乙醛脫氫酶及其醫(yī)療領(lǐng)域研究進(jìn)展

毛跟年,李 鑫,瞿建波

陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,西安 710021

乙醛脫氫酶及其醫(yī)療領(lǐng)域研究進(jìn)展

毛跟年＊,李 鑫,瞿建波

陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,西安 710021

對乙醛脫氫酶的種類、基本特性、制備、檢測及其在醫(yī)療領(lǐng)域中應(yīng)用作了簡要的概述,旨在為該酶的進(jìn)一步研究提供參考。

乙醛脫氫酶;性質(zhì);臨床應(yīng)用

Abstract:This article reviews the types,basic characteristics,preparation,testing,and application in the medical field of aldehyde dehydrogenase.In order to provide some references for its advanced research.

Key words:aldehyde dehydrogenase;characteristics;clinical

乙醛脫氫酶 (aldehyde dehydrogenase,ALDH)廣泛存在于真核生物和原核生物中,在輔酶 I存在的條件下,它催化包括乙醇在內(nèi)的某些一級或二級醇、醛和酮的脫氫反應(yīng)[1]。在人類和其他許多動物體內(nèi),線粒體乙醛脫氫酶能把對生物體有害的醇類轉(zhuǎn)化,所以在細(xì)胞解毒研究中乙醛脫氫酶受到高度關(guān)注[2];同時,乙醛脫氫酶在分子生物學(xué)以及相關(guān)疾病的檢測方面也多有應(yīng)用。因此,乙醛脫氫酶的研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。文中從乙醛脫氫酶的種類、性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、制備、酶活測定及其在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用幾個方面綜述了乙醛脫氫酶的研究進(jìn)展。

1 乙醛脫氫酶的種類

乙醛脫氫酶家族 (ALDHs)是一系列氧化各式各樣脂肪族醛、芳香族醛為相應(yīng)酸的酶[3]。哺乳動物乙醛脫氫酶根據(jù)其亞細(xì)胞所在位置、結(jié)構(gòu)與動力學(xué)特性和原始序列的相似性可以分為三類[4]。第一類是細(xì)胞質(zhì)的 (ALDH1),第二類是線粒體的 (ALDH2),第三類則是可誘導(dǎo)性的細(xì)胞質(zhì)的乙醛脫氫酶和可誘導(dǎo)性的微粒體的乙醛脫氫酶 (如 ALDH3)。目前,對前兩類乙醛脫氫酶進(jìn)行了廣泛的研究,并發(fā)現(xiàn)其有效促使短鏈脂肪族醛和芳香族醛的氧化。相比較之下對第三類乙醛脫氫酶的研究較少特別是對微粒體乙醛脫氫酶的研究,大鼠肝臟、兔子腸道、人類肝臟和人白血細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)了微粒體乙醛脫氫酶的存在[1],但作用機(jī)制尚不明確。

2 人類乙醛脫氫酶性質(zhì)和結(jié)構(gòu)

人體乙醛脫氫酶為多肽四聚體,根據(jù)四元結(jié)構(gòu)和其他生化特征,至少有 7種不同基因編碼 ALDH(ALDH1、ALDH2……ALDH7),但根據(jù)底物特異性和亞單位組成,只有 ALDH1和 ALDH2才被認(rèn)為是“真”ALDHs,為人體肝內(nèi)的兩種主要同工酶,他們的基因分別位于 9號和 12號染色體。ALDH2位于線粒體內(nèi),而 ALDH1、ALDH3、ALDH4位于胞液內(nèi)。ALDH1和 ALDH2為純四聚體,由分子量為 54000的亞單位組成,含 500-501個氨基酸,他們的氨基序列中 68%是相同的[5],并且具有相類似的三維立體結(jié)構(gòu)[6-8]。人類紅細(xì)胞含有一種 ALDH,和肝細(xì)胞液內(nèi)的 ALDH1相同。ALDH2表現(xiàn)出遺傳多態(tài)性,ALDH2缺乏者有一個或兩個等位基因突變,形成純合子或雜合子,為常染色體顯性遺傳。突變的非典型ALDH2基因形成功能喪失的酶即非典型雜四聚體酶 (aaab、aabb、abbb、b表示非典型亞單位 )和非典型純四聚體 (bbbb),不能有效代謝乙醛。

3 乙醛脫氫酶的制備

目前,天然的 ALDH難以獲得,大多是從動物的肝臟、胰腺或肝細(xì)胞線粒體中提取,其資源有限且價格昂貴,因此很難大規(guī)模生產(chǎn),為了拓展 ALDH的來源,科學(xué)家們探索從微生物中提取 ALDH。國外在此方面做了大量工作,早在上個世紀(jì) 70年代,Keith A.Bostian[9]就對從釀酒酵母中提取 ALDH進(jìn)行了研究。國內(nèi)吳桂英等[10]報道了從破碎酵母細(xì)胞提取 ALDH的新工藝,考察了自溶、反復(fù)凍融、超聲波和高壓破碎儀的細(xì)胞破碎方法對釋放 ALDH的影響;周百靈等[11]利用超聲波破碎、硫酸銨分級鹽析以及 DEAE-32陰離子交換層析等方法提取了釀酒酵母胞漿內(nèi)的 ALDH并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究,這就為酶的獲得提供了寶貴資料。

在探討從微生物中提取乙醛脫氫酶的同時,學(xué)者們還通過對菌種定向誘變和培養(yǎng)基優(yōu)化提高微生物的酶產(chǎn)量。劉清利[12]等通過紫外線和 He-Ne激光誘變醋酸菌,選育出 1株乙醛脫氫酶高產(chǎn)菌株Z07-J01,該正突變 24 h發(fā)酵酶活為 1008.00 U/g濕菌體,比出發(fā)株提高了 276%,且酶活在 10代內(nèi)穩(wěn)定;王紅波[13]等通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn),對巴氏醋桿菌產(chǎn)乙醛脫氫酶的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,確定了培養(yǎng)基的最適條件和組分,提高了發(fā)酵培養(yǎng)生物量和產(chǎn)酶酶活;吳桂英[14]等人還對對酶學(xué)性質(zhì)及發(fā)酵條件也進(jìn)行了初步的研究,得到釀酒酵母產(chǎn)乙醛脫氫酶的最優(yōu)發(fā)酵條件。

4 乙醛脫氫酶的測定

乙醛脫氫酶的測定可以采用多種不同的體系,常用的ALDH酶活測定采用脫氫酶酶活測定的方法。酶、輔酶 NAD+和底物在一定溫度和 pH的條件下反應(yīng),通過每分鐘波長 340 nm處吸光度值的變化,可以算出每分鐘 NAD+轉(zhuǎn)化為 NADH的量,從而得到該酶酶活[15]。一般定義每分鐘波長 340 nm處吸光度值變化 0.001為一個活力單位 (U)。常用的檢測體系有 O K IB E[16]的 3 mL反應(yīng)體系;Keirh A.Bostian的 2.5ml檢測體系等。

5 乙醛脫氫酶在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用研究

5.1 乙醛脫氫酶與酒精中毒

各種酒類都含有乙醇,可引起飲酒后臉紅、心跳加速、皮膚加熱、血壓升高的急性酒精中毒癥狀,但這主要不是由于血液中乙醇濃度的升高,而是由于血液中乙醛濃度的升高造成的;研究表明[17],乙醛具有強(qiáng)烈的毒理作用,可刺激腎上腺素、去甲腎上腺素等物質(zhì)的分泌,引起面紅耳赤、心率快、皮溫高等癥狀。而人類對酒精耐受性有種族的和個體的差異,黃種人中 80%為酒精敏感者,白種人中僅 5%為酒精敏感者。大多數(shù)黃種人在飲酒后產(chǎn)生乙醛速度快,而氧化為乙酸的速度慢,故易產(chǎn)生乙醛蓄積中毒[18]。也就是說,乙醛脫氫酶的不足使乙醛在體內(nèi)積累導(dǎo)致中毒現(xiàn)象,乙醛對引起急性酒精中毒癥狀比乙醇起更重要的作用。解酒重在加速乙醛的分解,使之產(chǎn)生乙酸,進(jìn)一步分解為 CO2和 H2O,而在此過程中乙醛脫氫酶的作用尤為重要。

5.2 乙醛脫氫酶與肝損傷

乙醛可以作為高活性物質(zhì),與乙醇性肝損傷的發(fā)展密切相關(guān)。肝細(xì)胞線粒體內(nèi)的乙醛可被 ALDH氧化為乙酸,當(dāng) ALDH活性降低時,未被氧化的乙醛進(jìn)入血內(nèi),通過黃嘌呤氧化酶轉(zhuǎn)變?yōu)槌趸?進(jìn)而導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化,丙二醛和壬烯是 2個強(qiáng)毒力的脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物,常作為判斷脂質(zhì)過氧化的指標(biāo)。他們可進(jìn)一步促進(jìn)枯否細(xì)胞和肝細(xì)胞釋放細(xì)胞因子,破壞細(xì)胞膜,最終促進(jìn)肝損傷[19]。同時,Surrenti[20]等還觀察到 ALDH活性的減弱與肝損傷的程度是平行發(fā)展的。

5.3 乙醛脫氫酶與心血管疾病

乙醛脫氫酶 2(ALDH2)是線粒體內(nèi)一種重要的醛類氧化酶,在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。ALDH2野生型能夠抑制心肌細(xì)胞凋亡發(fā)揮心肌保護(hù)作用[21],是心力衰竭和心肌病的保護(hù)因子。ALDH2還是體內(nèi)重要的氧化應(yīng)激分子,ALDH2野生型能夠減少體內(nèi)的氧化應(yīng)激,減緩動脈粥樣硬化進(jìn)展[22];增加斑塊的穩(wěn)定性,減少心肌梗死。提高ALDH2活性有望成為心血管疾病治療的突破點(diǎn)。

5.4 乙醛脫氫酶與神經(jīng)系統(tǒng)

人類神經(jīng) tau蛋白具有穩(wěn)定細(xì)胞微管系統(tǒng)、調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞生長發(fā)育的功能[23],并在神經(jīng)系統(tǒng)的形成和軸突的通訊傳導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用[24]。tau是一種磷酸化蛋白,其功能主要通過磷酸化調(diào)節(jié)。超磷酸化可導(dǎo)致 tau蛋白分子的聚集,形成配對螺旋樣纖維[25],這是老年性癡呆在病理學(xué)上的基本病變之一。乙醛可能使 tau分子錯折疊而產(chǎn)生超磷酸化,華茜,聶春來等[26]用乙醛對人類神經(jīng) tau進(jìn)行醛胺化,通過 NCLK(neuronal cdc2-like protein kinase)和 [γ-32P]ATP對其磷酸化,磷酸化的產(chǎn)物經(jīng)胃蛋白酶降解及 HPLC(C-18)分析降解片段,發(fā)現(xiàn)醛胺化 tau的降解物中有兩個新的磷酸化肽段(A4和 A6)?？梢娂皶r降解體內(nèi)的乙醛顯得尤為重要,而開發(fā)乙醛脫氫酶類蛋白質(zhì)藥物,不失為一種好的選擇。

5.5 乙醛脫氫酶與腫瘤

長期的大量攝入乙醇會增加上消化道癌 (口腔、咽、喉和食道)、胃癌以及直腸癌的發(fā)病率。研究表明乙醛有直接的誘變和致癌性。乙醛可使得DNA發(fā)生點(diǎn)突變,從而誘導(dǎo)姐妹染色單體交換和染色體異常[27]。乙醛導(dǎo)致 DNA復(fù)制異常和削弱修復(fù)作用的一個機(jī)制就是形成穩(wěn)定的 DNA絡(luò)合物[28]。有很多流行病學(xué)研究已經(jīng)證實(shí),攜帶 ALDH2＊2等位基因的亞洲人因酗酒引發(fā)消化道癌癥的幾率明顯較大:胃癌、結(jié)腸癌、肺癌為 3～10倍;咽癌、食道癌為 11～15倍[29];而食道癌、咽癌和肺癌同時發(fā)病的幾率增加了 50倍。

5.6 乙醛脫氫酶在生理代謝方面的研究

乙醛可以共價地與微粒體蛋白結(jié)合形成乙醛蛋白絡(luò)合物。后者可以作為新抗原刺激機(jī)體引起相應(yīng)的免疫應(yīng)答,導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。乙醛可以與酶的重要功能基團(tuán)結(jié)合,導(dǎo)致酶活性改變,影響酶的功能。乙醛還可以與細(xì)胞內(nèi)微管中的管蛋白結(jié)合。微管的重要功能之一就是促進(jìn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌,肝內(nèi)蛋白質(zhì)分泌障礙,導(dǎo)致蛋白質(zhì)在肝內(nèi)滯留,引起肝細(xì)胞損傷。早期乙醇性肝纖維化和肝硬化形成過程中,肝星形細(xì)胞活化,導(dǎo)致肝星形細(xì)胞中的 I型膠原和纖維連接蛋白基因增加,從而引起細(xì)胞外基質(zhì)在肝內(nèi)沉積,肝纖維化形成[19,20]。

同時,乙醛可與體內(nèi)一些蛋白質(zhì)、磷脂、核酸等呈共價鍵結(jié)合,形成穩(wěn)定的加合物。ALDH的生理意義在于它對乙醛的解毒作用。乙醛在肝臟和其他器官內(nèi)的氧化由 NAD+-依賴性 ALDH催化,酶促反應(yīng)是不可逆的,它以直鏈和支鏈的脂肪族和芳香族醛作為底物,產(chǎn)生對應(yīng)的酮酸[30]。

5.7 乙醛脫氫酶在臨床研究上應(yīng)用

2007年 Ginestier[31]等發(fā)現(xiàn) ALDH1是乳腺癌干細(xì)胞的標(biāo)記物,此后,在白血病,視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等多種腫瘤干細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)有ALDH1表達(dá)[32,33],ALDH1能氧化環(huán)磷酰胺的中間代謝產(chǎn)物醛磷酰胺,形成無毒的羧基磷酰胺,從而發(fā)揮對 CTX的解毒作用[34],而且細(xì)胞中 ALDH1水平可以用來預(yù)測環(huán)磷酰胺治療的療效,由于ALDH1的解毒作用導(dǎo)致腫瘤對環(huán)磷酰胺的耐藥。另有研究表明,經(jīng)化療后的結(jié)直腸癌組織中腫瘤干細(xì)胞有 ALDH1的表達(dá)[35]。

國內(nèi)研究中,周凌,虞佩等[36]采用免疫組織化學(xué)染色法檢測 92例乳腺癌患者腫瘤組織中 ALDH1蛋白的表達(dá),并結(jié)合臨床病理特性進(jìn)行相關(guān)性分析和無病生存期分析,結(jié)果表明ALDH1蛋白表達(dá)陽性的乳腺癌患者其無病生存率與耐藥有關(guān),ALDH1可作為乳腺癌預(yù)后判斷的指標(biāo),可用于鑒別乳腺癌組織中的“類干細(xì)胞”群落;潘兆軍,江志敏等[37]研究發(fā)現(xiàn)ALDH1在結(jié)腸癌組織中有一定高表達(dá)率,其高表達(dá)提示預(yù)后不良,可作為評價結(jié)腸癌預(yù)后指標(biāo),促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的臨床實(shí)踐。

另有研究發(fā)現(xiàn),乙醛脫氫酶在活的造血干 /祖細(xì)胞 (HSPC)中高表達(dá),乙醛脫氫酶活性檢測可以作為檢測臍帶血中 HSPC的一個有用指標(biāo)[38],拓寬了其應(yīng)用領(lǐng)域。

6 結(jié)語

近年來,隨著生物技術(shù)日新月異的發(fā)展,對乙醛脫氫酶的研究越來越深入,研究了該酶的基因多態(tài)性、分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì),報道了該酶的誘導(dǎo)劑、激活劑、抑制劑,并對該酶分離提純,還通過基因工程將該酶基因表達(dá)在大腸桿菌和植物體內(nèi)。但研究較多集中在乙醛脫氫酶的分離提取、基因多態(tài)性以及其與疾病的相關(guān)性方面,并未見將乙醛脫氫酶制成預(yù)防和治療各種相關(guān)疾病 (像酒精性疾病)的藥品或保健品的報道,也未見其在工業(yè)上應(yīng)用的報道。

由于ALDH的廣泛作用,它必將受到研究者的日益關(guān)注。隨著新的分離純化技術(shù)出現(xiàn),ALDH將會得到更好的分離,屆時它的用武之地將會大大擴(kuò)展。

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Research Progress of Aldehyde Dehydrogenase

MAO Gen-nian＊,L IXin,QU Jian-bo
College of life Science&Engineering,Shanxi University of Science&Technology,Xi'an,710021,China

R284.2

A

1001-6880(2011)01-0193-05

2010-03-16 接受日期:2010-06-17

陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (SJ08B18);陜西省教育廳專項(xiàng)科研計劃項(xiàng)目 (編號 08JK236)

＊通訊作者 E-mail:maogn@sust.edu.cn