通腑與瀉肺法配伍應(yīng)用對(duì)ALI/ARDS大鼠肺腸組織sIgA含量影響的比較研究

劉恩順，孫增濤，蘇景深，郭思佳，劉 偉，劉 建，孟苗苗，楊 曉

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸科，天津 300150；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

通腑與瀉肺法配伍應(yīng)用對(duì)ALI/ARDS大鼠肺腸組織sIgA含量影響的比較研究

劉恩順1，孫增濤1，蘇景深1，郭思佳2，劉 偉1，劉 建2，孟苗苗2，楊 曉2

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸科，天津 300150；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

目的：觀察通腑與瀉肺法及其配伍應(yīng)用對(duì)ALI/ARDS大鼠肺腸組織sIgA含量的影響。方法：將100只健康wistar大鼠隨機(jī)分為5組：對(duì)照組、模型組、瀉肺組、通腑組和通腑瀉肺組，采用尾靜脈注射油酸加內(nèi)毒素的方法造成大鼠ALI/ARDS模型，檢測(cè)各組大鼠肺腸組織sIgA含量。結(jié)果：通腑法、瀉肺法和通腑瀉肺法均可有效降低肺腸組織sIgA含量，且通腑與瀉肺法配伍應(yīng)用效果明顯優(yōu)于二法單獨(dú)應(yīng)用。結(jié)論：在調(diào)節(jié)ALI/ARDS大鼠黏膜免疫功能方面，肺腸同治具有明顯優(yōu)勢(shì)。

通腑瀉肺法；ALI/ARDS；sIgA；黏膜免疫

急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是指由心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的急性進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭[1]。ARDS的臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難、紫紺、氣促、喘憋等肺氣壅遏的癥狀，往往同時(shí)伴有便秘、腹脹等腑氣不通，大腸失于傳導(dǎo)的病理變化，其證候?qū)W突出體現(xiàn)了中醫(yī)“肺腸相關(guān)”的特點(diǎn)。因此，“肺病及腸”、“肺腸同病”是從中醫(yī)視角觀察ARDS的常見結(jié)論，而“臟病治腑”、“通腑瀉肺”也是中醫(yī)常用的有效治法并為臨床研究初步證實(shí)[2-3]。隨著黏膜免疫研究的深入，使人們?cè)絹?lái)越相信消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)兩大黏膜器官組織之間存在密切聯(lián)系，sIgA是黏膜免疫主要的功能執(zhí)行者，主要存在于初乳、唾液、胃腸液、支氣管，這在一定程度上證明了sIgA是聯(lián)系各處黏膜免疫的共同分子基礎(chǔ)。有學(xué)者經(jīng)研究后指出，sIgA是體現(xiàn)肺與大腸相表里的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一[4]。開展通腑與瀉肺法及其配伍應(yīng)用對(duì)ALI/ARDS大鼠肺腸組織sIgA含量影響的比較研究，有助于揭示ARDS肺腸相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)的物質(zhì)基礎(chǔ)，豐富“肺與大腸相表里”這一臟腑相關(guān)理論的現(xiàn)代生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康wistar大鼠100只，雄性、體重（200± 20）g，購(gòu)自天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司（許可證號(hào)：SCXk（津）2009-0001），購(gòu)入后置天津中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心常規(guī)飼養(yǎng)。

1.1.2 藥物及試劑 通腑瀉肺方（葶藶子、桑白皮、大黃、枳實(shí)、厚樸）、通腑方（大黃、枳實(shí)、厚樸）、瀉肺方（葶藶子、桑白皮）中藥顆粒劑，購(gòu)自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房。生藥劑量比例按照參考文獻(xiàn)[5]換算，依照人體單位體重生藥量求得大鼠單位體重生藥量。用蒸餾水配置通腑瀉肺方（生藥濃度1.08 g/ml），通腑方（生藥濃度0.45 g/ml）、瀉肺方（生藥濃度0.63 g/ml），4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ退幔ǚ治黾儯﹣?lái)自天津運(yùn)盛化學(xué)品有限公司；大腸桿菌內(nèi)毒素脂多糖（編號(hào)：L2880血清型055:B5），大鼠SIgA ELISA試劑盒(批號(hào)：BP-E09107R)為美國(guó)SIGMA公司產(chǎn)品。

1.1.3 模型建立 動(dòng)物購(gòu)入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，參照文獻(xiàn)[6]的造模方法并加以改進(jìn)。將大鼠置于大鼠固定器，固定軀干及四肢，暴露尾部。正常對(duì)照組大鼠于左側(cè)尾靜脈注射生理鹽水0.12 ml/kg，2 h后于右側(cè)尾靜脈再次注射生理鹽水1 ml/kg；其他各組于左側(cè)尾靜脈注射油酸0.12 ml/kg，間隔2 h后選右側(cè)尾靜脈注射內(nèi)毒素1 mg/kg復(fù)制ARDS模型。常規(guī)消毒，自由攝食飲水，注意保暖。

1.1.4 動(dòng)物分組和給藥方法 將大鼠按體重隨機(jī)分為5組：對(duì)照組、模型組、瀉肺組、通腑組和通腑瀉肺組，每組20只。對(duì)照組與模型組在造模完成后即用生理鹽水灌服，每次0.01 ml/g。瀉肺組、通腑組和通腑瀉肺組在造模完成后即分別采用瀉肺方、通腑方、通腑瀉肺方灌胃，每次0.01 ml/g，1次/d。

1.1.5 標(biāo)本采樣和制備 分別在造模第3天和第7天每組隨機(jī)抽取10只大鼠，腹主動(dòng)脈取血處死后，冰上迅速取左肺組織和距幽門下15 cm處及回盲部腸組織放入無(wú)菌低溫凍存管，于液氮中速凍，轉(zhuǎn)存到-80℃冰箱保存待測(cè)。

1.1.6 指標(biāo)觀測(cè) 觀察各組大鼠一般狀態(tài)，ELISA檢測(cè)大鼠肺腸組織中SIgA，操作嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包，各項(xiàng)指標(biāo)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），計(jì)量資料進(jìn)行ANOVA單因素方差分析，LSD法作兩兩比較；以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)觀察

對(duì)照組大鼠活潑好動(dòng)，皮毛光澤發(fā)亮，呼吸平穩(wěn)，抓取時(shí)能迅速逃避。模型組大鼠在注入OA后30 min起，始出現(xiàn)精神不振，行動(dòng)遲緩，對(duì)刺激反應(yīng)差，皮毛枯槁，無(wú)光澤，多見皮毛倒立，蜷縮成團(tuán)狀；隨時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠出現(xiàn)呼吸急促、呼吸困難，部分大鼠出現(xiàn)紫紺、血性泡沫樣液體從鼻腔溢出、大便干結(jié)、部分有血尿。瀉肺組、通腑組和通腑瀉肺組大鼠精神及呼吸困難均好于模型組，能飲水，多數(shù)有黑色稀便，極臭，未見血尿；但亦行動(dòng)遲緩，對(duì)刺激反應(yīng)不靈敏；皮毛無(wú)光澤，但較少出現(xiàn)皮毛倒立。

2.2 肺腸組織sIgA檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 第3 天檢測(cè)結(jié)果 第3天大鼠肺、腸組織sIgA含量比較，模型組較對(duì)照組明顯升高（P＜0.01），瀉肺組、通腑組及通腑瀉肺組較模型組顯著降低（P＜0.05），通腑瀉肺組較瀉肺組和通腑組顯著降低（P＜0.05）。詳見表1。

表1 大鼠sIgA第3天檢測(cè)結(jié)果（±s,μg/ml）Tab.1 Test results of sIgA in the third day（±s,μg/ml）

表1 大鼠sIgA第3天檢測(cè)結(jié)果（±s,μg/ml）Tab.1 Test results of sIgA in the third day（±s,μg/ml）

與對(duì)照組比較，▲P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05；與通腑瀉肺組比較，△P＜0.05Compared with control group,▲P＜0.01;compared with model group,*P＜0.05;compared with Tongfu Xiefei group,△P＜0.05

組別 n 肺sIgA對(duì)照組模型組瀉肺組通腑組通腑瀉肺組9 8 8 6 7 21.97±2.44 46.11±3.25▲40.03±3.29*△37.29±3.52*△31.16±2.99*腸sIgA 23.20±3.12 47.08±2.05▲3 9.14±2.70*△39.08±2.22*△32.86±2.51*

2.2.2 第7 天檢測(cè)結(jié)果 第7天大鼠肺、腸組織sIgA含量比較，模型組較對(duì)照組明顯升高（P＜0.01），瀉肺組、通腑組及通腑瀉肺組較模型組顯著降低（P＜0.05），通腑瀉肺組較瀉肺組和通腑組顯著降低（P＜0.05）。詳見表2。

3 討論

分泌性IgA是黏膜免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)分子，主要存在于淚液、唾液、乳汁和呼吸道、消化道及泌尿生殖道等黏膜表面分泌液中，是黏膜組織免疫應(yīng)答的特征，也是機(jī)體黏膜免疫的第一道防線。SIgA的產(chǎn)生直接取決于抗原的存在。Singh等[7]報(bào)道，用傷寒沙門菌免疫小鼠可誘導(dǎo)小鼠脾T細(xì)胞數(shù)量增加，腸液SIgA含量增高。劉東妍等[8]也發(fā)現(xiàn)，在持續(xù)高氧作用下新生大鼠回腸黏膜分泌大量SIgA，這有利于抵御細(xì)菌毒素的侵襲，以保持腸黏膜的完整性。證實(shí)了機(jī)體在遭受抗原打擊后可以出現(xiàn)以SIgA升高為表現(xiàn)形式的黏膜免疫應(yīng)答，與有學(xué)者[9]提出的局部氣管吸入或鼻腔滴入減活疫苗，可激發(fā)黏膜產(chǎn)生較多的SIgA，提高其免疫功能的觀點(diǎn)一致。

表2 大鼠sIgA第7天檢測(cè)結(jié)果（±s,μg/ml）Tab.2 Test results of sIgA in the seventh day(±s,μg/ml)

表2 大鼠sIgA第7天檢測(cè)結(jié)果（±s,μg/ml）Tab.2 Test results of sIgA in the seventh day(±s,μg/ml)

與對(duì)照組比較，▲P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05；與通腑瀉肺組比較，△P＜0.05Compared with normal group,▲P＜0.01;compared with model group,*P＜0.05;compared with Tongfu Xiefei group,△P＜0.05

組別 n 肺sIgA對(duì)照組模型組瀉肺組通腑組通腑瀉肺組9 8 8 4 5 21.21±3.39 45.20±2.57▲38.77±2.88*△39.02±2.03*△30.92±3.27*腸sIgA 24.93±2.80 47.03±2.50▲40.38±3.01*△41.99±3.19*△31.24±2.81*

失控性的炎癥反應(yīng)是ARDS病理機(jī)制的一大特點(diǎn)，目前認(rèn)為，急性肺損傷是機(jī)體炎癥反應(yīng)在肺部的表現(xiàn)，炎癥反應(yīng)包括促炎與抗炎兩個(gè)方面[10-11]。二者之間存在著錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系并相互影響，兩者保持平衡則機(jī)體內(nèi)環(huán)境保持穩(wěn)定。而與炎癥反應(yīng)和炎癥損傷同時(shí)發(fā)生的黏膜免疫應(yīng)答在維持機(jī)體處于穩(wěn)定狀態(tài)中起到重要作用。正如邱海波等[12]在探討急性肺損傷的炎癥反應(yīng)機(jī)制與藥物治療時(shí)提出必須同時(shí)觀察促炎與抗炎反應(yīng)的變化，才有可能確定正確的免疫治療方向一樣，對(duì)ARDS機(jī)體免疫功能特別是黏膜免疫功能要有更深入的認(rèn)識(shí)。

ARDS具有明顯的肺、腸相關(guān)特征，因此，“肺病及腸”、“肺腸同病”是從中醫(yī)視角觀察ARDS的常見結(jié)論，而“臟病治腑”、“臟腑同治”也是中醫(yī)常用的有效治法。本實(shí)驗(yàn)開展了通腑與瀉肺法及其配伍應(yīng)用對(duì)ARDS大鼠黏膜免疫功能影響的研究，結(jié)果表明，當(dāng)大鼠接受抗原攻擊，制成ARDS模型后，激活體內(nèi)黏膜免疫系統(tǒng)以增強(qiáng)抵抗疾病的能力，表現(xiàn)為所有造模組肺、腸組織sIgA水平均較對(duì)照組明顯增高。治療后第3天和第7天三組均能降低肺、腸組織sIgA水平，其中通腑瀉肺組優(yōu)于瀉肺組和通腑組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果一方面肯定了中醫(yī)通腑法、瀉肺法和通腑瀉肺法均可通過(guò)激活sIgA免疫應(yīng)答，中和體內(nèi)抗原，減輕其對(duì)機(jī)體的損傷，從調(diào)節(jié)黏膜免疫功能這一溝通肺、腸的生物學(xué)機(jī)制起到治療ARDS的作用。另一方面，體現(xiàn)中醫(yī)肺、腸相關(guān)的通腑瀉肺法效果明顯優(yōu)于單純使用通腑法與瀉肺法，為探索肺與大腸相表里理論的生物學(xué)機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，值得進(jìn)一步深入研究。

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The effect of application of combining Tongfu-therapy with Xiefei-therapy on sIgA content in lung and large intestine in ALI/ARDS rats

LIU Enshun1,SUN Zengtao1,SU Jingshen1,GUO Sijia2,LIU Wei1,LIU Jian2,MENG Miaomiao2,YANG Xiao2
（1.Second Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM,Tianjin 300150,China;2.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China）

Objective:To observe the effect of Tongfu-therapy,Xiefei-therapy and Tongfu Xiefei-therapy on sIgA content in lung and large intestine in ALI/ARDS rats.Methods:We divided the health Wistar rats into 5 groups,Control group, model group,lung treatment group,large intestine treatment group and lung-large intestine treatment group.We made the ALI/ARDS-rat model by Intravenous injecting oleic acid and endotoxin in caudal vein,and observed sIgA content in lung and large intestine organs.Results:All of Tongfu-therapy,Xiefei-therapy and Tongfu Xiefei-therapy could effectively reduce the sIgA content in lung and large intestine,and the method of combining Tongfu-therapy with Xiefei-therapy was superior to the single method.Conculsion:Lung-large intestine treatment is great advantage in regulating immunologic function of mucous membrane in ALI/ARDS rats.

Tongfu Xiefei-therapy;ALI/ARDS;sIgA;Mucous membrane immunologic function

R242

A

1673-7210（2011）02（c）-020-03

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃課題（2009CB522702）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（30701115）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（08JCYBJC11000）。

2010-12-16）