癥、心血管病和骨質(zhì)疏松等疾病有一定防治作用,在醫(yī)藥和保健食品中應(yīng)用廣泛。植物雌激素被人食用后,會(huì)轉(zhuǎn)化為活性更高的雌馬酚等代謝物排泄進(jìn)入環(huán)境。此外,紙漿廠、木材加工廠的污水也將大量植物雌激素排放并匯集到水體中。并且,水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成對(duì)水產(chǎn)飼料需求的增加,魚類餌料需要 40%～50%的蛋白,由于動(dòng)物蛋白價(jià)格高,價(jià)格相對(duì)低廉的大豆蛋白就成為首選替代品,但大豆蛋白中往往富含著大豆異黃酮。因此,許多魚類正面臨著水體和食物中植物雌激素的雙重暴露的威脅。許多研究表明,植物雌激素對(duì)魚類的生殖發(fā)育具有廣泛的負(fù)面效應(yīng),能影響魚類的配子發(fā)生、性腺發(fā)育、性激素的合成、分泌等,是一類潛在的內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)。作者就最新的植物雌激素對(duì)影響魚類生殖發(fā)育的影響及其作用機(jī)理的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 水體和餌料中的植物雌激素含量

如今魚類生活水體中植物雌激素的污染相當(dāng)嚴(yán)重,表1列舉了世界各地的污水處理廠出水、紙漿廠廢水、農(nóng)田廢水以及河流中的植物雌激素檢測(cè)狀況。從表1可見,牧場(chǎng)及工業(yè)廢水中異黃酮類含量最高,其中金雀異黃素、大豆苷元最大濃度分別高達(dá)143.4μg/L,42.9 μg/L;工業(yè)如造紙、木材及豆類食品加工等廢水中主要含金雀異黃素和β-谷甾醇,其最大濃度分別為20 μg/L和1 055 μg/L,廢水處理過程也不能將其完全消除,處理后的最大濃度分別為10.5 μg/L,48.6 μg/L;生活污水處理廠出水中含有少量金雀異黃素、大豆苷元、香豆雌酚等,總植物雌激素含量為0.0002～ 0.083 μg/L;自然水體(河流、湖泊)中也含有金雀異黃素、大豆苷元、鷹嘴豆素、香豆雌酚等植物雌激素種類,其最高質(zhì)量濃度均低于0.276 μg/L。

此外,隨著植物蛋白被廣泛添加到商業(yè)餌料中,植物雌激素也隨之進(jìn)入到魚類餌料中。大豆?jié)饪s蛋白中富含12種異黃酮類物質(zhì),其中金雀異黃素、大豆苷元質(zhì)量比為5 900,1 900 μg/g[20]。魚類餌料含40%魚粉,如果全部由大豆蛋白替代,則金雀異黃素、大豆苷元在餌料中的理論質(zhì)量比最高分別可達(dá)2 360,760 μg/g。在實(shí)際調(diào)查中,Ishibashi等[21]檢測(cè)出商業(yè)鯉魚飼料中總異黃酮質(zhì)量比為 810 μg/g,商業(yè)鱒魚餌料中質(zhì)量比為80 μg/g。

2 植物雌激素對(duì)魚類的生殖毒性

植物雌激素結(jié)構(gòu)與雌二醇相似,可結(jié)合雌激素受體。大量研究表明植物雌激素對(duì)魚類生殖發(fā)育的影響趨勢(shì)也與雌二醇相似,主要表現(xiàn)在干擾了魚類性激素的合成與代謝,造成魚類性別分化的紊亂,影響魚類的配子發(fā)生和性腺發(fā)育,降低了魚類的生殖力,但其作用強(qiáng)度大大低于雌二醇,表現(xiàn)出較弱的雌激素活性。

2.1 對(duì)激素合成、代謝的影響

實(shí)驗(yàn)證實(shí),植物雌激素和外源雌二醇均能夠影響魚體內(nèi)性激素的合成與代謝,包括睪酮、雌二醇、11-羥基睪酮、孕烯醇酮、孕酮、促黃體生成激素和促卵泡激素等。Bennetau-Pelissero等[22]用含有 500,1 000 μg/g金雀異黃素的餌料喂食虹鱒魚(Oncorhynchus mykiss)1 a,雄性個(gè)體的睪酮、孕酮及雌魚體內(nèi)促黃體生成激素和促卵泡激素水平均隨著暴露濃度的增加而降低;Deborah等[23]對(duì)金魚(Carassius auratus)腹腔注射β-谷甾醇,導(dǎo)致雄性金魚血清睪酮、11-羥基睪酮以及雌性金魚血清睪酮、雌二醇水平的顯著下降,同時(shí)抑制了外源性人絨毛膜促性腺激素(HCG)對(duì)金魚活體睪酮和孕烯醇酮的誘導(dǎo);Yuliana等[24]的研究發(fā)現(xiàn),1 μmol/L的大豆苷元能抑制虹鱒魚肝臟內(nèi)雌二醇的代謝,同時(shí) 1,10 μmol/L金雀異黃素的暴露下,大西洋鮭魚(Salmo sala)和虹鱒魚肝臟、腎臟內(nèi)雌二醇的代謝受到劑量性抑制。

研究發(fā)現(xiàn),植物雌激素對(duì)魚類性激素合成、代謝的影響具有種類和性別的差異。例如,Zhang等[25]給日本青 (Oryzias latipes)腹腔注射金雀異黃素造成雌魚血清中的雌二醇含量增加,雄魚血清中的睪酮含量降低;而 Heiska等[26]卻發(fā)現(xiàn)在植物甾醇混合物(含 80%的β-谷甾醇)暴露下,雄性斑馬魚(Danio rerio)血漿睪酮和 11-羥基睪酮水平均上升。此外,Catherine等[27]發(fā)現(xiàn)金雀異黃素食物暴露下的虹鱒魚體內(nèi)睪酮水平隨著個(gè)體所處生活期的不同而產(chǎn)生差異。

2.2 對(duì)性別分化的影響

目前的研究發(fā)現(xiàn)雌二醇和植物雌激素均能影響魚類的性別分化,引發(fā)魚類的性逆轉(zhuǎn)。有研究表明質(zhì)量濃度為 1 μg/L的 17β-雌二醇即能導(dǎo)致半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)雌性化的概率達(dá)到74%[28]。而在對(duì)植物雌激素的研究中,Scholz等[29]用 1,10 μg/L的金雀異黃素水體暴露雄性基因型的日本青幼魚,個(gè)體性逆轉(zhuǎn)的發(fā)生率分別為37%和100% ;性成熟雄性日本青 幼魚(孵化后100 d)水體暴露于400μg/L,800 μg/L雌馬酚以及 1g/L金雀異黃素中,10%,87%和12%的個(gè)體發(fā)生了性逆轉(zhuǎn),而1 g/L金雀異黃素暴露下 50%的雌性個(gè)體背鰭和臀鰭卻表現(xiàn)出雄性特征[30];Green等[31]用含金雀異黃素 2 000,4 000,8 000 μg/g的餌料喂食尚未性別分化(孵化后5～140 d)的斑點(diǎn)叉尾(Ictalurus punctatus),劑量性地誘導(dǎo)了個(gè)體的兼性現(xiàn)象。

此外,植物雌激素能夠影響子代魚的性別分化。10μg/L、20μg/L 的植物甾醇混合物(含 80%β-谷甾醇)能夠改變暴露組斑馬魚世代的性別比例,與外源性雌二醇能夠誘導(dǎo)魚體子代和親代產(chǎn)生雌性化現(xiàn)象不同的是導(dǎo)致 F1和 F2代分別以雄性和雌性個(gè)體為主導(dǎo)[32];Yilmaz 等[33]用 50 000 μg/L 的 Genesis藥物(一種植物雌激素混合物)暴露雌性非洲鯰魚(Clarias gariepinus)時(shí),能夠顯著增加子代雌魚的比例。

2.3 對(duì)配子發(fā)生及性腺發(fā)育的影響

雌二醇和植物雌激素的暴露均能夠影響魚類的配子發(fā)生及性腺發(fā)育,直接降低魚類的生殖力。質(zhì)量濃度為1 μg/L的17β-雌二醇可導(dǎo)致半滑舌鰨出現(xiàn)卵巢分化提前和精巢分化延遲的現(xiàn)象[28]。在對(duì)植物雌激素的研究中,Bennetau-Pelissero等[22]用含500 μg/L,1 000 μg/g金雀異黃素的餌料喂食虹鱒魚1 a,其配子形成受到明顯抑制,雄魚精子密度及運(yùn)動(dòng)能力降低,雌魚受精率及幼魚成活率下降;日本青 暴露于0.4 μg/L,0.8 μg/L雌馬酚以及 1 000 μg/L金雀異黃素的水體中,雌性個(gè)體卵母細(xì)胞數(shù)量降低率、閉鎖發(fā)生率、卵巢腔面積隨著暴露濃度的增加而增大,造成卵母細(xì)胞損傷及卵巢發(fā)育異常;雄性個(gè)體出現(xiàn)精子密度降低、發(fā)育延遲,睪丸基質(zhì)增生、組織纖維化及原始生殖細(xì)胞增生等現(xiàn)象,并在一定濃度范圍內(nèi)具有劑量效應(yīng)[30];魚類餌料中高濃度異黃酮的添加(1000 μg/g)能夠顯著降低雄性鯉魚的生殖腺成熟指數(shù)[34];植物甾醇混合物(含 80%的β-谷甾醇)的暴露能夠?qū)е滦坌园唏R魚精子發(fā)生加速,精母細(xì)胞和成熟精子比例失調(diào),雌性個(gè)體卵母細(xì)胞閉鎖發(fā)生率升高[26]。

2.4 對(duì)胚胎發(fā)育的影響

研究顯示,雌二醇對(duì)魚類的胚胎發(fā)育具有毒性作用,7.5 μmol/L的雌二醇就能夠?qū)е掳唏R魚胚胎出現(xiàn)脊柱彎曲、心囊水腫等致畸效應(yīng)[35]。和雌二醇類似,Kim等[36]研究發(fā)現(xiàn),斑馬魚胚胎(受精后 24 h)暴露于金雀異黃素(100 μg/L,50μg/L,25 μmol/L)60 h 后,胚胎心率減緩、體長(zhǎng)降低、死亡率升高,并具有劑量效應(yīng)關(guān)系,同時(shí)在 25 μmol/L濃度組呈現(xiàn)出胚胎致畸效應(yīng),如圍心腔水腫、卵黃囊水腫、脊骨彎曲等;Messai等[37]指出,2.5 μmol/L金雀異黃素能夠誘發(fā)斑馬魚胚胎特別是后腦和脊髓前角細(xì)胞的凋亡;1,10,50 g/L植物甾醇混合物(75.7%β-谷甾醇)對(duì)河鱒(Thymallus thymallus)胚胎的暴露還能夠顯著縮短胚胎的孵化時(shí)間,導(dǎo)致幼魚存活率降低,體積減小[38]。

表1 植物雌激素在環(huán)境水體中的濃度

2.5 對(duì)VTG合成的影響

卵黃原蛋白(VTG)是一種廣泛用于評(píng)價(jià)卵生脊椎動(dòng)物體內(nèi)和體外雌激素活性的生物標(biāo)志物。在魚類中,VTG在雌二醇作用下由成熟雌魚肝細(xì)胞合成,經(jīng)血液運(yùn)輸至卵巢,作為胚胎發(fā)育的物質(zhì)和能量來源。雄魚中同樣具有vtg基因,但由于其體內(nèi)僅有痕量或者無雌二醇存在,因此通常雄魚體內(nèi)VTG濃度極低甚至檢測(cè)不到。大量的研究證實(shí),外源性雌激素能夠誘導(dǎo)雄魚及幼魚體內(nèi)VTG的產(chǎn)生,因此雄魚及幼魚體內(nèi)VTG的水平是評(píng)價(jià)雌激素效應(yīng)水平的一個(gè)重要的生物標(biāo)志物。與此同時(shí),VTG和性比、性激素水平等指標(biāo)一樣,能夠反映環(huán)境雌激素對(duì)魚類的生殖影響,也可作為評(píng)價(jià)環(huán)境雌激素對(duì)魚類生殖毒性的終點(diǎn)指標(biāo)。

目前,體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)多種植物雌激素都能夠和雌二醇一樣誘導(dǎo)雄魚及幼魚體內(nèi) VTG的發(fā)生。0.5 μg/L 雌二醇 21 d即可誘導(dǎo)雄性泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus(Cantor))體內(nèi)VTG含量的增加[39]。然而,用富含 500 μg/g金雀異黃素的餌料喂食虹鱒魚1 a,在雄魚中才能檢測(cè)到持續(xù)的VTG合成誘導(dǎo)效應(yīng)[22];與此同時(shí),暴露于10 μg/L大豆固醇和10,20 μg/L木固醇中的雌性和雄性斑馬魚血漿VTG水平有顯著提高[32];Turker等[34]用含有不同質(zhì)量比(250,500,1 000,10 000 μg/g)總異黃酮的餌料喂食鯉魚 180 d,劑量性誘導(dǎo)了雄魚和雌魚幼魚體內(nèi)VTG的發(fā)生。

3 植物雌激素對(duì)魚類的生殖毒性機(jī)制

有關(guān)雌二醇和植物雌激素作用機(jī)制的研究大多集中于哺乳動(dòng)物,在魚類中相對(duì)較少?，F(xiàn)有的研究結(jié)果顯示：植物雌激素與內(nèi)源性雌激素的比例可能決定了植物雌激素發(fā)揮的作用是雌激素效應(yīng)還是抗雌激素效應(yīng)。而植物雌激素可能通過雌激素受體介導(dǎo)途徑或者非受體介導(dǎo)途徑,引發(fā)相應(yīng)的反應(yīng)級(jí)聯(lián),干擾魚體性激素的合成、分泌與代謝,進(jìn)一步導(dǎo)致胚胎發(fā)育、性別分化、性腺發(fā)育、配子生成等生殖過程的紊亂。

3.1 雌激素或抗雌激素作用

外源性雌二醇具有較強(qiáng)的雌激素活性,能夠與內(nèi)源性雌激素產(chǎn)生疊加的雌激素效應(yīng),與此不同的是植物雌激素則具有雌激素和抗雌激素的雙重活性,當(dāng)內(nèi)源性雌激素缺乏時(shí),可成為雌激素促效劑;當(dāng)內(nèi)源性激素水平較高時(shí),則可成為雌激素拮抗劑。這一點(diǎn)在金雀異黃素中研究較為透徹。Bennetau- Pelisser等[22]指出,未成熟雌性虹鱒魚血清中雌二醇濃度較低時(shí),金雀異黃素顯現(xiàn)出雌激素性,能夠誘導(dǎo)血漿VTG水平的升高,反之,在VTG合成前期,當(dāng)血清雌二醇水平升高時(shí),金雀異黃素表現(xiàn)出抗雌激素性,能夠顯著延緩卵母細(xì)胞的成熟;Zhang等[25]研究發(fā)現(xiàn)青 注射中等濃度金雀異黃素(0.75 μg/條)促進(jìn)了性激素的合成和釋放,而在高濃度下(3 μg/條)此效應(yīng)減弱,證實(shí)了金雀異黃素對(duì)性激素合成和釋放的雙重調(diào)節(jié)。有研究指出,植物雌激素的雙重效應(yīng)受到雌二醇和金雀異黃素的比率所影響,當(dāng)金雀異黃素與雌二醇的比率為10～100時(shí),能夠引發(fā)兩者對(duì)于 ERs的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,占據(jù)受體結(jié)合位點(diǎn),阻礙內(nèi)源性雌激素與ER相結(jié)合,減弱了靶細(xì)胞對(duì)雌激素的應(yīng)答,因此產(chǎn)生了抗雌激素效應(yīng)[40]。

3.2 受體介導(dǎo)途徑

目前的研究認(rèn)為雌激素受體介導(dǎo)途徑包括了 3種作用方式：雌激素反應(yīng)元件(ERE)途徑、轉(zhuǎn)錄因子途徑、非基因介導(dǎo)途徑[41]。雌激素反應(yīng)元件途徑即雌二醇或植物雌激素等配體與 ERs上的配基結(jié)合區(qū)結(jié)合,形成雌激素-受體復(fù)合體,直接結(jié)合到靶基因啟動(dòng)區(qū)的 ERE上,調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá);轉(zhuǎn)錄因子途徑即雌激素-受體復(fù)合體通過連接其他轉(zhuǎn)錄因子,間接結(jié)合于基因的啟動(dòng)區(qū);非基因介導(dǎo)途徑即細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中的ERs或ERs異形體被雌激素激活后發(fā)出信號(hào),由第二信使(SM)傳導(dǎo)信號(hào),影響離子通道或者增加細(xì)胞質(zhì)中氮氧化物水平,在沒有基因調(diào)控的前提下快速發(fā)揮效應(yīng)。

現(xiàn)有的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)魚類VTG和性激素合成的一些關(guān)鍵酶是通過雌激素反應(yīng)元件途徑受到植物雌激素影響的,其余的幾種作用方式尚未得到驗(yàn)證。植物雌激素與靶細(xì)胞內(nèi) ERs上的配基結(jié)合區(qū)結(jié)合,形成雌激素-受體復(fù)合體,直接結(jié)合到靶基因啟動(dòng)區(qū)的ERE上,調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。Messai等[37]研究中發(fā)現(xiàn)低濃度的金雀異黃素能夠誘發(fā)斑馬魚前腦中芳香化酶 b基因的表達(dá),同時(shí)金雀異黃素暴露下雌性日本比目魚卵巢中細(xì)胞色素P450芳香化酶基因(P450arom,魚體內(nèi)雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵酶)mRNA的表達(dá)被誘導(dǎo),而苗勒氏管抑制物基因(MIS,抑制苗勒氏管發(fā)育)mRNA的表達(dá)受到抑制,直接導(dǎo)致了魚體的雌性化現(xiàn)象[42];此外,β-谷甾醇暴露于雄性金魚 5周后,降低了性腺內(nèi)類固醇調(diào)節(jié)蛋白(STAR)基因的轉(zhuǎn)錄水平,這可能導(dǎo)致血漿內(nèi)性激素水平的降低以及血漿脂蛋白水平的變化,從而造成生殖紊亂[43]。

硬骨魚中存在兩種ERs類型,即ERα和ERβ,且有些種類中 ERβ存在兩種異型體結(jié)構(gòu),稱為 ERβ1和ERβ2或者ERβ和ERγ。多種硬骨魚中ERs的cDNA片段已被克隆(表2)。魚類 ERα和 ERβ的分布具有種間差異及組織差異,在肝臟、性腺中分布較為集中,在腦、垂體、腸道、肌肉中分布較少。

表2 硬骨魚中ERs cDNA的結(jié)構(gòu)和種類

植物雌激素對(duì)于魚類中 ERs的兩種亞型具有不同的結(jié)合力,通常對(duì) ERβ的結(jié)合力高于 ERα,植物甾醇、黃烷酮以及查爾酮等例外,因此植物雌激素是ERβ的選擇性調(diào)節(jié)劑。在對(duì)虹鱒魚原代肝細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn),VTG的合成主要是通過ERβ介導(dǎo)[60]。玉米烯酮等植物雌激素對(duì)于ERα顯示出較弱的轉(zhuǎn)錄活性,而對(duì) ERβ則顯示出較強(qiáng)的活性。金雀異黃素對(duì)ERβ的結(jié)合力是ERα的9倍[61]。17-β雌二醇對(duì)兩種亞型則具有同等的結(jié)合力,由于植物雌激素對(duì)兩者受體基因的轉(zhuǎn)錄激活水平也不同[62],因此ERα和ERβ組織分布及水平的差異決定了植物雌激素和雌二醇的雌激素效應(yīng)具有不同的組織和器官特異性[63]。

與此同時(shí),植物雌激素與魚類 ERs的結(jié)合力還隨植物雌激素種類及魚種類的不同而存在差異。ER競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)表明,各種植物雌激素對(duì)于虹鱒魚肝細(xì)胞內(nèi) ERs 的結(jié)合力為：雌二醇(DC50：7nmol/L)＞芒柄花黃素(DC50：260 nmol/L)＞金雀異黃素(DC50：570 nmol/L)＞雌馬酚(DC50：5.3 μmol/L)＞大豆苷元(DC50：9 μmol/L)＞鷹嘴豆素(DC50：100 μmol/L);對(duì)于西伯利亞鱘魚(Acipenser baeri)肝細(xì)胞內(nèi)ER的結(jié)合力為：雌二醇(DC50：5 nmol/L)＞金雀異黃素(DC50：220 nmol/L)＞芒 柄 花 黃 素 (DC50：1μmol/L)＞ 雌 馬 酚 ＞( DC50：8.3 μmol/L)＞大豆苷元＞( DC50：80 μmol/L)＞鷹嘴豆素(DC50：100 μmol/L)。植物雌激素與 ERs的結(jié)合力與雌激素活性的發(fā)揮有關(guān),如誘導(dǎo)未成年鱘魚和虹鱒魚活體肝臟內(nèi)VTG的發(fā)生所需餌料中的金雀異黃素含量分別為20,1 000 μg/g,即鱘魚對(duì)于餌料中的金雀異黃素的敏感度是虹鱒魚的50倍;虹鱒魚ERs的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目顯著高于鱘魚,是導(dǎo)致結(jié)合力差異的一個(gè)原因[64]。

3.3 非受體介導(dǎo)途徑

植物雌激素可以直接作用于性類固醇結(jié)合蛋白(SSBP)和性類固醇激素合成、代謝過程中的一些關(guān)鍵酶,以及影響魚體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化及代謝相關(guān)酶的活性,對(duì)魚類的配子發(fā)生、性腺發(fā)育及其他的生殖過程產(chǎn)生影響。

3.3.1 類固醇信號(hào)和轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

除了雌激素受體介導(dǎo)途徑以外,植物雌激素還可以通過非雌激素受體介導(dǎo)途徑發(fā)揮效應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)表明,許多植物雌激素一方面能夠抑制性類固醇激素生物合成過程中的關(guān)鍵酶的活性,包括 17β-羥類固醇氧化還原酶Ⅰ和Ⅱ,3β-羥類固醇氧化還原酶,芳香化酶以及5α還原酶等,另一方面能夠干擾性類固醇的轉(zhuǎn)運(yùn),最終導(dǎo)致性類固醇激素的水平的改變。

在植物雌激素抑制羅非魚體內(nèi)雌二醇代謝的研究中發(fā)現(xiàn),含有兩個(gè)或者 3個(gè)羥基的異黃酮類能夠抑制雌激素磺基轉(zhuǎn)移酶(SULT)以及葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(ΜGT)的活性,干擾了雌二醇代謝產(chǎn)物E2-17-葡糖苷酸,E2-17-硫酸鹽和 E2-3-葡糖苷酸的合成[24];Pelissero等[65]研究發(fā)現(xiàn),黃酮,芹菜苷元、橡黃素、二羥黃酮、萘黃酮和雌馬酚都是虹鱒魚卵巢中芳香化酶活性的強(qiáng)力抑制劑,鷹嘴豆素和金雀異黃素能夠輕微抑制芳香化酶的活性,降低了雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化水平。因此植物雌激素除了通過受體介導(dǎo)途徑,也可通過非受體途徑,即直接干擾芳香化酶的活性來影響雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化過程。

體外實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),香豆雌酚、玉米烯酮和鷹嘴豆素對(duì)17β-羥類固醇氧化還原酶(雌酮向雌二醇、雄甾烯二醇向睪酮轉(zhuǎn)化過程的調(diào)控酶)[66],異黃酮類物質(zhì)對(duì) 3β-羥類固醇氧化還原酶(催化孕烯醇酮向孕酮轉(zhuǎn)化)以及木脂素、異黃酮類對(duì) 5α還原酶(5α-R,催化睪酮向 5α-二氫睪酮轉(zhuǎn)化)[67]的活性均具有較強(qiáng)的抑制作用,能夠直接干擾性激素的生物轉(zhuǎn)化,并降低靶組織中內(nèi)源性雌激素的利用度;在虹鱒魚肝細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn),金雀異黃素和雌馬酚不僅能夠干擾性類固醇結(jié)合蛋白(SSBP)的活性,而且能夠劑量性地抑制SSBP和雌二醇、睪酮的結(jié)合,從而影響性激素的運(yùn)輸,造成體內(nèi)性激素水平的下降[68]。

3.3.2 生物轉(zhuǎn)化及代謝相關(guān)酶的抑制

植物雌激素能夠抑制魚體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化及代謝相關(guān)酶的活性,如蛋白激酶(PKA、PKC)、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(TOPO)等,從而影響魚類的生殖。

蛋白激酶(PKA、PKC)在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周期的調(diào)控中起著重要的作用,能夠催化 ATP轉(zhuǎn)出磷酸并共價(jià)結(jié)合到特定蛋白質(zhì)分子中某些氨基酸的羥基上,導(dǎo)致蛋白質(zhì)、酶的構(gòu)象和活性的改變。研究發(fā)現(xiàn)異黃酮類物質(zhì)能夠抑制蛋白激酶的活性[69],同時(shí)Melamed等[70]指出PKC與GnRH的釋放相關(guān),金雀異黃素可能通過對(duì)PKC的抑制來阻礙GnRH的釋放,干擾LH和FSH的釋放;DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(TOPO)是DNA復(fù)制過程中的關(guān)鍵酶,也能夠受到金雀異黃素的強(qiáng)力抑制,可能阻礙魚類生殖相關(guān)基因的正常復(fù)制,造成生殖損傷[71]。

4 展望

以上簡(jiǎn)要比較了植物雌激素和外源雌二醇對(duì)于魚類的生殖影響及其作用機(jī)理的研究進(jìn)展,由于植物雌激素對(duì)魚類作用機(jī)理的研究較少,同時(shí)研究方法及其研究背景存在著較大差異,導(dǎo)致很多實(shí)驗(yàn)結(jié)果不相一致,植物雌激素對(duì)魚類生殖毒性的詳細(xì)作用機(jī)理尚不明確,需要大量的后續(xù)研究;其次,已開展的大部分實(shí)驗(yàn)中植物雌激素的暴露濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了環(huán)境濃度的范圍,無法有效地預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)環(huán)境中的植物雌激素對(duì)魚類生殖產(chǎn)生的影響,因此在未來的研究中應(yīng)當(dāng)就暴露濃度、試驗(yàn)方法等方面統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠有序地進(jìn)行類比和分析;再次,針對(duì)目前污水處理廢水和紙漿廢水中的植物雌激素成分對(duì)魚類生殖功能的顯著影響,今后的研究應(yīng)著重考慮以下幾個(gè)方面：(1)進(jìn)行大量的數(shù)據(jù)分析確定魚類較為敏感的植物雌激素濃度;(2)關(guān)注種群水平的基礎(chǔ)參數(shù),如成熟期、孵化成功率、幼年入添數(shù)量等;(3)實(shí)驗(yàn)室研究應(yīng)當(dāng)模擬處理污水以及紙漿廢水中各種化學(xué)物質(zhì)的實(shí)際狀況。

[1]潘瑞樂,陳迪華.植物雌激素結(jié)構(gòu)類型、藥理活性和臨床應(yīng)用 [J].國(guó)外醫(yī)藥(植物藥分冊(cè)),2002,17(4)：139-143.

[2]Kiparissis Y,Hughes R,Metcalfe C,et al.Identification of the isoflavonoid genistein in bleached kraft mill effluent [J].Environ Sci Technol,2001,35(12)：2423-2427.

[3]Karels A,Markkula E,Oikari A.Reproductive,biochemical,physiological,and population responses in perch (Perca fluviatilisL.) and roach (Rutilus rutilusL.)downstream of two elemental chlorine-free pulp and paper mills [J].Environ Toxicol Chem,2001,20：1517-1527.

[4]K?rner W,Spengler P,Bolz U,et al.Substances with estrogenic activity in effluents of sewage treatment plants in southwestern Germany [J].Environ Toxicol Chem,2001,20(10)：2142-2151.

[5]Burison B K,Hartmann A,Lister A,et al.A toxicity identification evaluation approach to studying estrogenic substances in hog manure and agriculture runoff[J].Environ Toxicol Chem,2003,22：2243-2250.

[6]Kostamo A,Holmbom B,Kukkonen J V K.Fate of wood extractives in wastewater treatment plants at kraft pulp mill and mechanical pulp mills [J].Water Res,2003,38：972-982.

[7]Kawanishi M,Takamura-Enya T,Ermawati R,et al.Detection of genistein as an estrogenic contaminant of river water in Osaka [J].Environ Sci Technol,2004,38：6424-6429.

[8]Lagana A,Bacaloni A,De Leva I,et al.Analytical methodologies for determining the occurrence of endocrine disrupting chemicals in sewage treatment plants and natural waters [J].Anal Chim Acta,2004,501：79-88.

[9]Bacaloni A,Cavaliere C,Faberi A,et al.Determination of isoflavones and coumestrol in river water and domestic wastewater sewage treatment plants [J].Anal Chim Acta,2005,531：229-237.

[10]Kang J,Price W E,Hick L A.Simultaneous determination of isoflavones and lignans at trace levels in natural waters and wastewater samples using liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry [J].Rapid Commun Mass Spectrom,2006,20：2411-2418.

[11]Ribeiro C,Tiritan M E,Rocha E,et al.Development and validation of a HPLC-DAD method for determination of several endocrine disrupting compounds in estuarine water [J].J Liq Chromatogr Related Technol,2007,30(18)：2729-2746.

[12]Erbs M,Hoerger C C,Hartmann N,et al.Quantification of six phytoestrogens at the nanogram per liter level in aqueous environmental samples using 13C3-labeled internal standards [J].J Agric Food Chem,2007,55 (21)：8339-8345.

[13]Liu Z H,Mamoru I,Kanjo Y,et al.Profile and removal of endocrine disrupting chemicals (EDCs) in two municipal wastewater treatment plants by using an ER(AR) competitive ligand binding assay and chemical analyses [J].J Environ Sci,2009,21(7)：900-906.

[14]Ribeiro C,Pardal M A,Tiritan M E,et al.Spatial distribution and quantification of endocrine-disrupting chemicals in Sado River estuary,Portugal [J].Environ Monit Assess,2009,159(1-4)：415-427.

[15]Ribeiro C,Pardal M A,Martinho F,et al.Distribution of endocrine disruptors in the Mondego River estuary,Portugal [J].Environ Monit Assess,2009,149(1-4)：183-193.

[16]Ribeiro C,Tiritan M E,Rocha E,et al.Seasonal and spatial distribution of several endocrine-disrupting compounds in the Douro River Estuary,Portugal [J].Arch Environ Contam Toxicol,2009,56(1)：1-11.

[17]Lundgren M S,Novak P J.Quantification of Phytoestrogens in Industrial Waste Streams [J].Environ Toxicol Chem,2009,28：2318-2323.

[18]Kuster M,Azevedo D A,López de Alda M J,et al.Analysis of phytoestrogens,progestogens and estrogens in environmental waters from Rio de Janeiro (Brazil)[J].Environ Int,2009,35(7)：997-1003.

[19]Ferrer I,Barberb L B,Thurmana E M.Gas chromatographic-mass spectrometric fragmentation study of phytoestrogens as their trimethylsilyl derivatives：Identification in soymilk and wastewater samples [J].J Chromatogr A,1 216(32)：6024-6032.

[20]Mambrini M,Roem A J,Cravèdi J P,et al.Effects of replacing fish meal with soy protein concentrate and of DL-methionine supplementation in high energy,extruded diets on the growth and nutrient utilization of rainbow trout,Oncorhynchus mykiss[J].J Anim Sci,1999,77：2990-2999.

[21]Ishibashi H,Kobayashi M,Koshiishi T,et al.Induction of plasma vitellogenin synthesis by the commercial fish diets in male goldfish (Carassius auratus) and dietary phytoestrogens [J].J Health Sci,2002,48：427-434.

[22]Bennetau-Pelissero C,Breton B B,Bennetau B,et al.Effect of genistein-enriched diets on the endocrine process of gametogenesis and on reproduction efficiency of the rainbow troutOncorhynchus mykiss[J].Gen Comp Endocrinol,2001,121：173-187.

[23]Deborah L,Maclatchy,Clen J,et al.The phytoestrogenβ-sitosterol alters the reproductive endocrine status of Goldfish [J].Toxicol Appl Pharmacol,1995,134：305-312.

[24]Yuliana Ng,Hanson S,Malison J A,et al.Genistein and other isoflavones found in soybeans inhibit estrogen metabolism in salmonid fish [J].Aquaculture,2006,254：658-665.

[25]Zhang L,Khan I A,Foran C M.Characterization of the estrogenic response to genistein in Japanese medaka(Oryzias latipes) [J].Comp Biochem Physiol C：Toxicol Pharmacol,2002,132：203-211.

[26]Christianson-Heiska I,Smeds P,Granholm N,et al.Endocrine modulating actions of a phytosterol mixture and its oxidation products in zebrafish (Danio rerio) [J].Comp Biochem Physiol C：Toxicol Pharmacol,2007,145：518-527.

[27]Catherine B P,Breton B,Bennetau B,et al.Effect of-genistein-enriched diets on the endocrine process of gametogenesis and on reproduction efficiency of the rainbow troutOncorhynchus mykiss[J].Gen Comp Endocrinol,2001,121：173-187.

[28]張曉彥,劉海金.17β-雌二醇對(duì)半滑舌鰨性分化和生長(zhǎng)的影響 [J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,6：67-72.

[29]Scholz S,Gutzeit H O.Lasting effects of xeno- and phytoestrogens on sex differentiation and reproduction of fish [J].Environ Sci,2001,8：57-73.

[30]Kiparissis Y,Balch G C,Metcalfe T L,et al.Effects of the isoflavones genistein and equol on the gonadal development of Japanese medaka (Oryzias latipes) [J].Environ Health Perspect,2003,111：1158-1163.

[31]Green C C,Kelly A M.Effects of the estrogen mimic genistein as a dietary component on sex differentiation and ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) activity in channel catfish (Ictalurus punctatus) [J].Fish Physiol Biochem,2009,35(3)：377-384.

[32]Nakari T,Erkomaa K.Effects of phytosterols on zebrafish reproduction in multigeneration test [J].Environ Pollut,2003,123：267-273.

[33]Y?lmaz1 E,?ek S,Mazlum Y.The Effects of Combined Phytoestrogen Administration on Growth Performance,Sex Differentiation and Body Composition of Sharptooth CatfishClarias gariepinus(Burchell,1822) [J].Turk J Fish Aquat Sci,2009,9：33-37.

[34]Turker H,Bozcaarmutlu A.Effect of Total Isoflavones Found in Soybean on Vitellogenin.Production in Common Carp [J].Kafkas Univ Vet Fak Derg,2009,15(4)：561-568.

[35]趙寶全,董武,王思珍,等.17β-雌二醇對(duì)斑馬魚初期胚體節(jié)形成影響的研究[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2005,15(1)：17-20.

[36]Kim D J,Seok S H,Baek M W,et al.Developmental toxicity and brain aromatase induction by high genistein concentrations in zebrafish embryos [J].Toxicol Mech Methods,2009,19(3)：251-256.

[37]Sassi-Messai S,Gibert Y,Bernard L,et al.The Phytoestrogen Genistein Affects Zebrafish Development through Two Different Pathways [J].PLoS One,2009,4(3)：4935.

[38]Honkanen J O,Kostamo A,Kukkonen J V K.Toxicity of a phytosterol mixture to grayling (Thymallus thymallus) during early developmental stages [J].Arch Environ Contam Toxicol,2005,48：391-396.

[39]呂雪飛,周群芳,宋茂勇,等.17β-雌二醇、壬基酚及其混合物對(duì)雄性泥鰍的雌激素效應(yīng) [J].科學(xué)通報(bào),2007,52(18)：2122-2126.

[40]Aldercreutz H,Goldin B R,Borbach S L,et al.Soybean phytoestrogen intake and cancer risk [J].J Nutr,1995,125：757-770.

[41]Heldring N,Pike A,Andersson S,et al.Estrogen Receptors：How Do They Signal and What Are Their Targets [J].Physiol Rev,2007,87：905-931.

[42]楊雋,郭紅衛(wèi),仲偉鑒,等.三羥基異黃酮對(duì)日本比目魚(牙鲆)性腺分化的影響 [J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué),2006,23(6)：474-478.

[43]Sharpe R L,Woodhouse A,Moon T W,et al.β-sitosterol and 17β-estradiol alter gonadal steroidogenic acute regulatory protein (StAR) expression in goldfish,Carassiu auratus[J].Gen Comp Endocrinol,2007,151：34-41.

[44]Todo T,Adachi S,Yamauchi K.Molecular cloning and characterization of Japanese eel estrogen receptor cDNA [J].Mol Cell Endocrinol,1996,119：37-45.

[45]Mikawa N,Utoh T,Horie N,et al.Cloning and characterization of vitellogenin cDNA from the common Japanese conger (Conger myriaster) and vitellogenin gene expression during ovarian development [J].Comp Biochem Physiol B：Biochem Mol Biol,2006,143(4)：404-414.

[46]Chang X T,Kobayashi T,Todo T,et al.Molecular cloning of estrogen receptors alpha and beta in the ovary of a teleost fish,the tilapia (Oreochromis niloticus) [J].Zool Sci,1999,16：653-658.

[47]Choi C Y,Habibi H R.Molecular cloning of estrogen receptorαand expression pattern of estrogen receptor subtypes in male and female goldfish [J].Mol Cell Endocrinol,2003,204：169-177.

[48]Tchoudakova A,Pathak S,Callard G V.Molecular cloning of an estrogen receptorβsubtype from the goldfish,Carassius auratus[J].Gen Comp Endocrinol,1999,113：388-400.

[49]Ma C H,Dong K W,Yu K L.cDNA cloning and expression of a novel estrogen receptorβ-subtype in goldfish (Carassius auratus) [J].Biochim Biophys Acta,2000,1 490：145-152.

[50]Menuet A,Pellegrini E,Anglade I,et al.Molecular characterization of three estrogen receptor forms in zebrafish：binding characteristics,transactivation proper-ties,and tissue distributions [J].Biol Reprod,2002,66：1881-1892.

[51]Filby A L,Tyler C R.Molecular Characterization of Estrogen Receptors 1,2α,and 2βand Their Tissue and Ontogenic Expression Profiles in Fathead Minnow(Pimephales promelas) [J].Biol Reprod,2005,73：648-662.

[52]Teves A C C,Granneman J C M,Van Dijk W,et al.Cloning and expression of a functional estrogen receptor-αfrom African catfish (Clarias gariepinus) pituitary [J].J Mol Endocrinol,2003,30：173-185.

[53]Xia Z,Patino R,Gale W L,et al.Cloning,in vitro expression,and novel phylogenetic classification of a channel catfish estrogen receptor [J].Gen Comp Endocrinol,1999,113：360-368.

[54]Socorro S,Power D M,Olsson P E,et al.Two estrogen receptors expressed in the teleost fish,Sparus aurata：cDNA cloning,characterization and tissue distribution[J].J Endocrinol,2000,166：293-306.

[55]Munoz-Cueto J A,Burzawa-Gerard E,Kah O,et al.Cloning and sequencing of the gilthead sea bream estrogen receptor cDNA [J].DNA Sequence,1999,10：75-84.

[56]Hawkins M B,Thornton J W,Crews D,et al.Identification of a third distinct estrogen receptor and reclassification of estrogen receptors in teleosts [J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97：10751-10756.

[57]Pakdel F,Metivier R,Flouriot G,et al.Two estrogen receptor (ER) isoforms with different estrogen dependencies are generated from the trout ER gene.Endocrinology,2000,141(2)：571-580.

[58]Nagler J,Cavileer T,Sullivan J,et al.The complete nuclear estrogen receptor family in the rainbow trout：discovery of the novel ERα2and both ERβisoforms [J].Gene,2007,392：164-173.

[59]Sabo-Attwood T,Kroll K J,Denslow N D.Differential expression of largemouth bass (Micropterus salmoides)estrogen receptor isotypes alpha,beta,and gamma by estradiol [J].Mol Cell Endocrinol,2004,218(1-2)：107-118.

[60]Lea?os-Casta?eda O,Van Der Kraak G.Functional characterization of estrogen receptor subtypes,ERαand ERβ,mediating vitellogenin production in the liver of rainbow trout [J].Gen Comp Endocrinol,2009,161(1)：73-78.

[61]Barkhem T,Carlsson B,Nilsson Y,et al.Differential response of estrogen receptor alpha and estrogen receptor beta to partial estrogen agonists/antagonists [J].Mol Pharmacol,1998,54：105-112.

[62]Domstauder E,Jisa E,Unterrieder I,et al.Estrogenic activity of two standardized red clover extracts (menoflavon) intended for large scale usein hormone replacementtherapy [J]．J Steroid Biochem Mol Biol,2001,78(1)：67-75.

[63]Belcher S M,Zsamovszky A.Estrogenic action in the brain：estrogen,phytoestrogen,and rapid intracellular signaling mechanisms [J].J Pharmacol Exp Ther,2001,299(2)：408-414.

[64]Latonnelle K,Fostier A,Le Menn F,et al.Binding affinities of hepatic nuclear estrogen receptors for phytoestrogens in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)and Siberian sturgeon (Acipenser baeri) [J].Gen Comp Endocrinol,2002,129：69-79.

[65]Pelissero C,Lenczowski M,Chinzi D,et al.Effects of flavonoids on aromatase activity,an in vitro study [J].J Steroid Biochem Mol Biol,1996,57：215-223.

[66]Krazeisen A,Breitling R,M?ller G,et al.Phytoestrogens inhibit human 17-hydroxysteroid dehydrogenase type 5 [J].Mol Cell Endocrinol,2001,171：151-162.

[67]Evans B A,Griffiths K,Morton M S.Inhibition of 5a-reductase in genital skin fibroblasts and prostate tissue by dietary lignans and isoflavonoids [J].J Endocrinol,1995,147(2)：295-302.

[68]Bennetau-Pelissero C,Flouriot G,Valotaire Y,et al.Induction of rainbow trout estradiol receptor (rtER)mRNA and vitellogenin (rtVTG) mRNA by phytoestrogens in hepatocyte cultures [J].Ann N Y Acad Sci,1998a,839：600-601.

[69]Osada H,Magae J,Watanabe C,et al.Rapid screening method for inhibitors of protein kinase C[J].J Antibiot,1988,41：925-930.

[70]Melamed P,Rosenfeld H,Elizur A,et al.Endocrine regulation of gonadotropin and growth hormone gene transcription in fish [J].Comp Biochem Physiol C：Toxicol Pharmacol,1998,119：325-338.

[71]Kurzer M S,Xu X.Dietary phytoestrogens [J].Annu Rev Nutr,1997,17：353-381.