林楠森 宋軼琳 劉春秀 蔡新霞*

①(中國科學(xué)院電子學(xué)研究所傳感技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100190)

②(中國科學(xué)院研究生院 北京 100190)

1 引言

人體的神經(jīng)系統(tǒng)是由數(shù)以億計(jì)的神經(jīng)元組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，神經(jīng)系統(tǒng)中信息的編碼與處理在很大程度上是通過大量神經(jīng)元構(gòu)成的群體協(xié)同活動(dòng)完成的，因此對(duì)神經(jīng)元群體開展全面、準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)、同步的檢測(cè)，能夠獲得更為全面、有效的數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步揭示神經(jīng)信號(hào)傳遞、編碼與解碼的本質(zhì)提供可靠的幫助[1]。傳統(tǒng)的神經(jīng)電生理信號(hào)檢測(cè)手段可分為3類：(1)膜片鉗記錄、(2)胞內(nèi)記錄、(3)胞外記錄。檢測(cè)電極大都是以金屬微絲和玻璃微電極為主，存在檢測(cè)通道數(shù)少，操作繁瑣等缺點(diǎn)。隨著電子技術(shù)和微機(jī)械加工技術(shù)的發(fā)展，微電極陣列(Micro-Eelectrode Array, MEA)作為一種對(duì)傳統(tǒng)方法的加強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的高空間分辨率的檢測(cè)，并且大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，同時(shí)可以檢測(cè)幾十甚至上百個(gè)通道的電生理信號(hào)。目前在心臟研究、突出可塑性研究、神經(jīng)再生研究、高通量藥物篩選等研究領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用[2?4]。

雖然微電極陣列(MEA)技術(shù)具有以上的諸多優(yōu)點(diǎn)，但相較于傳統(tǒng)的檢測(cè)手段，微電極陣列所檢測(cè)到信號(hào)幅度偏低、信噪比不高，這和電極與待測(cè)神經(jīng)元接觸不夠緊密有關(guān)。例如在腦組織切片的實(shí)驗(yàn)中，切片表面會(huì)有一定厚度的死細(xì)胞層，阻礙了待測(cè)細(xì)胞和電極的接觸，導(dǎo)致檢測(cè)到的信號(hào)幅度往往比傳統(tǒng)方法小2-3個(gè)數(shù)量級(jí)[5,6]。

本文針對(duì)神經(jīng)微電極陣列信號(hào)檢測(cè)的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了多通道神經(jīng)電生理信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)多通道微電極信號(hào)的同步檢測(cè)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室自制平面微電極陣列進(jìn)行大鼠海馬區(qū)腦切片的電生理實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)到幅度范圍在幾十μV的自發(fā)神經(jīng)動(dòng)作電位。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 系統(tǒng)設(shè)計(jì)

檢測(cè)系統(tǒng)由硬件和軟件兩部分組成。其中硬件結(jié)構(gòu)框圖如圖1所示，包括微電極陣列接口模塊、多通道信號(hào)放大模塊、數(shù)據(jù)采集模塊，可以實(shí)現(xiàn)多通道的神經(jīng)電生理信號(hào)同步檢測(cè)，并將數(shù)據(jù)通過USB接口傳往計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)的實(shí)時(shí)處理。

圖1 神經(jīng)微電極陣列檢測(cè)系統(tǒng)硬件結(jié)構(gòu)框圖

軟件編寫從可靠性和靈活性考慮，本文采用Windows XP操作系統(tǒng)和Visual C++作為編程開發(fā)平臺(tái)。為保證多通道大數(shù)據(jù)量的實(shí)時(shí)處理，采用了多線程技術(shù)，可分為數(shù)據(jù)的采集、處理和顯示、存儲(chǔ)3個(gè)線程，線程之間的數(shù)據(jù)交換利用同步事件進(jìn)行控制。利用多級(jí)緩存隊(duì)列等技術(shù)保證系統(tǒng)具有高效的數(shù)據(jù)處理能力。軟件具備信號(hào)采集、實(shí)時(shí)顯示、存儲(chǔ)、FIR濾波、在線鋒電位甄別、回放等功能[7,8]。

2.2 微電極陣列接口模塊

微電極陣列是采用MEMS工藝加工的器件，尺寸十分微小，難以直接和檢測(cè)系統(tǒng)相連，圖2所示為用于組織切片或神經(jīng)細(xì)胞檢測(cè)的平面微電極陣列，中心檢測(cè)區(qū)域的電極尺寸為30 μm。

圖2 平面微電極陣列

因此本文通過電極接口模塊實(shí)現(xiàn)微電極和檢測(cè)系統(tǒng)的相連。接口模塊實(shí)物如圖3所示，通過焊接在印刷電路板上的彈性探針和微電極陣列的引線相接觸，4個(gè)角上的螺絲起固定和調(diào)節(jié)松緊的作用，電路板上同時(shí)焊接有標(biāo)準(zhǔn)的接插件，從而可直接和檢測(cè)電路相連。為屏蔽外界的電磁干擾，微弱信號(hào)走線的周圍都由地線包圍。

圖3 微電極陣列接口模塊

2.3 多通道信號(hào)放大模塊

神經(jīng)胞外記錄的信號(hào)幅度一般為幾十至幾百μV，頻率范圍在10-2000 Hz，而生物體自身或外界的噪聲信號(hào)往往會(huì)將有用信號(hào)淹沒。因而信號(hào)檢測(cè)電路必須有較高的增益、較低的輸入噪聲、合適的頻帶范圍以及較強(qiáng)的抗干擾能力，同時(shí)由于微電極的阻抗一般達(dá)到M?級(jí)，檢測(cè)電路的輸入阻抗至少要達(dá)到G?級(jí)才能保證信號(hào)的完整提取[9]。針對(duì)以上信號(hào)的檢測(cè)特點(diǎn)，本文設(shè)計(jì)的電生理信號(hào)的檢測(cè)電路由前置放大器、帶通濾波、后級(jí)放大組成。

為保證系統(tǒng)對(duì)噪聲干擾的抑制作用，采用儀表放大器AD620作為前置放大電路，可以獲得較低的輸入噪聲、較高的輸入阻抗以及共模抑制比。傳統(tǒng)的一些前置放大器采取交流耦合的方式以消除直流的極化電壓(幾十到幾百 mV)，防止放大電路的飽和。但阻容元件的引入會(huì)降低共模抑制比，還會(huì)使系統(tǒng)的通頻帶發(fā)生偏移，而且由于運(yùn)放的偏置電流會(huì)對(duì)電容進(jìn)行充電，導(dǎo)致在微電極上出現(xiàn)直流電壓，進(jìn)而會(huì)使電極發(fā)生電解反應(yīng)，縮短電極的使用壽命。因此本文采取直流耦合的方式檢測(cè)，為防止直流極化電壓導(dǎo)致放大器飽和，AD620的增益為10，其后接截止頻率為10 Hz的高通濾波器濾除直流極化電壓的干擾。神經(jīng)電信號(hào)大致可分為兩類：一類是變化較為緩慢的場(chǎng)電位，這類信號(hào)的頻率主要集中在300 Hz以下，另一類為快速變化的動(dòng)作電位，頻率在 300-1000 Hz。所以本文的系統(tǒng)選頻范圍為10-3000 Hz，能夠同時(shí)記錄到場(chǎng)電位和動(dòng)作電位，再通過軟件的數(shù)字濾波功能將這兩類電位分離開。對(duì)于來自工頻的干擾，傳統(tǒng)的電生理檢測(cè)電路加入50 Hz陷波器以濾除工頻干擾，但神經(jīng)電生理信號(hào)的一部分信息也同樣會(huì)被濾除，而且工頻的諧波成分同樣還存在，因此本文主要是通過提高系統(tǒng)的共模抑制比 (Common Mode Rejection Ratio, CMRR)和接地屏蔽措施來排除外界電磁干擾的影響，對(duì)于工頻干擾特別嚴(yán)重的情況還可以通過系統(tǒng)軟件的數(shù)字濾波功能來濾除。

2.4 數(shù)據(jù)采集模塊

由于神經(jīng)電生理信號(hào)的頻率主要分布在 2000 Hz以下的頻段內(nèi)，為了對(duì)原始信號(hào)較好地復(fù)原，系統(tǒng)的采樣率應(yīng)不低于10 kHz。本系統(tǒng)的數(shù)據(jù)采集卡選用北京阿爾泰科技發(fā)展有限公司的 USB2080型數(shù)據(jù)采集卡，具有400 kHz, 14 bit的數(shù)據(jù)采集能力。

2.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取材及電生理信號(hào)記錄

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用2-3周大的SD大鼠(Sprague-Dawley)。為保證腦組織的活性，在未注射麻醉的情況下對(duì)大鼠采取快速斬首法，用眼科剪和眼科鑷將腦部迅速取出，放入0oC的人工腦脊液中進(jìn)行快速冷凍，并通以95% O2和5% CO2的配比氧。其中人工腦脊液(Artificial CerebroSpinal Fluid, ACSF)的成分為NaCl 124 mmol/L, KC14 mmol/L,MgSO4·7H2O 2 mmol/L, Ca.Cl22 mmol/L,NaHCO326 mmol/L, NaH2PO4· 2H2O 1.25 mmol/L, Glucose 10 mmol/L, pH值為7.2。1 min后取出，用切片機(jī)將海馬區(qū)切成厚度為300 μm左右的腦片，放入37oC的人工腦脊液中(通以配比氧)孵育1 h左右。

將經(jīng)過孵育的腦片移至實(shí)驗(yàn)室自制的平面微電極陣列表面。在顯微鏡下對(duì)其進(jìn)行定位，用移液槍和濾紙將多余液體吸盡，保證腦片和微電極陣列之間能夠緊密貼合，用尼龍網(wǎng)或腦片夾壓在腦片上防止灌流時(shí)漂移。上述準(zhǔn)備工作完成后對(duì)腦片進(jìn)行灌流，用本檢測(cè)系統(tǒng)接上電極進(jìn)行檢測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 系統(tǒng)參數(shù)測(cè)試

實(shí)驗(yàn)過程中基線的寬度很大一部分是由電子元器件的噪聲組成，如電路中阻容元件的熱噪聲；半導(dǎo)體器件的散彈噪聲、1/f噪聲、爆裂噪聲；電源的紋波噪聲。基線過寬勢(shì)必會(huì)造成有用信號(hào)難以分辨，降低信噪比，因此系統(tǒng)的輸入噪聲一定要遠(yuǎn)小于待測(cè)信號(hào)的幅度。同時(shí)系統(tǒng)的放大增益、帶寬范圍、共模抑制比等參數(shù)對(duì)于微弱信號(hào)檢測(cè)也非常重要。為了對(duì)系統(tǒng)的性能進(jìn)行評(píng)估，對(duì)包括以上各主要參數(shù)進(jìn)行了測(cè)試，圖4表示的是系統(tǒng)輸入短路時(shí)的等效輸入噪聲，其幅度Vpp=7-8 μV，Vpp為峰-峰電壓。

圖4 系統(tǒng)的等效輸入噪聲

為了測(cè)試系統(tǒng)的增益，利用Vpp=2 mV的100 Hz正弦波作為信號(hào)源，通過檢測(cè)系統(tǒng)的輸出即可得到系統(tǒng)的增益。如圖5(a)所示，系統(tǒng)的輸出幅度為Vpp=2 V，即系統(tǒng)的增益為60 dB。改變正弦波的頻率，便可得到系統(tǒng)在各頻率點(diǎn)上的增益，即帶寬范圍。如圖5(b)所示，系統(tǒng)的帶寬為10-3000 Hz，其中在大于低通截止頻率時(shí)，信號(hào)的衰減率為-80 dB；在小于高通截止頻率時(shí)，信號(hào)的衰減率為-60 dB。

圖5 系統(tǒng)的增益和帶寬

為了驗(yàn)證系統(tǒng)的微弱信號(hào)檢測(cè)能力，在其通帶范圍內(nèi)選擇100 Hz, 300 Hz, 500 Hz, 700 Hz, 900 Hz的Vpp=2 mV正弦波作為輸入，通過判斷檢測(cè)信號(hào)的信噪比判斷系統(tǒng)的性能。圖6所示為系統(tǒng)輸出信號(hào)的頻譜圖，由圖可知對(duì)各模擬信號(hào)源所檢測(cè)到的信號(hào)信噪比都在20 dB以上。因此系統(tǒng)的檢測(cè)下限可以達(dá)到微伏級(jí)，能夠滿足神經(jīng)電生理信號(hào)的檢測(cè)需要。

圖6 系統(tǒng)輸出信號(hào)的頻譜圖

此外還對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的其它主要的參數(shù)指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)試，具體見表1。

表1 檢測(cè)系統(tǒng)各項(xiàng)參數(shù)

3.2 神經(jīng)電生理信號(hào)檢測(cè)

利用平面微電極陣列對(duì)急性海馬腦切片進(jìn)行檢測(cè)，往往會(huì)遇到組織與電極的貼合不緊密以及電極不能刺穿表面死細(xì)胞層的阻隔等問題，檢測(cè)到的神經(jīng)胞外信號(hào)一般小于100 μV。

圖7為利用實(shí)驗(yàn)室自制微電極陣列和本檢測(cè)系統(tǒng)所記錄到的神經(jīng)電生理活動(dòng)信息，其中圖7(a)顯示神經(jīng)元的陣發(fā)排放型放電活動(dòng)，其特點(diǎn)是暴發(fā)期間隔很長(zhǎng)，但在放電期波形較為集中。圖7(b)顯示的是神經(jīng)元的緊張發(fā)放型放電活動(dòng)，其特點(diǎn)是放電極為迅速，放電頻率也很高。通過閾值法將圖7(b)中的動(dòng)作電位提取出來并疊加在一起可得到如圖7(c)所示的動(dòng)作電位波形圖，從圖中可以明顯的看出神經(jīng)元放電的去極化和復(fù)極化過程。動(dòng)作電位的幅度在30 μV左右，周期為2-3 ms，符合胞外記錄的信號(hào)特點(diǎn)。由于系統(tǒng)的輸入噪聲僅為Vrms=2 μV，同時(shí)具有較高的共模干擾抑制比和較好的電磁屏蔽設(shè)計(jì)，所以可很好地分辨出細(xì)胞放電信號(hào)和噪聲基線。

圖7 系統(tǒng)所檢測(cè)到的神經(jīng)電生理信號(hào)

4 結(jié)束語

在基于微電極陣列的神經(jīng)電生理信號(hào)檢測(cè)中，信號(hào)的幅度十分微弱，易于被生物體自身的噪聲或外界電磁干擾所淹沒。本文針對(duì)上述檢測(cè)難點(diǎn)，采用微弱信號(hào)放大技術(shù)、電磁屏蔽技術(shù)、數(shù)字信號(hào)處理技術(shù)等方法，在系統(tǒng)硬件和軟件設(shè)計(jì)上保證微弱信號(hào)的高信噪比檢測(cè)。系統(tǒng)的輸入噪聲Vrms＜2 μV，增益為60 dB，共模抑制比大于90 dB，頻率帶寬范圍為10-3000 Hz。通過對(duì)系統(tǒng)參數(shù)的測(cè)試和SD大鼠海馬腦區(qū)切片的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，表明本文所設(shè)計(jì)的多通道神經(jīng)電生理信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)各項(xiàng)參數(shù)能夠滿足微弱神經(jīng)信號(hào)的提取和檢測(cè)。該儀器在神經(jīng)科學(xué)基礎(chǔ)研究、神經(jīng)性疾病研究及藥物篩選方面具有潛在的應(yīng)用前景。

致謝 感謝北京大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面所提供的幫助。

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