王輝，楊崇廣，牛辰

復旦大學上海醫(yī)學院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學分子病毒學重點實驗室，上海 200032

細菌耐藥(drug resistance)是一個復雜的現(xiàn)象，涉及細菌本身、環(huán)境與宿主這幾個既相互獨立又相互作用的因素[1]。目前廣泛認同的細菌耐藥機制主要有以下幾種：阻止藥物進入微生物機體[2,3]；阻止藥物與其靶點結合[4,5]；微生物機體產生鈍化酶，使藥物失活或修飾改變[4,5]；改變藥物作用的靶點[4,5]。

在微生物研究領域中，通常以游離狀態(tài)下的單個細菌為對象，研究各種生理現(xiàn)象及機制，包括細菌耐藥性及其機制。近年來，微生物學家越來越關注細菌作為一個群體所表現(xiàn)出來的有別于其游離狀態(tài)的行為[6]。其中，細菌的群體性行為與耐藥性的關系是近年來的研究熱點。一般認為，生物膜(biofilm)、群體感應(quorum sensing)和程序性死亡(programmed cell death，PCD)是細菌群體性行為中的3個重要內容。但是，群體感應往往是細菌通過調控一些耐藥相關基因的表達或其他影響細菌耐藥的機制與耐藥性相關[7]，并非是細菌自身的直接作用。因此，本文就細菌生物膜和程序性死亡與耐藥性的相關研究進展進行綜述。

1 細菌的生物膜與耐藥

生物膜是指細菌不可逆地黏附于物體表面及細菌間相互黏附，并被其自身分泌的細胞外基質所包裹形成的結構[8]。生物膜是細菌在自然界存在的一種普遍狀態(tài)。在感染過程中，與游離態(tài)細菌相比，形成生物膜的細菌生長較緩慢且基因表達發(fā)生改變。生物膜的形成提高了細菌抵抗宿主機體免疫系統(tǒng)和抗生素的能力，成為不斷產生游離細菌的儲藏所[9,10]。生物膜與多種細菌的毒力相關且參與致病過程，在耐藥性的發(fā)生、細菌的壓力應答、規(guī)避宿主的防御機制和持續(xù)性感染中具有重要作用，因此生物膜的形成與細菌的耐藥性密不可分[9,11,12]。美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)報道指出：“超過80%的細菌感染與生物膜相關”，而且細菌在生物膜狀態(tài)下對藥物的抵抗能力是其游離狀態(tài)的10～1 000倍[13]。

關于這種天然耐藥性的分子機制，以往的研究提出以下幾種可能的解釋：生物膜的存在限制抗生素的滲透[14]；營養(yǎng)限制導致細菌生長代謝緩慢[15,16]；壓力耐受基因的激活表達[17]；群體效應形成的特異表型[18,19]；外排泵(efflux pump)的表達增強[20]。大多數觀點認為，生物膜的耐藥性本質是由于黏膜深處的細菌很少接觸抗菌藥物，然而這個理由并不充分。最近的研究揭示了生物膜耐藥的其他原因，如生物膜中頑固耐藥菌(persister cell)的存在[21]。

1.1 滲透限制

一直以來，抗生素不能有效穿透所有生物膜被認為是細菌耐藥的普遍原因。細菌在生物膜狀態(tài)下的特征是密度大，有以多種不溶于水的胞外多糖為主要成分的胞外基質，由此組成的網絡狀支持結構形成阻礙抗生素穿透的屏障[19]。因此，抗生素只能殺滅表層細菌，無法以有效濃度滲透至生物膜內部。Larsen等研究發(fā)現(xiàn)，當浮游狀態(tài)的牙齦卟啉菌(Porphyromonasgingivalis)的密度與生物膜狀態(tài)相當時，盡管細菌在生物膜狀態(tài)下對多西環(huán)素(強力霉素)和甲硝唑的耐藥性是浮游狀態(tài)的2～8倍，但羥氨芐青霉素、多西環(huán)素和甲硝唑的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)顯著增加[22]。Roque等報道將金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的胞外基質洗去后，細菌對藥物的敏感度上升到浮游狀態(tài)時的90%以上[23]。也有些研究提出其他觀點，如Stewart等發(fā)現(xiàn)達托霉素可以在數分鐘內滲透到一株流行的金黃色葡萄球菌形成的生物膜中[24]。另外，一些學者研究獲得的結果相反，即盡管抗生素滲透整個生物膜，但細菌依然不敏感。由此可見，滲透限制并不能完全解釋生物膜的耐藥機制。

1.2 生長限制

許多研究者認為，細菌在生物膜狀態(tài)下生長速率下降是細菌耐藥的重要原因之一[15,16]。生物膜造成營養(yǎng)物質從外到內呈現(xiàn)梯度下降，導致不同營養(yǎng)狀態(tài)下細菌的代謝速率不同，最底層的細菌往往處于持續(xù)性潛伏的靜止狀態(tài)[25]。以往的研究表明，處于靜止狀態(tài)不分裂的細菌會逃避大多數針對殺滅活躍狀態(tài)細菌的抗生素，因此一些研究者認為這樣的生長緩慢狀態(tài)將降低細菌對大多數抗生素的敏感度。

1.3 頑固耐藥菌

頑固耐藥菌是指那些始終對抗生素具有抗性的細菌。早在60多年前，就發(fā)現(xiàn)在抗生素敏感細菌中存在極少的一部分耐受細菌，頑固耐藥菌與耐藥突變細菌不同，具有可逆性和非遺傳性[26]。然而，由于極難分離出足夠數量頑固耐藥菌用于實驗，該相關領域的研究沉寂了40多年。最近在生物膜中發(fā)現(xiàn)了頑固耐藥菌，重燃起研究者的興趣。在細菌中某些調控程序性細胞死亡的基因發(fā)生突變可以增加頑固耐藥菌的耐藥性，表明細菌在生物膜狀態(tài)下發(fā)生的程序性細胞死亡與其耐藥有關。

2 細菌的程序性死亡

程序性細胞死亡最早由Lockshin 和Williams于1964年提出，也稱細胞凋亡(apoptosis)，是由細胞本身程序性自殺機制介導的細胞死亡現(xiàn)象[27]。該現(xiàn)象在真核多細胞生物中廣泛存在，是維系個體穩(wěn)定、功能平衡和正常發(fā)育所必需的。隨著微生物學研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)細菌等原核生物在應對環(huán)境壓力帶來的生存危機時，會產生與真核生物細胞凋亡相似的自殺現(xiàn)象，稱為細菌的程序性死亡[28,29]。

目前研究較多的介導程序性死亡的機制有2類：一類是在壓力應激下由毒素抗毒素(toxin-antitoxin，TA)系統(tǒng)介導的，具代表性的是大腸埃希菌(Escherichiacoli)的mazEF操縱子；另一類是枯草芽胞桿菌(Bacilliussubtilis)在細胞功能分化過程中介導的程序性死亡[30,31]。

2.1 大腸埃希菌的TA系統(tǒng)

TA系統(tǒng)包括1對基本的組分，即一個相對穩(wěn)定的毒素基因與一個可干擾毒素反應的不穩(wěn)定的抗毒素基因[31]。在大腸埃希菌中，被研究最清楚的是mazEF系統(tǒng)，它由2個定位于relA基因下游的鄰近基因mazE和mazF組成[32]。mazE編碼抗毒素蛋白MazE，mazF編碼毒素蛋白MazF[33]。一般情況下，MazE與MazF在細菌內相互拮抗，不會對細菌的生長產生影響。一旦有某種外界因素打破這種相對平衡的體系，由于MazE不穩(wěn)定容易被降解，MazF不斷積累，最終導致細菌的程序性死亡。這些因素包括氨基酸的過度缺乏[33,34]、抗生素(如奇霉素、利福平)的應用[35]、Doc蛋白(一種廣譜翻譯抑制劑)的存在[36]、過氧化物(如H2O2)的應用[37]、胸腺嘧啶缺乏、絲裂霉素的應用、萘啶酸的存在和紫外照射等[37,38]。

也有學者認為，TA系統(tǒng)導致細胞死亡僅僅是通過抑制大分子的表達而可逆地抑制細菌生長[39,40]，而毒素的存在使處于靜止狀態(tài)的細菌在其相應抗毒素基因表達時重新被激活的結果支持了上述觀點。

2.2 枯草芽胞桿菌的程序性死亡

一般情況下，在營養(yǎng)缺陷時，枯草芽胞桿菌容易形成芽胞，這一過程由調節(jié)蛋白Spo0A介導[41]。Losick等提出，程序性死亡過程延遲了枯草芽胞桿菌形成芽胞的時間[42,43]。當營養(yǎng)缺陷時，群體中一部分細菌的Spo0A被激活，稱為“Spo0A-ON”細菌；剩下的細菌沒有被激活，稱為“Spo0A-OFF”細菌?！癝po0A-ON”細菌在芽胞形成早期，調節(jié)蛋白Spo0A上調表達skfA～H和sdpABC。skf操縱子在形成芽胞的過程中產生胞外殺傷因子，而skfE與skfF分別募集ATP結合蛋白與轉運復合體，從而將體內的殺傷因子泵出。同時，sdpABC也被誘導表達。SdpC是一個具有毒性的信號蛋白，細胞自身由于具有sdpRI操縱子而對其產生抗性。一般情況下，sdpRI操縱子受AbrB的抑制，而Spo0A蛋白可抑制AbrB的表達，使細菌免受SdpC的傷害?！癝po0A-OFF”細菌由于不能表達Spo0A蛋白，不能對抗毒素及SdpC，故出現(xiàn)程序性死亡[31]。

2.3 細菌程序性死亡與耐藥

令人驚訝的是，其他細菌體內也廣泛存在類似大腸埃希菌的TA系統(tǒng)，說明其在細菌生存過程中發(fā)揮一定作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，這種與生俱來的自殺現(xiàn)象與細菌生理學、細菌耐藥性和生物膜形成等有密切關系[26,44,45]。程序性死亡盡管在單個細菌中往往是一種消極反應，卻有利于群體的生長。已知細菌程序性死亡的作用主要有如下幾方面。①抵抗噬菌體感染蔓延[46]。Hazan等的實驗表明，溶源性噬菌體的感染對于缺失mazEF的大腸埃希菌是致死的，而同樣條件下野生細菌中檢測不到噬菌體，因為它們可通過MazEF的致死作用將那些已經感染的細菌殺死，避免噬菌體感染的蔓延。②保持細菌群體基因的穩(wěn)定[47]。由于細菌的繁殖迅速，每次分裂染色體都會發(fā)生不同程度損傷，通常這種損傷可由細菌擁有的修復機制予以修復。在修復系統(tǒng)無法修復的情況下，由MazEF介導的程序性死亡被激活，清除那些基因損傷的細菌，從而保持群體的基因穩(wěn)定。③對營養(yǎng)極度缺乏的反饋。在營養(yǎng)物質極度匱乏的環(huán)境中，細菌群體會通過使一部分細菌程序性死亡而獲得生存所需的營養(yǎng)，其代表是枯草芽胞桿菌的程序性死亡[33]。④與細菌耐藥相關?？股夭⒉恢苯託⑺兰毦?，而是通過造成細菌損傷使其自殺。在抗生素存在時，那些像多細胞生物一樣可以從缺陷細胞的程序性死亡中獲取更多生存機會的細菌更易產生耐藥性，否則會導致群體死亡。限制那些經過修復仍然有缺陷的細菌利用有限資源的能力對于細菌群體適應環(huán)境是十分重要的。如頑固耐藥菌內的程序性死亡過程是受抑制的，當細菌群體受到抗生素威脅時，頑固耐藥菌比其他細菌更易產生耐藥性[26]。

3 結語

細菌耐藥是一個復雜的過程，與細菌本身、宿主和環(huán)境這幾個因素密不可分。其中，對細菌自身的研究格外重要。生物膜和細胞程序性死亡是細菌群體性行為的兩個典型方面，研究它們的機制必將成為認識和對抗細菌耐藥的關鍵。

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