劉洋,徐革鋒,陳玉春,李永發(fā),牟振波

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所,黑龍江哈爾濱150070;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖系,黑龍江哈爾濱150030)

細(xì)鱗魚氣單胞菌的分離、鑒定及藥敏試驗(yàn)

劉洋1,徐革鋒1,陳玉春2,李永發(fā)1,牟振波1

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所,黑龍江哈爾濱150070;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖系,黑龍江哈爾濱150030)

從患病細(xì)鱗魚Brachymystax lenok體內(nèi)分離出兩種菌株(記為BAS和BAH),均屬于革蘭氏陰性短桿菌,無芽孢,無莢膜,多數(shù)呈單個排列,極端有單鞭毛。對兩種菌株的菌落形態(tài)鑒定結(jié)果表明:BAS的菌落呈圓形,為淺黃色,半透明,無水溶性色素;BAH的菌落也呈圓形,中央微高,為灰白色。經(jīng)API 20NE細(xì)菌生化鑒定,BAS和BAH菌株分別為溫和氣單胞菌Aeromonas sobria和嗜水氣單胞菌A.hydrophila,其鑒定率分別為98.1%和99.3%。注射劑量為1×107CFU/mL時表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病性,感染12 d時,細(xì)鱗魚的死亡率為100%。藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果表明:兩種菌株對妥布霉素(TOB)、四環(huán)素(TET)、慶大霉素(GEN)、卡那霉素(KAN)、氟哌酸(NOR)、環(huán)丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LVX)高度敏感;對呋喃唑酮(FUR)、呋喃那斯、氯霉素(CHL)、復(fù)方新諾明(TST)中度敏感;對阿奇霉素(AZI)、紅霉素(ERY)不敏感。

細(xì)鱗魚;嗜水氣單胞菌;溫和氣單胞菌;藥敏試驗(yàn)

溫和氣單胞菌Aeromonas sobria主要分布于水環(huán)境中,是一種重要的條件致病菌。嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila是一種有動力的氣單胞菌,廣泛分布于各類水環(huán)境、土壤和人類糞便中,對水產(chǎn)動物、畜禽和人類均有致病性,可引起機(jī)體出現(xiàn)敗血癥、痢疾和傷口感染等[1-3]。目前嗜水氣單胞菌是引起魚類疾病的重要病原菌,由該菌引發(fā)的敗血癥在東南亞國家通常稱之為流行性潰瘍敗血綜合癥(Epizootic ulcerative syndrome,EUS),中國大陸則稱該類疾病為暴發(fā)性流行病[4]。近年來,由嗜水氣單胞菌引起的水產(chǎn)動物細(xì)菌性敗血癥的流行,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,該病已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖中所關(guān)注的重大問題[3]。由于水產(chǎn)養(yǎng)殖中魚類的養(yǎng)殖密度不斷增大,導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境惡化,細(xì)菌疾病頻發(fā),因此,需使用大量的抗生素藥物來控制由細(xì)菌所引發(fā)的暴發(fā)性疾病,這就導(dǎo)致了抗生素藥物使用泛濫。嗜水氣單胞菌病原菌在長期的使用過程中產(chǎn)生多種耐藥性的菌株,給該病的防治帶來后患,同時也嚴(yán)重影響了水產(chǎn)動物源性食品的質(zhì)量安全,控制抗菌素的濫用已迫在眉睫[5]。

細(xì)鱗魚Brachymystax lenok屬于國家二級保護(hù)動物[6],是中國名貴的鮭科冷水性經(jīng)濟(jì)魚類,具有很高的營養(yǎng)和食用價值。細(xì)鱗魚的全人工繁育已經(jīng)成功,目前正開始大面積推廣示范養(yǎng)殖。在高密度養(yǎng)殖細(xì)鱗魚過程中,該魚會出現(xiàn)體表、鰭條充血以及體表潰爛等現(xiàn)象。本研究中,作者對該病的病原菌進(jìn)行了分離及鑒定,旨在為該病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用細(xì)鱗魚Brachymystax lenok取自黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水魚試驗(yàn)站,體質(zhì)量為20～25 g,體長為15～17 cm,暫養(yǎng)于室內(nèi)玻璃水族箱(0.9 m×0.5 m×0.5 m)中,有效水體積為180 L。以充分曝氣除氯的自來水作為循環(huán)水源,采用自動控溫裝置將水溫控制在(16±1)℃,24 h持續(xù)曝氣充氧,采用循環(huán)流水養(yǎng)殖。日投喂量為魚體質(zhì)量的1.5%,早、中、晚定時投喂,暫養(yǎng)14 d確認(rèn)健康無病后確定為感染用試驗(yàn)魚。試驗(yàn)用藥品、藥敏紙片及生理生化快速檢測試劑盒均購自杭州天和生物

制劑公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離、純化及鑒定 在嚴(yán)格無菌條件下,用酒精擦拭患病魚的體表,解剖,分別取心臟、肝胰臟、脾、腎以及血液和患病部位的糜爛組織接種于營養(yǎng)瓊脂平皿,27℃下培養(yǎng)24 h后,選擇典型可疑單菌落進(jìn)行純化,同時對純化菌株應(yīng)用API 20NE系列進(jìn)行生化鑒定、菌株形態(tài)和生化特性試驗(yàn)[7]。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[8]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[9]對菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.2 人工感染試驗(yàn) 設(shè)感染試驗(yàn)組和空白對照組,根據(jù)不同菌液濃度進(jìn)行分組注射。取被鑒定菌株培養(yǎng)24 h,用無菌生理鹽水洗下菌苔,采用平板計數(shù)法,將菌液稀釋成0.25×107、0.5×107和1.0× 107CFU/mL的菌懸液。選擇暫養(yǎng)2周以上且健康的細(xì)鱗魚150尾,分別給試驗(yàn)組魚注射不同濃度的菌懸液,注射劑量為0.5 mL/尾,注射部位為魚的胸鰭基部,給對照組魚注射相同劑量的無菌生理鹽水。每組注射感染5尾,空白對照組和試驗(yàn)組均設(shè)3個平行。將試驗(yàn)組和對照組魚置于同等條件下暫養(yǎng)。試驗(yàn)期間不投喂飼料,pH為7.0～8.0,水溫為(16±2)℃,溶氧＞7 mg/L。連續(xù)觀察兩周,記錄魚的死亡情況。

1.2.3 藥物敏感性試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)采用K-B法,參照NCCLS規(guī)范[8]進(jìn)行。用滅菌蒸餾水洗下培養(yǎng)24 h的培養(yǎng)物,采用平板計數(shù)法,將菌液稀釋至終濃度為1.5×109CFU/mL,分別涂布水解酪蛋白瓊脂(MH)平皿。選擇13種藥敏紙片均勻貼于平皿,每種藥敏片設(shè)3個平行試驗(yàn),每皿5片,27℃下培養(yǎng)18 h后測量抑菌圈直徑,確定病原菌對不同藥物的敏感程度。

2 結(jié)果

2.1 患病魚特征

7—8月是鮭科魚類細(xì)菌性疾病泛濫的季節(jié),在養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn)有部分細(xì)鱗魚體表及鰭條充血,體表充血處隨之發(fā)生潰爛,病灶不斷擴(kuò)大形成大面積潰爛(圖1-A),病灶不規(guī)則,同時鰭基部、下頜、魚體兩側(cè)有不同程度的充血,病魚攝食減少或不攝食,不久即死亡。解剖后發(fā)現(xiàn)腹腔積水,腸道內(nèi)有少量或沒有食物,肝胰臟呈花斑形,腎臟略有充血(圖1-B)。

圖1 患病魚體表潰爛面病灶(A)和內(nèi)臟病變(B)Fig.1 Symptom of skin canker(A)and pathological changes of purtenance(B)in Brachymystax lenok

2.2 革蘭氏染色及病原菌的形態(tài)特征

本試驗(yàn)中共分離出兩種疑似菌株,分別標(biāo)記為BAS和BAH。經(jīng)革蘭氏染色顯示,兩種菌株均屬于革蘭氏陰性短桿菌,菌體呈短桿狀,無芽孢無莢膜,多數(shù)單個排列,少數(shù)成對排列,極端單鞭毛。BAS的菌落呈圓形,光滑濕潤,邊緣整齊,為淺黃色,半透明,無水溶性色素。BAH菌落也呈圓形,光滑濕潤,邊緣整齊,中央微高,為灰白色。

2.3 微量生化鑒定結(jié)果

BAS和BAH菌株的鑒定結(jié)果見表1。兩種菌株還具有一些產(chǎn)酸產(chǎn)氣的特化反應(yīng),結(jié)果見表2。

表1 溫和氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的鑒定結(jié)果Tab.1 The identification of BAS and BAH in biochemical experiment

表2 溫和氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的特化性Tab.2 Biochemical characterization of the isolated strains BAS and BAH

2.4 藥物敏感試驗(yàn)

本試驗(yàn)結(jié)果表明,兩種菌株對妥布霉素(TOB)、四環(huán)素(TET)、慶大霉素GEN)、卡那霉素(KAN)、氟哌酸(NOR)、環(huán)丙沙星(CHT)、左氧氟沙星(LVX)高度敏感;對呋喃唑酮(FUR)、呋喃那斯、氯霉素(CHL)、復(fù)方新諾明(SIN)中度敏感;對阿奇霉素(AZI)、紅霉素(ERY)不敏感。

2.5 人工感染試驗(yàn)

細(xì)鱗魚分別在接種BAS和BAH菌株1周內(nèi)開始發(fā)病,高濃度組試驗(yàn)魚在接種菌株3 d后出現(xiàn)厭食、游動遲緩、反應(yīng)慢的現(xiàn)象,并有少部分魚死亡。2周內(nèi)統(tǒng)計各組魚的死亡情況,發(fā)現(xiàn)各試驗(yàn)組魚的死亡率不同,隨著注射菌液濃度的增加,細(xì)鱗魚的死亡率也在增大(表3)。

表3 腹腔注射人工感染試驗(yàn)Tab.3 Infection experiments with intraperitoneal injection

3 討論

3.1 氣單胞菌的致病性

溫和氣單胞菌和嗜水氣單胞菌不僅能引起常規(guī)養(yǎng)殖魚類患出血性敗血癥、敗血性腹水病、溶血性腹水病及爛鰓病等疾病[10-11],而且還能導(dǎo)致人類患多種疾病[12]。董傳甫等[13]、蘇應(yīng)兵等[14]和陸文浩等[12]分別報道了由嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌共同感染引起的日本鰻鱺敗血腹水病、異育銀鯽敗血癥和斑點(diǎn)叉尾鮰暴發(fā)性敗血癥。本研究中也發(fā)現(xiàn)類似情況。從發(fā)病細(xì)鱗魚體內(nèi)分離到兩種桿菌,經(jīng)過對其形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征的初步鑒定,確定為氣單胞菌屬Aeromonas的溫和氣單胞菌和嗜水氣單胞菌。通過人工接種試驗(yàn),進(jìn)一步證實(shí)細(xì)鱗魚體潰爛、出血,肝胰臟呈花斑形,腎臟略有充血等癥狀是由嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌共同感染所致。

3.2 氣單胞菌的鑒定

如果對養(yǎng)殖生產(chǎn)中的致病性細(xì)菌能夠進(jìn)行快速分離與鑒定,將對疾病的預(yù)防控制和治療起到積極的作用。在氣單胞菌表型鑒定中,馬子行[15]從眾多生化檢驗(yàn)項(xiàng)目中優(yōu)選出10項(xiàng)關(guān)鍵性指標(biāo),經(jīng)多次試驗(yàn)應(yīng)用,取得了可靠的鑒定結(jié)果,縮短了分離菌株的鑒定時間。目前對嗜水氣單胞菌的研究較為深入[2-5,16-17]。陸承平[18]認(rèn)為,革蘭氏染色為陰性,氧化酶為陽性的細(xì)菌,只要在生化特征鑒定中出現(xiàn)葡萄糖產(chǎn)氣,并發(fā)酵甘露醇、阿拉伯糖、七葉苷或水楊苷、蔗糖,鳥氨酸脫羧酶稍微陰性等6個指標(biāo)符合,就可以判定為嗜水氣單胞菌。本研究中分離菌的生化試驗(yàn)結(jié)果符合嗜水氣單胞菌的基本特性,但生化結(jié)果還顯示有溫和氣單胞菌的存在,說明是兩種氣單胞菌的協(xié)同作用導(dǎo)致細(xì)鱗魚的非典型性的發(fā)病狀況。

3.3 菌株的耐藥性

本研究中分離鑒定的兩株菌BAS和BAH分別為溫和氣單胞菌與嗜水氣單胞菌。通過藥物敏感性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),這兩種菌株對妥布霉素、四環(huán)素、慶大霉素等7種抗菌素高度敏感;對呋喃唑酮等4種抗菌素中度敏感;對阿奇霉素(AZI)、紅霉素(ERY)呈耐藥性。這與陸文浩等[12]和胡琳琳等[19]的試驗(yàn)結(jié)果存在一定差異。本研究結(jié)果表明,細(xì)鱗魚感染的氣單胞菌主要對兩種抗菌藥物存在耐藥性,對絕大多數(shù)符合《漁用藥物使用準(zhǔn)則》的抗菌藥物均有敏感反應(yīng)。因此,在細(xì)鱗魚感染氣單胞菌疾病的治療過程中,可選擇多種藥物治療,在不使用違禁藥物的同時,應(yīng)最大限度地保證藥物的治療效果,避免盲目用藥。

[1] Hanninen M L.Phenotypice characteristics of the three hybridization groups of Aeromonas hydrophila complex isolated from different sources[J].Journal of Applied Bacteriology,1994,76:455-462.

[2] 錢冬,陳月英.引起魚類暴發(fā)性流行病的嗜水氣單胞菌的血清型、毒力及溶血性[J].微生物學(xué)報,1995,35(6):460-464.

[3] 李楠,孫諱敏,田莉瑛,等.嗜水氣單胞菌的分離培養(yǎng)及鑒定[J].河北師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2009,33(2):240-243.

[4] 董傳甫,林天龍.嗜水氣單胞菌研究進(jìn)展[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2003,18(4):243-248.

[5] 宋鐵英,陳強(qiáng),鄭在予,等.不同來源嗜水氣單胞菌的抗菌素耐藥性及耐藥機(jī)制分析[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報,2007,23(2):119-124.

[6] 樂佩琦,陳宜瑜.中國瀕危動物紅皮書:魚類[M].1版.北京:科學(xué)出版社,1998:29-37.

[7] 中國科學(xué)院微生物研究所細(xì)菌分類組.一般細(xì)菌常用鑒定方法[M].北京:科學(xué)出版社,1978:216-220.

[8] 東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京:科學(xué)出版社,2001:107-119.

[9] Buchanan R E,Gibbons N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M].8版.北京:科學(xué)出版社,1984:482-487.

[10] 孫其煥,孫佩芳,金麗華.異育銀鯽溶血性腹水病病原的研究[J].水產(chǎn)學(xué)報,1991,15(2):130-139.

[11] 蔡完其,孫佩芳.羅非魚溫和氣單胞菌病的病原研究和藥敏試驗(yàn)[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2002,9(3):243-246.

[12] 陸文浩,陳輝,黃春貴.異育銀鯽氣單胞菌病原菌鑒定和藥敏試驗(yàn)[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報,2009,29(1):26-30.

[13] 董傳莆,林天龍,陳日升.日本鰻鱺敗血腹水病病原研究[J].水產(chǎn)科學(xué),2002,21(1):5-9.

[14] 蘇應(yīng)兵,鄒桂偉,袁科平,等.斑點(diǎn)叉尾鮰暴發(fā)性敗血癥病原的分離與鑒定[J].淡水漁業(yè),2006,36(5):37-41.

[15] 馬子行.氣單胞菌屬的分類和鑒定[J].國外醫(yī)學(xué):微生物學(xué)分冊,1992,15(1):25-28.

[16] 羅曉松,侯化鵬,尚書,等.魚源嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因ompTS在枯草芽胞桿菌中的表達(dá)及檢測[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2009,17(4):554-560.

[17] 秦國民,張曉君,陳翠珍,等.鯉嗜水氣單胞菌感染癥及其病原生物學(xué)特性[J].水生態(tài)學(xué)雜志,2008,1(2):53-57.

[18] 陸承平.致病性嗜水氣單胞菌及其所致魚病綜述[J].水產(chǎn)學(xué)報,1992,16(3):282-288.

[19] 胡琳琳,房文紅,梁思成,等.金魚溫和氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報,2008,17(3):285-290.

Isolation,identification and drug sensitive test of Aeromonas from lenok Brachymystax lenok

LIU Yang1,XU Ge-feng1,CHEN Yu-chun2,LI Yong-fa1,MOU Zhen-bo1
(1.Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China; 2.Department of Aquaculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Two bacteria,BAS and BAH,were isolated from the dying lenok Brachymystax lenok,and were gramnegative,rods with polar single-flagella.The BAS colony was found to be round in shape,buff,and translucent, without water-solubility pigment,while BAH was round,hoar,and slight higher in the center.Thus the BAS and BAH were identified as Aeromonas sobria and Aeromonashy hydrophila by bacteria certification with the identification percent of 98.1%in the BAS and 99.3%in the BAH by API 20NE.The injection at a dose of 1×107CFU/ mL led to intense pathogenicity and 100%mortality in 12 days.The drug sensitive test showed that the stains had high sensitivity to tobramycin,tetracycline,gentamicin,kanamycin,norfloxacin,ciprofloxacin,and levofloxacin, and middle sensitivity to furaxone,furanace,chloramphenicol,trimethoprim and sulphame-thoxazole,and resistance to azithromycin and erythromycin.

Brachymystax lenok;Aeromonashy hydrophila;Aeromonas sobria;drug sensitive test

2095-1388(2011)03-0277-04

S941.42

A

2010-08-25

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(201002,2009HSYZX-YZ-03);黑龍江省冷水性魚類種質(zhì)資源及增養(yǎng)殖重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(201002,2009HSYZX-YZ-03);中國水產(chǎn)科學(xué)研究院冷水性魚類增養(yǎng)殖生物學(xué)與魚類生理學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(201002,2009HSYZX-YZ-03)

劉洋(1982-),男,碩士,助理研究員。E-mail:liuyanghrfri@gmail.com

牟振波(1961-),男,研究員。E-mail:hfishmzb@hotmail.com