呂丹,黃旭雄,孫岳松,臧德法

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海201306;2.牡丹江友博藥業(yè)有限責(zé)任公司,黑龍江牡丹江157011)

微山湖產(chǎn)寬體金線蛭生化組成的分析

呂丹1,黃旭雄1,孫岳松2,臧德法2

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海201306;2.牡丹江友博藥業(yè)有限責(zé)任公司,黑龍江牡丹江157011)

對(duì)山東微山湖產(chǎn)寬體金線蛭Whitmania pigra的常規(guī)體組成、氨基酸、脂肪酸含量等進(jìn)行測(cè)定及分析。結(jié)果表明:寬體金線蛭體中水分、粗蛋白、總脂肪、灰分和糖類的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(鮮重)分別為85.61%、11.24%、0.95%、0.77%和1.43%;用氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)到寬體金線蛭體組織中總氨基酸含量為614.58 mg/g(干重),其中谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)和甘氨酸(Gly)含量較高,蛋氨酸(Met)含量較低。采用氣相色譜儀檢測(cè)到寬體金線蛭含有31種脂肪酸,其中廿碳烯酸占總脂肪酸的40.08%,尤以花生四烯酸(20:4n-6)含量最高,可達(dá)13.48%;油酸(18:1)含量占總脂肪酸的13.24%,單不飽和脂肪酸(MUFA)、多不飽和脂肪酸(PUFA)和高不飽和脂肪酸(HUFA)分別占總脂肪酸的35.31%、46.66%和24.41%;Σn-6PUFA/Σn-3PUFA比值達(dá)3.24,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于淡水魚和海水魚。寬體金線蛭獨(dú)特的脂肪酸和氨基酸組成特點(diǎn)或許是其高藥用價(jià)值的重要依據(jù)之一。

寬體金線蛭;體組成;脂肪酸;氨基酸

水蛭俗稱螞蟥,是環(huán)節(jié)動(dòng)物門Annelida蛭綱Hirudinea動(dòng)物的總稱,它是中國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材,具有破血逐淤、通經(jīng)消癓的功效。常用于治療中風(fēng)、高血壓、閉經(jīng)、跌打損傷和淤血腫痛等[1]。從吸血型水蛭(菲牛蛭Hirudinaria manillensis、醫(yī)用水蛭Hirudo medicinalis和日本醫(yī)蛭Hirudo nipponica)中提取的水蛭素,是一種由65～66種氨基酸組成的酸性低分子多肽物質(zhì)[2],被認(rèn)為是目前最有效的天然抗凝劑。20世紀(jì)50年代中期,德國(guó)學(xué)者從醫(yī)用水蛭中分離并鑒定了水蛭素,之后有關(guān)學(xué)者對(duì)水蛭素的藥理學(xué)(如抗凝作用、對(duì)血小板各種細(xì)胞的影響、抗血栓效果、降血脂作用、對(duì)腦血腫和皮下血腫的影響)及水蛭素在試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)等方面進(jìn)行了廣泛而深入的研究[3]。有關(guān)水蛭的研究,國(guó)外的研究主要集中在醫(yī)學(xué)[4-6]、細(xì)胞生物學(xué)[7-8]和分子遺傳[9]等領(lǐng)域;而國(guó)內(nèi)的研究大多集中在水蛭素藥理作用[3,10]、水蛭素的提取[2]及人工養(yǎng)殖技術(shù)[1,11-13]等。

寬體金線蛭Whitmania pigra隸屬于真蛭亞綱Euhirdinea、無(wú)吻蛭目Arhynchobdelliada、黃蛭科Haemopidae、金線蛭屬Whitmania,廣泛分布于長(zhǎng)江中下游地區(qū)及山東、河北、東北等地,是目前國(guó)內(nèi)中藥材市場(chǎng)上的主流藥用水蛭種[14]。吸血型水蛭如菲牛蛭、醫(yī)用水蛭和日本醫(yī)蛭等體內(nèi)含有的天然水蛭素,被認(rèn)為是水蛭能夠治療心腦血管疾病的有效藥用成分;而寬體金線蛭是一種非吸血型水蛭[11],體內(nèi)不含天然的水蛭素。寬體金線蛭的有效藥用成分目前尚不明確,有待進(jìn)一步研究。

有關(guān)水蛭的生化組成,僅見(jiàn)苗艷麗等[15]對(duì)菲牛蛭氨基酸和脂肪酸進(jìn)行了測(cè)定。微山湖是國(guó)內(nèi)寬體金線蛭的重要產(chǎn)地,曾大量出口寬體金線蛭到日本和美國(guó)等地區(qū)。目前,隨著寬體金線蛭野生資源的下降及需求的增加,有關(guān)寬體金線蛭的養(yǎng)殖探索也在逐步展開。本研究中,作者分析了微山湖產(chǎn)寬體金線蛭的體組成,以期為寬體金線蛭的人工養(yǎng)殖及在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用寬體金線蛭于2008年10月采自山東微山縣薛河養(yǎng)殖場(chǎng),共50尾,體長(zhǎng)為5.2～9.4 cm,體質(zhì)量為3.2～6.5 g。將活體帶回實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)20 d

后進(jìn)行試驗(yàn)。隨機(jī)取30尾水蛭用吸水紙吸干體表的水分后,用于常規(guī)體成分的分析;其余20尾經(jīng)冷凍、干燥、粉碎后,用于脂肪酸和氨基酸的分析。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)體成分的測(cè)定 采用國(guó)標(biāo)(GB6435-86)105℃恒重法測(cè)定水分,采用國(guó)標(biāo)(GB/ T6438-92)550℃馬弗爐灼燒法測(cè)定灰分,采用凱氏定氮法在KDN-04定氮儀上測(cè)定粗蛋白,采用索氏(Soxhlet)抽提法測(cè)定粗脂肪,采用差減法測(cè)定糖類。每個(gè)樣品的測(cè)定設(shè)3個(gè)平行。

1.2.2 氨基酸的測(cè)定 將水蛭凍干樣品粉碎后,經(jīng)6 mol/L的鹽酸溶液在110℃水解24 h。采用日立L-8800高速氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定總氨基酸含量。每個(gè)樣品的測(cè)定設(shè)2個(gè)平行。

1.2.3 脂肪酸的測(cè)定 將水蛭凍干樣品粉碎后,參照Folch等[16]的方法用氯仿-甲醇法浸提脂肪,提取的脂肪用苯-石油醚(1∶1)溶液和0.5 mol/L NaOH-甲醇溶液進(jìn)行水解和甲酯化,靜置30 min,取上清液離心后于HP6890A氣相色譜儀上分析。樣品測(cè)定設(shè)2個(gè)平行。

色譜分析條件:OMEGAWAX 320氣相毛細(xì)管分析柱,30 m×0.32 mm×25 μm(Catalog No. 24152);進(jìn)樣口溫度為260℃,N2為載氣;柱內(nèi)壓為60 kPa。采用程序升溫法:從60℃開始,以50℃/min的速率升至170℃;以2℃/min的速率升至180℃,保持2 min;以2℃/min的速率升至230℃,保持1 min;再以1℃/min的速率升至240℃,保持1 min。檢測(cè)器為氫火焰離子檢測(cè)器,分流比為5∶1,氫氣流速為30 mL/min;注入空氣的流速為300 mL/min,注入氮?dú)獾牧魉贋?5 mL/min。

以混合脂肪酸及單一脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma產(chǎn)品)的分析圖譜為參照,應(yīng)用色譜分析軟件,根據(jù)保持時(shí)間確定水蛭脂肪酸的種類,并用歸一法計(jì)算各脂肪酸的百分含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

對(duì)測(cè)定結(jié)果用Excel軟件計(jì)算其平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果

2.1 寬體金線蛭的常規(guī)體組成

經(jīng)測(cè)定,寬體金線蛭的常規(guī)體組成中水分、粗蛋白、粗脂肪、灰分、糖類的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(鮮重)分別為(85.61±0.09)%、(11.24±0.01)%、(0.95±0.02)%、(0.77±0.01)%、(1.43± 0.01)%。其中,寬體金線蛭的水分含量較高,灰分和粗脂肪含量較低。

2.2 寬體金線蛭體的氨基酸組成

從表1可見(jiàn),寬體金線蛭的總氨基酸含量可達(dá)614.58 mg/g(干重)。在總氨基酸組成中,含量相對(duì)較高的氨基酸依次為:谷氨酸＞天冬氨酸＞亮氨酸＞賴氨酸＞甘氨酸,蛋氨酸含量最低。

表1 寬體金線蛭氨基酸的組成及含量(干重)Tab.1 The amino acid content and composition in the leech,Whitmania pigra(dry matter)

2.3 寬體金線蛭體的脂肪酸組成

在氣相色譜儀上共檢測(cè)到31種脂肪酸(表

2)。其中含量較高的脂肪酸為20:4n-6、18:1、20:1、20:2n-6、16:0和16:1;各類脂肪酸的組成中,HUFA、PUFA、MUFA和SFA的含量分別占總脂肪酸的24.41%、46.66%、35.31%和18.03%。PUFA中Σn-6/Σn-3比值高達(dá)3.24。此外,寬體金線蛭中廿碳脂肪酸的含量很高,占總脂肪酸的40.08%。

表2 寬體金線蛭體脂肪酸占總脂肪酸的比例Tab.2 The fatty acid profiles of the leech,Whitmania pigra

3 討論

一般而言,陸生動(dòng)物的體成分中,水分為72.67%～78.62%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)[17-20],魚類的水分為73.60%～80.60%[21-24],蝦類的水分為76.29%～78.76%[25-26],貝類(軟體部分)的水分為74.57%～84.07%[27],環(huán)節(jié)動(dòng)物門雙齒圍沙蠶的水分為84.1%[28]。本實(shí)驗(yàn)中測(cè)得寬體金線蛭的水分為85.61%,明顯高于陸生動(dòng)物,也比魚蝦等水生動(dòng)物的水分高。這可能與寬體金線蛭主要靠吸食無(wú)脊椎動(dòng)物的體液為生的攝食習(xí)性有關(guān)。

本研究中,寬體金線蛭的粗蛋白、總脂肪、灰分和糖類的含量占干物質(zhì)的比例分別為78.11%、6.60%、5.35%和9.94%。與幾種常見(jiàn)水生動(dòng)物相比(表3):寬體金線蛭粗蛋白的比例與魚類[21-24]、蝦類接近[25-26],高于沙蠶[28]的含量;總脂肪的含量與沙蠶、魚類相似,略高于蝦類;灰分的含量與蝦類、魚類相近,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于沙蠶的含量;糖類的含量在沙蠶、蝦類、魚類的范圍之內(nèi)。

與幾種常見(jiàn)水生動(dòng)物相比(表4):寬體金線蛭體內(nèi)的氨基酸總量為614.58 mg/g,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于菲牛蛭[15]和海蜇皮[29]的含量,低于仿刺參體壁[30]的含量,略高于雙齒圍沙蠶;賴氨酸的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于雙齒圍沙蠶的含量[28]。人體必需的氨基酸含量為218.41 mg/g。寬體金線蛭體中含量較高的氨基酸依次為:谷氨酸＞天冬氨酸＞亮氨酸＞賴氨酸＞甘氨酸,蛋氨酸含量最低,這與Monreal等[31]的研究結(jié)果相符。

寬體金線蛭的谷氨酸達(dá)到96.92 mg/g。當(dāng)谷氨酸被人體吸收后,易與血氨形成谷酰胺,谷酰胺可作為腦組織的能量物質(zhì),改進(jìn)維持大腦機(jī)能。谷氨酸還具有促進(jìn)紅細(xì)胞生成、改善腦細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)及活躍思維作用,是治療肝昏迷、神經(jīng)衰弱和記憶力減退的有效成分。天冬氨酸可作為K+、Mg+離子的載體向心肌輸送電解質(zhì),從而改善心肌的收縮功能,同時(shí)降低氧消耗,在因冠狀動(dòng)脈循環(huán)障礙而缺氧時(shí),對(duì)心肌有保護(hù)作用。亮氨酸可作為營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑和調(diào)味增香劑。賴氨酸是人體的第一必需氨基酸,可降低血液中甘油三酯的水平,預(yù)防心腦血管疾病的產(chǎn)生,促進(jìn)人體發(fā)育,增強(qiáng)免疫功能,并有提高中樞神經(jīng)組織功能的作用。谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸等氨基酸的大量存在或許正是水蛭藥理作用的部分原因。

寬體金線蛭肌肉的脂肪酸組成齊全,含量豐富,含有31種脂肪酸。飽和脂肪酸(SFA)有6種,不飽和脂肪酸(UFA)為25種,其中高度不飽和脂肪酸(HUFA)8種。從表2可知,微山湖產(chǎn)寬體金線蛭的脂肪酸組成具有鮮明的特點(diǎn):首先是飽和脂肪酸(SFA)含量很低,僅占總脂肪酸的18.03%,而多不飽和脂肪酸(PUFA)、單不飽和

脂肪酸(MUFA)和高不飽和脂肪酸(HUFA)含量較高;其次是廿碳烯酸含量很高,各種廿碳烯酸占總脂肪酸的比例高達(dá)40.08%;最后是n-6系列不飽和脂肪酸比例較n-3系列不飽和脂肪酸高,其Σn-6 PUFA/Σn-3 PUFA比值高達(dá)3.24,遠(yuǎn)超過(guò)淡水魚和海水魚的Σn-6 PUFA/Σn-3 PUFA值。一般淡水魚體內(nèi)Σn-6 PUFA/Σn-3 PUFA為0.6～1.9[31],海水魚體內(nèi)Σn-6 PUFA/Σn-3 PUFA為0.1～0.9[32]。菲牛蛭體中飽和脂肪酸(SFA)含量高于不飽和脂肪酸(UFA)含量,同樣含有較高的單不飽和脂肪酸(MUFA),其中棕櫚油酸含量最高[15]。

表3 常見(jiàn)水生動(dòng)物的粗蛋白、粗脂肪、灰分和糖類含量占干物質(zhì)的比例Tab.3 The proportion of crude protein,crude lipid,ash and carbohydrate(in matter dry)of common aquatic animals w/%

表4 不同水生動(dòng)物氨基酸的含量及比較Tab.4 The comparison of animo acid contents in different aquatic animalsmg/g

微山湖產(chǎn)寬體金線蛭體中單個(gè)脂肪酸以花生四烯酸(ARA)含量最高,達(dá)13.48%,而EPA的含量?jī)H為3.47%。ARA屬n-6系列的不飽和脂肪酸,是人體中最重要的多不飽和脂肪酸之一。

ARA及其代謝產(chǎn)物在人體內(nèi)具有很強(qiáng)的生物活性,在許多疾病的病理生理過(guò)程中起著重要的作用。對(duì)血漿分析的結(jié)果表明,ARA能降低血糖、血脂和血液中膽固醇,并顯著降低血液中低密度脂蛋白(LDL-C)和極低密度脂蛋白(VLDL-C),升高高密度脂蛋白(HDL-C),這對(duì)于預(yù)防心血管疾病具有重要意義[33]。

ARA和EPA都是許多類二十烷酸,如前列腺

素E2(PGE2)、前列環(huán)素(PGI2)、血栓烷素A2(TXA2)、白細(xì)胞三烯LTD4以及LTC4等的主要前體物。這些生物活性物質(zhì)對(duì)脂蛋白的代謝、血液流變學(xué)、血管彈性、白細(xì)胞功能和血小板激活等具有重要的調(diào)節(jié)作用。例如PGE2能抑制血小板凝集和甘油三酯的分解,從而降低血中的游離脂肪酸,可用于冠心病及動(dòng)脈粥樣硬化的防治[34]。實(shí)驗(yàn)證明, LTD4和LTC4可引起明顯的血管收縮和降低冠脈血流,是強(qiáng)效冠脈血管收縮劑[34],可致灌注心臟的收縮力下降,心輸出量減少。ARA及其代謝物還能引起血管舒張,抑制血小板聚集,減少血栓的形成和組織缺血等生理機(jī)能的改變[34]。

單不飽和脂肪酸(MUFA)如油酸(18:1)、棕櫚油酸(16:1)等對(duì)膽固醇有明顯降低的作用。研究認(rèn)為,MUFA可有效降低血漿中血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的含量,能夠增強(qiáng)低密度脂蛋白的抗氧化能力,避免血管壁的激活,從而有效保護(hù)血管內(nèi)皮,在一定程度上防止心血管疾病的發(fā)生[35]。棕櫚油酸能夠加強(qiáng)血管的代謝過(guò)程,可防止患高血壓的大鼠患中風(fēng)的危險(xiǎn)[36]。

寬體金線蛭肌肉中油酸(18:1)的含量略低于花生四烯酸(ARA),油酸在降低血液膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的同時(shí),還能升高對(duì)人體有益的高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C),因此可預(yù)防血栓形成,降低血壓,從而減少引發(fā)心腦血管疾病的危險(xiǎn)[37]。由于油酸對(duì)低密度脂蛋白膽固醇的作用呈中性,在降低高密度脂蛋白膽固醇的程度上比亞油酸低,沒(méi)有多不飽和脂肪酸過(guò)量攝入后所帶來(lái)的負(fù)面影響。因此,在某種程度上,單不飽和脂肪酸要優(yōu)于多不飽和脂肪酸。另外,Grudy等的研究表明,高油酸膳食在降低低密度脂蛋白膽固醇和血清總膽固醇時(shí),沒(méi)有發(fā)現(xiàn)高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)下降[37]。

對(duì)脂肪酸與心血管疾病關(guān)系研究的最新研究結(jié)果表明,單不飽和脂肪酸在降低總膽固醇和有害膽固醇的同時(shí),不會(huì)降低有益膽固醇[38]。另外,單不飽和脂肪酸具有特殊的物理化學(xué)特征和生理功能,具有調(diào)節(jié)人體脂質(zhì)代謝以及治療和預(yù)防心腦血管疾病等功效[39]。肖穎等[40]研究了富含單不飽和脂肪酸的堅(jiān)果對(duì)血脂的調(diào)節(jié)作用,證實(shí)單不飽和脂肪酸具有調(diào)節(jié)高血脂大鼠血脂水平的作用。單不飽和脂肪酸可以降低血清中總膽固醇和載脂蛋白B的含量,提高載脂蛋白A的含量[41]。

綜上所述,微山湖產(chǎn)寬體金線蛭的生化組成具有鮮明的特點(diǎn),氨基酸中富含谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸,脂肪酸組成表現(xiàn)為低的飽和脂肪酸含量,高的廿碳烯酸含量,高的花生四烯酸含量和高的Σn-6PUFA/Σn-3PUFA比值。上述生化組成特點(diǎn)與寬體金線蛭藥用價(jià)值是否直接相關(guān),尚需做更進(jìn)一步的藥理學(xué)研究。

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The biochemical composition of leech,Whitmania pigra,collected from Weishan Lake,Shandong province

Lü Dan1,HUANG Xu-xiong1,SUN Yue-song2,ZANG De-fa2
(1.Key Laboratory of Exploitation and Utilization of Aquatic Genetic Resources,Ministry of Education,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;2.Youbo Pharmaceutical Co.,LTD,Mudanjiang 157011,China)

The body composition was analyzed in leech Whitmania pigra,an important aquatic animal for Chinese medicine,with body weight of 3.2-6.5 g collected at Weishan Lake in Shandong Province.It was found that the leech had moisture of 85.61%,crude protein 11.24%,total lipid 0.95%,ash 0.77%and carbohydrate 1.43%. There was total amino acid of 614.58 mg/g DW in the leech body,with more Glu,Asp,Leu,Lys and Gly and less Met.A total of 31 fatty acids were detected in the leech body with high proportion of eicosanoic acids(40.08%), especially arachidonic acid(ARA)(13.48%),oleic acid(18:1)(13.24%).The proportions of MUFA,PUFA and HUFA were found to be 35.31%,46.66%and 24.41%,respectively.The ratio of Σn-6PUFA/Σn-3PUFA fatty acid was 3.24 in the leech body,higher than that in freshwater or marine fish.It is therefore suggested that the high medical value of the leech be partially due to the fatty acid and amino acid compositions.

Whitmania pigra;biochemical composition;fatty acid;amino acid

2095-1388(2011)03-0281-06

Q956

A

2010-08-18

上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(Y1101)

呂丹(1984-),女,碩士研究生。E-mail:lvdan511@sina.com

黃旭雄(1971-),男,副教授。E-mail:xxhuang@shou.edu.cn