周梅華，魯 嚴(yán)

人黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)條件的研究進(jìn)展

周梅華，魯 嚴(yán)

從培養(yǎng)人黑素細(xì)胞的基本培養(yǎng)液、添加劑、紫外線以及共培養(yǎng)系統(tǒng)等方面綜述安全、有效的黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)條件的研究進(jìn)展；同時總結(jié)了人毛囊無色素性黑素細(xì)胞、永生化黑素細(xì)胞的培養(yǎng)條件，對色素疾病的基礎(chǔ)研究及臨床治療有重要意義。

黑素細(xì)胞；培養(yǎng)條件

[J Pract Dermatol, 2011, 4(1):30-33]

黑素細(xì)胞（melanocyte，MC）體外培養(yǎng)是研究黑素細(xì)胞增殖及黑素合成過程、揭示色素沉著異常及色素性疾病的病因、病理生理等的重要手段。黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)的組織來源主要是人的表皮，常采用負(fù)壓吸引水皰法、淺表皮膚活檢術(shù)、包皮環(huán)切術(shù)等獲取[1,2]。取下的表皮可單獨(dú)或聯(lián)合使用胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）、中性蛋白酶（Dispase Ⅱ）等進(jìn)行消化[1-3]，獲得黑素細(xì)胞懸液，進(jìn)行培養(yǎng)。近年來廣大學(xué)者在黑素細(xì)胞的體外培養(yǎng)條件方面不斷探索, 取得了一定的進(jìn)展，現(xiàn)綜述如下。

1 黑素細(xì)胞的培養(yǎng)條件

1.1 黑素細(xì)胞基本培養(yǎng)液

黑素細(xì)胞的基本培養(yǎng)液主要提供黑素細(xì)胞生長的最低需求，包括改良Eagle培養(yǎng)基（dulbecco modifed eagle medium，DMEM）、Ham培養(yǎng)液、RPMI1640培養(yǎng)液等[2-4]。DMEM是在細(xì)胞生長最低必需培養(yǎng)基（minimum essential medium，MEM）的基礎(chǔ)上改良制成，適用于多種細(xì)胞系和組織的生長。Ham培養(yǎng)液包含Ham'F10 、Ham'F12，適用于細(xì)胞克隆化培養(yǎng)，其中F10適用于人二倍體細(xì)胞；F12在配方中添加了一定量的微量元素，可以在血清含量較少（2%～10%）的情況下培養(yǎng)細(xì)胞。RPMI1640培養(yǎng)基廣泛適用于黑素細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的原代和繼代培養(yǎng)。

1.2 抑制成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞生長

抑制成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞生長是保障成功純化培養(yǎng)黑素細(xì)胞的先決條件。常用抑制劑有12-0-十四酰佛波醇l3-乙酸酯（TPA）+霍亂毒素（CT），抑制成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞貼附和生長，但由于TPA具有強(qiáng)致癌性，CT也是一種神經(jīng)毒素，所培養(yǎng)黑素細(xì)胞的安全性受到質(zhì)疑，臨床應(yīng)用受到限制；還可以應(yīng)用基因素（geneticin），選擇性去除快速增殖的成纖維細(xì)胞，Hu等[3]在黑素細(xì)胞培養(yǎng)基中加入100ug/ml的geneticin，5～7天污染的成纖維細(xì)胞全部被去除；此外國內(nèi)有學(xué)者使用自制的抗角蛋白自身抗體（antikeratin auto antibody，AK auto Ab）可選擇性去除角質(zhì)形成細(xì)胞。

1.3 添加劑作用

正常情況下，體外培養(yǎng)的黑素細(xì)胞生長緩慢、增殖能力弱，因此需要在黑素細(xì)胞培養(yǎng)基中添加各種因子以刺激黑素細(xì)胞增殖、分化及黑素形成，根據(jù)其作用可分為以下幾種。

1.3.1 促進(jìn)黑素細(xì)胞的增殖和分化作用

TPA：TPA在黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)中不僅能抑制成纖維細(xì)胞及角質(zhì)形成細(xì)胞生長，還能促進(jìn)黑素細(xì)胞的增殖和分化。二脂酰甘油/蛋白激酶C（DAG/PKC）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和生長的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。TPA可取代DAG活化PKC，刺激黑素細(xì)胞的增殖，增加樹突，促進(jìn)黑素細(xì)胞的附著。1982年M Eisinger等在培養(yǎng)基中添加TPA、CT等，首次體外培養(yǎng)黑素細(xì)胞取得成功，這一方法后被許多學(xué)者采用。但由于TPA是強(qiáng)致癌劑，體內(nèi)不易代謝。當(dāng)用TPA慢性處理細(xì)胞時，可引起PKC持續(xù)活化、降解，最終使細(xì)胞內(nèi)PKC耗竭，進(jìn)而對外部抑制信號的反應(yīng)性降低，細(xì)胞不斷地增殖，存在一定的致癌風(fēng)險。因此限制了臨床應(yīng)用。

CT和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）：環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A （cAMP/PKA）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化中具有重要的調(diào)節(jié)作用。CT是PKA的激動劑，而IBMX為磷酸二酯酶抑制劑,減少細(xì)胞內(nèi)cAMP分解。CT和IBMX通過不同方式激活cAMP/PKA途徑，提高細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平，促使黑素細(xì)胞分裂。Chen等[5]采用Hu16 培養(yǎng)基（在F12基本培養(yǎng)液中添加bFGF、IBMX、CT、FCS），獲得自體純黑素細(xì)胞懸液, 移植治療120例白癜風(fēng)患者。由于CT是一種神經(jīng)毒素,而IBMX不是人體自然存在物質(zhì)，所培養(yǎng)的黑素細(xì)胞安全性受到質(zhì)疑。

生長因子類：許多生長因子具有刺激受體型酪氨酸激酶的絲裂原活性，通過絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）級聯(lián)途徑，促進(jìn)體外黑素細(xì)胞的大量增殖。

①堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）：bFGF是一種廣譜有絲分裂劑，可以刺激黑素細(xì)胞的生長,是黑素細(xì)胞的天然分裂劑。bFGF刺激絲裂原激活的蛋白激酶2（MAPK2）和轉(zhuǎn)錄因子Ca2+/cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（CREB），通過MAPK級聯(lián)反應(yīng)使黑素細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期， 促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖。bFGF不僅是黑素細(xì)胞的促分裂劑，還是酪氨酸酶受體和蛋白激酶C（PKC）的激活劑，通過形成bFGF→激活酪氨酸激酶→激活酪氨酸酶→黑素生成這一級聯(lián)反應(yīng)，刺激黑素細(xì)胞色素的生成及樹突生長。

②肝細(xì)胞生長因子（HGF）：HGF是一種多功能的生物因子，它能夠刺激多種上皮、內(nèi)皮和間質(zhì)細(xì)胞的生長、血管生成、免疫調(diào)節(jié)活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖、移動和侵襲[6]。HGF的受體C-MET具有酪氨酸激酶活性，通過C-MET激活MAPK途徑發(fā)揮多種功能。在黑素細(xì)胞培養(yǎng)基中加入HGF能夠促進(jìn)黑素細(xì)胞的增殖和分化，而在其中加入抗HGF的抗體則能抑制成黑素細(xì)胞和黑素細(xì)胞的增殖[7]。實(shí)驗(yàn)表明HGF能促進(jìn)眼睛和皮膚的黑素細(xì)胞生長。

③粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）：GM-CSF由角質(zhì)形成細(xì)胞分泌，與特定受體GMCSFR結(jié)合，通過激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白及轉(zhuǎn)錄活化劑（STAT-1、STAT-3和STAT-5）或促分裂原活化蛋白激酶（MAPK），誘導(dǎo)黑素細(xì)胞增殖必需蛋白的增量調(diào)節(jié)[8]，參與調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞的增殖與分化。Hirobe 等[9]將小鼠黑素細(xì)胞置于加入GM-CSF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，GM-CSF誘導(dǎo)了黑素細(xì)胞的增殖和分化，在其中加入抗GM-CSF的抗體則抑制黑素細(xì)胞的增殖和分化，而對照組無反應(yīng)。

④內(nèi)皮素（ET）：內(nèi)皮素（ET）是體內(nèi)天然存在的生理性因子，其家族成員包括ET-1、ET-2、ET-3。ET可以通過酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-l（TRP-1）、MAPK、PKC、PKA等信號通路促進(jìn)人黑素細(xì)胞（MC）的增殖和黑素合成，其中ET-1效果最顯著。ET-1具有促黑素細(xì)胞增殖、黑素生成、樹突形成、細(xì)胞粘附、移行以及防止紫外線照射引起的MC凋亡等多種作用[10]。小眼相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄因子（Mitf）能夠啟動酪氨酸酶基因，是黑素細(xì)胞增殖和黑素合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。ET-1可通過結(jié)合內(nèi)皮素-B受體使絲裂原激動蛋白激酶（ERK1/2）磷酸化，激活Mitf，促進(jìn)培養(yǎng)黑素細(xì)胞樹突數(shù)量增加，延長樹突長度，并呈劑量依賴性[11]。Szabad等[12]認(rèn)為bFGF、內(nèi)皮素-1、α–MSH三者合用可以替代TPA和牛垂體浸膏（BPE）在體外培養(yǎng)黑素細(xì)胞的增殖作用。

⑤干細(xì)胞因子（SCF）：皮膚中的SCF主要來源于成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。SCF與黑素細(xì)胞表面的受體（KIT）結(jié)合，當(dāng)KIT受體被激活后，上調(diào)Mitf的磷酸化作用，激活TYR基因，使皮膚中的黑素前體細(xì)胞首先分化成Mitf+細(xì)胞和TRP-2+細(xì)胞,然后這些細(xì)胞再轉(zhuǎn)變成成熟的TRP-1+細(xì)胞[13]。SCF/KIT途徑在維持黑素細(xì)胞的存活、誘導(dǎo)遷移、促進(jìn)增殖與分化中起了極為關(guān)鍵的作用。最新發(fā)現(xiàn)ET-1和SCF在cAMP和bFGF的協(xié)同作用下可以調(diào)節(jié)人類黑素細(xì)胞的生命周期，促進(jìn)黑素細(xì)胞的增殖和分化[14]。

1.3.2 促黑素形成作用

α-黑素細(xì)胞刺激素（α-MSH）：α-MSH是一種內(nèi)源性神經(jīng)肽，來源于其前體激素阿黑皮素原（POMC）。α-MSH和黑皮素受體-1（MC-1R）結(jié)合,活化腺苷酸環(huán)化酶，提高細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）濃度，從而增強(qiáng)酪氨酸酶（TYR）的合成及表達(dá),促進(jìn)黑素合成。α-MSH還可促進(jìn)黑素細(xì)胞（MC）樹突形成，但機(jī)制尚不清楚，可能受MC1R介導(dǎo)的胞內(nèi)多種信號途徑的調(diào)控。在含α-MSH的培養(yǎng)條件下，體外培養(yǎng)的MC形成樹突的數(shù)目增加，形態(tài)亦更接近于體內(nèi)狀態(tài)。

ET-1是一種纖維原細(xì)胞增長因子。ET-l在黑素生成過程中的作用與SCF/c-kit系統(tǒng)有關(guān)[15]。ET-1和α-MSH相互協(xié)同,通過增加酪氨酸酶的活性、提高酪氨酸酶相關(guān)蛋白1, 2的水平來刺激黑素的合成。

bFGF不僅是黑素細(xì)胞的促分裂劑,還是酪氨酸酶受體和蛋白激酶C（PKC）的激活劑,刺激黑素細(xì)胞色素的生成及樹突生長。

1.4 其他添加劑

血清能提供細(xì)胞增殖所必需的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子，由于血清成分不明,胎牛血清可能包含異體蛋白而導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)。Czajkowski等[17]運(yùn)用無血清培養(yǎng)基（melanocyte growth medium，M2）培養(yǎng)黑素細(xì)胞,成功建立了原代培養(yǎng)，但有一半的患者無法獲得移植所需的足夠的細(xì)胞株。無TPA/CT和胎牛血清（FCS）的培養(yǎng)基雖然能獲得用于臨床移植的安全細(xì)胞株，但同時減少了黑素細(xì)胞的增殖率，這大大延長了培養(yǎng)時間，有時甚至導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。

2 紫外線對體外培養(yǎng)黑素細(xì)胞的作用

紫外線是一種外源性的促細(xì)胞分裂劑。表皮存在一個復(fù)雜的旁分泌和自分泌網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)著人類黑素細(xì)胞的生存、增殖和功能，這個網(wǎng)絡(luò)通過紫外線作用而上調(diào)。受紫外線上調(diào)的因子包括α-MSH、ET-1、GM-CSF、SCF、bFGF、一氧化氮（NO）和組織胺等因子。中波紫外線UVB能夠刺激黑素細(xì)胞的增殖、移行及黑素合成。UVB誘導(dǎo)黑素生成是通過一氧化氮/環(huán)磷酸鳥苷/蛋白激酶G（NO/cGMP/PKG）途徑介導(dǎo)的。Larsson等[16]研究表明UVB誘導(dǎo)產(chǎn)生的黑素細(xì)胞DNA損傷片段可以激活酪氨酸酶的活性，從而促進(jìn)黑素合成。Mulekar[18]在培養(yǎng)黑素細(xì)胞時加照紫外線，培養(yǎng)出的黑素細(xì)胞較未照紫外線的黑素細(xì)胞明顯活躍，表現(xiàn)為雙極、三極或多極樹突狀，數(shù)量明顯增加，細(xì)胞輪廓較明顯，移植活性更強(qiáng)。UVB還可以促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞釋放促黑素細(xì)胞增殖分化的因子如內(nèi)皮素-1、IL-1a、成纖維細(xì)胞生長因子等。且UVB具有免疫抑制作用，可使移行及增殖的黑素細(xì)胞免受破壞。

3 黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞或成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)

角質(zhì)形成細(xì)胞（KC）可分泌多種細(xì)胞因子，包括α–MSH、bFGF、神經(jīng)生長因子（NGF）、內(nèi)皮素（ET）、白介素- 1（IL-1）、GM-CSF及干細(xì)胞因子等，通過受體介導(dǎo)的信號通路調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞的增殖和分化。KC對MC的生物學(xué)性狀也非常重要，MC可在移植部位形成色素沉著，而KC促進(jìn)傷口快速愈合而不留瘢痕, 可獲得色素恢復(fù)和皮損愈合的雙重功效。因此角質(zhì)形成細(xì)胞-黑素細(xì)胞共培養(yǎng)移植被眾多學(xué)者采用。當(dāng)共培養(yǎng)中的KC密度過高時，可引起MC數(shù)目下調(diào)、活力下降。Eves等[19]建立了一種適合KC和MC共培養(yǎng)系統(tǒng)-化學(xué)成分處理的基質(zhì)(丙烯酸、丙烯胺或這兩種單體的混合物與血漿聚合產(chǎn)生)和M2無血清培養(yǎng)基相結(jié)合，可以解決上述問題。

成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的有絲分裂原可影響黑素細(xì)胞的生物學(xué)特征。Imokawa等發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)4天的成纖維細(xì)胞介質(zhì)可顯著刺激黑素細(xì)胞DNA的合成，且取自老化皮膚的纖維細(xì)胞的這種作用高于年輕皮膚的成纖維細(xì)胞。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)兩者的介質(zhì)中前者的HGF、干細(xì)胞因子高于后者，且加入抗HGF或抗SCF后，MC DNA合成下降32%，說明成纖維細(xì)胞分泌的HGF和SCF可刺激MC的DNA合成。

4 人毛囊無色素性黑素細(xì)胞（AMMC）培養(yǎng)

黑素細(xì)胞起源于神經(jīng)嵴，在胚胎發(fā)育2～5 周開始向表皮和毛囊移行[20]。研究表明毛囊無色素性黑素細(xì)胞（AMMC）可以作為皮膚黑素細(xì)胞的儲庫，給白癜風(fēng)的治療提供黑素細(xì)胞來源。由于AMMC在毛囊中的含量少，體外生長增殖緩慢，易被角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞污染，但可通過添加一些特殊的促生長因子純化培養(yǎng)AMMC。這些因子包括：①多肽類生長因子：如表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、SCF；②提高細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷水平的因子，如霍亂毒素；③蛋白激酶激動劑，如IBMX，TPA等[21]。培養(yǎng)中采用差別胰酶法去除角質(zhì)形成細(xì)胞的污染[22]，采用100μg/ml的geneticin 處理去除成纖維細(xì)胞污染[21]。

5 永生化黑素細(xì)胞培養(yǎng)

通過轉(zhuǎn)染外源性基因，能夠調(diào)控和影響細(xì)胞的生長周期和增殖，獲得正常黑素細(xì)胞來源的永生化細(xì)胞株，為臨床研究提供細(xì)胞來源。常用的外源性基因有SV40T抗原、HPV的E6/E7、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶等等，均成功構(gòu)建了永生化的細(xì)胞系。由于誘導(dǎo)細(xì)胞的永生化多是外源性的原癌基因，存在潛在致癌性和病毒感染的可能，一定程度上限制了在臨床中的應(yīng)用。Eaton等[23]提出利用Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)聯(lián)合SV40TAg基因，使細(xì)胞既能無限增殖又無潛在的致癌性，可安全用于臨床。

6 結(jié)語

建立新型、安全、高效、經(jīng)濟(jì)的黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，為黑素細(xì)胞基礎(chǔ)研究及臨床黑素細(xì)胞移植治療白癜風(fēng)提供理想的細(xì)胞來源，特別是后者臨床療效具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Conditions of human melanocytes in vitro culture

ZHOU Mei-hua，LU Yan
Department of Dermatology and Venereology, the First Affliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China

This article summarys safe and effective cultured conditions of human melanocytes in vitro from the basic culture medium, additives, UV and co-culture system. Besides, it sum up the cultured conditions of the hair follicle amelanotic melanocytes and immortalized melanocytes. It is of great significance to the basis research and clinical treatment of the pigment diseases.

Melanocyte；Cultured conditions

R329.499.1

A

1674-1293(2011)01-0030-04

周梅華

2010-09-07

2011-01-20）

（本文編輯 祝賀）

江蘇省社會發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（BS2007072）

210029，南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科（周梅華，魯嚴(yán)）

周梅華，女，碩士研究生，研究方向：皮膚色素性疾病，E-mail: zmhsmm@163.com.cn

魯嚴(yán)，E-mail: luyan1971@yahoo.com.cn