陳映丹 陸春 李美榮 馬寒 尹頌超 鄭智心 李海儀 席麗艷 馮佩英

(1.廣州市中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚科，廣州 510630；2.廣州市中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院皮膚科，廣州 510120)

Fonsecaea monophora黑素的理化性質(zhì)及其合成途徑的分析研究

目的 探討Fonsecaeamonophora黑素的理化性質(zhì)及其合成途徑。方法 通過(guò)化學(xué)分析、紫外光譜、紅外光譜和電子順磁共振波譜等明確F.monophora黑素的理化性質(zhì)；通過(guò)比對(duì)F.monophora菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (PDA)培養(yǎng)基、L-DOPA PDA培養(yǎng)基)和含黑素抑制劑培養(yǎng)基 (DOPA黑素抑制劑培養(yǎng)基、DHN黑素抑制劑培養(yǎng)基)的菌落生長(zhǎng)情況，采用BioTek酶標(biāo)儀EON定量分析其黑素合成，以明確F.monophora的黑素合成途徑。結(jié)果F.monophora黑素與合成L-DOPA黑素的理化性質(zhì)相似；菌株在含L-DOPA培養(yǎng)基較PDA培養(yǎng)基產(chǎn)生更多的黑素，且在含DOPA黑素抑制劑疊氮化鈉及DHN黑素抑制劑苯肽、三環(huán)唑培養(yǎng)基中其黑素合成均明顯降低。結(jié)論F.monophora黑素主要為L(zhǎng)-DOPA黑素，可能共同存在DOPA黑素和DHN黑素合成途徑。

Fonsecaeamonophora；黑素；理化性質(zhì)；合成途徑

[Chin J Mycol，2017，12(3):129-134]

著色霉屬是著色芽生菌病的主要致病菌屬，主要包含4個(gè)致病菌種：裴氏著色霉、Fonsecaeamonophora、Fonsecaeanubica和Fonsecaeapugnacius[1]。分子流行病學(xué)顯示[2]，裴氏著色霉主要流行于中南美洲，而F.monophora和F.nubica分布于世界各地，而在我國(guó)南方地區(qū)著色芽生菌病病原菌F.monophora占75%，F(xiàn).nubica占25%，尚未發(fā)現(xiàn)裴氏著色霉[3-4]。黑素是暗色真菌的重要毒力因子。Franzen等[5-6]研究發(fā)現(xiàn)裴氏著色霉分生孢子、菌絲和硬殼小體在體內(nèi)、外均可合成黑素，主要為經(jīng)DHN途徑合成胞外可溶性和與胞壁結(jié)合的黑素。胞外的可溶性色素可刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)性作用，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞對(duì)菌體的吞噬能力及氧化殺傷效應(yīng)[7]，而胞壁上的黑素具有抵御H2O2及NO的氧化殺傷作用[8]。Fonsecaeamonophora與裴氏著色霉是否具有相同的黑素和功能？有研究顯示同一菌屬不同菌種間的黑素性質(zhì)及合成途徑存在差異，例如，黑曲霉、黃曲霉和溜曲霉 (Aspergillustamarii)經(jīng)DOPA途徑合成黑素，而土曲霉和塔賓曲霉 (Aspergillustubingensis)經(jīng)DHN途徑合成黑素[9]。本研究主要探討F.monophora黑素性質(zhì)及合成途徑，將有助于闡明該菌在著色芽生菌病中的致病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 菌株和材料

本研究所用的F.monophora菌株CBS 122845分離自一男性著色芽生菌病患者手背皮損組織，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定[10]，保存于中山大學(xué)孫逸仙醫(yī)院醫(yī)學(xué)真菌研究中心。

左旋多巴 (L-DOPA)、合成L-DOPA黑素、曲酸、苯肽、三環(huán)唑、疊氮化鈉、二甲基亞砜 (DMSO)、吐溫20均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，硼酸、硼砂、一水檸檬酸和檸檬三鈉均購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠，連二亞硫酸鈉 (Na2S2O4)、30%過(guò)氧化氫 (H2O2)、次氯酸鈉 (NAClO)等化學(xué)試劑均購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠。儀器有：DU-730紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì) (美國(guó)Beckman公司)，連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 (BioTek 酶標(biāo)儀EON)，傅里葉變換紅外光譜儀 (美國(guó)FT-IR NICOLET 6700)，電子順磁共振 (electron paramagnetic resonance，EPR)波譜儀 (日本JEOL JES-FA200)。

1.2 方法

Fonsecaeamonophora黑素的提取與提純 將F.monophora菌株轉(zhuǎn)種于PDA平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d以活化。參考酵母細(xì)胞胞壁黑素粗提取方法[11]提取黑素。采用0.02 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液 (pH=7.0)重懸菌體，于121℃高溫加熱后，離心收集上清液，然后采用酸堿法進(jìn)一步提純黑素。

Fonsecaeamonophora黑素化學(xué)性質(zhì)分析 參考Kumar等[12]研究方法分析黑素的化學(xué)性質(zhì)，具體方法如下：

1)溶解試驗(yàn)：取提純的F.monophora黑素、合成L-DOPA黑素各約2 mg分別放在盛有2 mL蒸餾水、1 mol/L鹽酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、100 mmol/L硼酸鹽緩沖液、DMSO和有機(jī)溶劑 (甲醇、乙醇、正丁醇、異戊醇、丙酮、乙腈、氯仿、乙酰乙酯、石油醚)中，充分混勻，觀察溶液顏色及黑素溶解性。

2)氧化還原性:將提純的F.monophora黑素按1∶9比例分別與10%NaClO、30%H2O2和5%Na2S2O4充分混勻，觀察溶液的顏色變化。

Fonsecaeamonophora黑素光譜分析

1)紫外-可見(jiàn)光譜分析：參考Sajja等[13]研究方法，使用100 mmol/L的硼酸鹽緩沖液配制提純黑素為100 μg/mL的基礎(chǔ)黑素溶液，分別按1∶1、1∶2、1∶3的比例稀釋后在紫外分光光度計(jì)190～900 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行連續(xù)掃描。

2)紅外光譜分析：取干燥的F.monophora黑素、合成L-DOPA黑素分別與干燥溴化鉀混勻研磨壓片后,在波長(zhǎng)4 000～400 cm-1進(jìn)行紅外光譜掃描。

3)EPR測(cè)定：參考Liu等[14]研究方法調(diào)制EPR波譜儀參數(shù)如下：調(diào)制頻率，100.0 kHz；調(diào)制幅度，1.000 G；微波功率，9.874321 GHz；微波頻率，4.95 mw；中心磁場(chǎng)強(qiáng)度，3 513.320 G，掃描寬度，100 G；掃描時(shí)間，81.44 s。

Fonsecaeamonophora黑素合成途徑分析 真菌黑素主要通過(guò)DOPA黑素合成途徑和DHN黑素合成途徑進(jìn)行，通過(guò)加入黑素合成前體 (L-DOPA)、DOPA黑素合成抑制劑 (曲酸和疊氮化鈉)、DHN黑素合成抑制劑 (苯肽和三環(huán)唑)，觀察菌落、菌體色素改變和黑素含量變化，以明確F.monophora黑素合成途徑。

1)培養(yǎng)基制備：將L-DOPA (1 mol/L鹽酸溶解)、曲酸和疊氮化鈉 (ddH2O溶解)、苯肽和三環(huán)唑 (0.5%無(wú)水乙醇溶解)分別加入高溫滅菌后冷卻至50℃的PDA培養(yǎng)基中，充分混勻，獲取含濃度1 mmol/L L-DOPA、200 mg/L曲酸、0.05 mmol/L疊氮化鈉、100 mg/L苯肽、100 mg/L三環(huán)唑的PDA培養(yǎng)基，靜置冷卻后4℃冰箱保存?zhèn)溆?。PDA為L(zhǎng)-DOPA、曲酸、疊氮化鈉組和無(wú)水乙醇組的空白對(duì)照；含無(wú)水乙醇的PDA為苯肽組和三環(huán)唑組的空白對(duì)照。

2)培養(yǎng)：挑取約0.5 mg PDA斜面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的菌落加入含0.1%吐溫20的5 mL生理鹽水中,充分混勻，采用無(wú)菌棉簽將菌液均勻地涂布于上述制備的培養(yǎng)基，倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，肉眼觀察菌落和培養(yǎng)基顏色變化，光學(xué)顯微鏡下觀察菌體結(jié)構(gòu)和顏色改變。

3)Fonsecaeamonophora黑素的定量分析：同樣采用上述細(xì)胞胞壁黑素粗提取方法提取各組培養(yǎng)基菌落黑素，以硼酸鹽緩沖液配置100 μg/mL合成L-DOPA黑素溶液按比例稀釋后酶標(biāo)儀400 nm下制定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，然后根據(jù)各組標(biāo)本的吸光度算出其含有的黑素總量，比較各組標(biāo)本單位菌量的黑素含量。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，連續(xù)性變量符合正態(tài)分布的使用t檢驗(yàn)，不符合的用Wilcoxon非參數(shù)檢驗(yàn)，離散型變量采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 化學(xué)性質(zhì)

提純的F.monophora黑素與人工合成L-DOPA黑素理化性質(zhì)相似。外觀均為黑色顆粒，均不溶于水、酸及常見(jiàn)的有機(jī)溶液，但可溶于堿性溶液、硼酸鹽緩沖液 (pH=8)及DMSO溶液，并均可被強(qiáng)氧化劑30%H2O2和10%NaClO漂白，還原劑Na2S2O4對(duì)黑素顏色無(wú)明顯改變。

2.2Fonsecaeamonophora黑素光譜分析

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)結(jié)果：按1∶1，1∶2，1∶3的比例稀釋后F.monophora黑素溶液在紫外光區(qū)最大吸收峰分別為258 nm、231 nm、227 nm，在可見(jiàn)光區(qū)都有吸收，且隨著波長(zhǎng)的增大其吸收值逐漸降低 (見(jiàn)圖1A)。三者在300～700 nm的吸光值取對(duì)數(shù)后對(duì)波長(zhǎng)作圖可以得到斜率分別為-0.003 20、-0.003 52、-0.003 38的擬合直線(xiàn) (見(jiàn)圖1B)。

紅外光譜分析結(jié)果:F.monophora黑素與合成多巴黑素具有相似的紅外光譜圖 (見(jiàn)圖1C、D)。二者均有黑素的兩個(gè)特征吸收帶：(1)在3 400～3 000 cm-1(3 μm)附近都存在強(qiáng)而寬的共軛吸收帶，是由OH基團(tuán)和吲哚的NH伸縮振動(dòng)引起；(2)在1 660～1 600 cm-1(6 μm)附近有一強(qiáng)吸收帶，是由芳香族的耦合雙鍵C=C和C=O的伸縮振動(dòng)引起，是定義黑素的特征性吸收峰。同時(shí)在1 750～1 700 cm-1、1 300～1 000 cm-1也有類(lèi)似吸收帶，前者是由游離羧基基團(tuán)-COOH的C=O伸縮振動(dòng)引起，后者是C-OH，OH變形振動(dòng)及羧基振動(dòng)所致。但是monophora著色霉黑素在2 913 cm-1、1 400 cm-1存在與合成多巴黑素不同的吸收峰，由CH2、CH3振動(dòng)引起。

Fonsecaeamonophora黑素EPR分析F.monophora黑素的EPR圖譜為對(duì)稱(chēng)的典型單線(xiàn)一次微商波譜 (見(jiàn)圖1E)。

2.3Fonsecaeamonophora黑素的合成途徑分析

如圖2 (A～E (正面)/A1～E1 (反面))所示，肉眼觀察F.monophora在含1 mmol/L L-DOPA培養(yǎng)基比在單純PDA培養(yǎng)基中菌落及周?chē)囵B(yǎng)基產(chǎn)生更多的黑素；含0.05 mmol/L疊氮化鈉培養(yǎng)基的菌落及周?chē)囵B(yǎng)基顏色變淺；含無(wú)水乙醇和200 mg/L曲酸的菌落及周?chē)囵B(yǎng)基顏色較空白對(duì)照PDA組未見(jiàn)明顯變化。如圖3 (A～C (正面)/A1～C1 (反面))在含100 mg/L苯肽和100 mg/L三環(huán)唑培養(yǎng)基的菌落及周?chē)囵B(yǎng)基顏色也較含無(wú)水乙醇的PDA明顯變淺。

BioTek酶標(biāo)儀EON定量分析各組黑素含量變化，結(jié)果顯示L-DOPA組比單純PDA組單位菌量黑素合成增多，疊氮化鈉組較單純PDA組單位菌量黑素合成明顯減少，其含量差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05，見(jiàn)圖4)；苯肽組、三環(huán)唑組較其空白對(duì)照組單位菌量黑素合成減少，其差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05，見(jiàn)圖5)。無(wú)水乙醇組、曲酸組與空白對(duì)照組單位菌量黑素的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05，見(jiàn)圖4)。

3 討 論

黑素是一類(lèi)由多酚類(lèi)或吲哚類(lèi)異源多聚物聚合而成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的聚合體[15]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn).monophora色素與合成多巴黑素具有相似的理化性質(zhì)，均為黑素顆粒，具有疏水性，可溶解于堿性溶液，耐酸，可被H2O2和NaClO等強(qiáng)氧化劑氧化脫色。紫外-可見(jiàn)光譜分析顯示其在200～300 nm處有最大吸收峰，且在可見(jiàn)光區(qū)隨著波長(zhǎng)的增大其吸收值逐漸降低，這與黑素分子中含有很多復(fù)雜的共輒雙鍵體系或芳環(huán)結(jié)構(gòu)有關(guān)[13]。de Soares等[16]研究顯示，裴氏著色霉菌絲和分生孢子的黑素在262 nm、271 nm、282 nm和293 nm紫外光譜處有高吸收峰。紅外光譜分析顯示F.monophora色素與合成多巴黑素在3 400～3 000 cm-1(3 μm)和1 660～1 600 cm-1(6 μm)附近都有特征性黑素吸收峰，且兩者在860～650 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰很弱，表明芳環(huán)被取代形成共軛體系[9]。但是F.monophora色素在2 913 cm-1與1 400 cm-1附近存在與合成多巴黑素不同的吸收峰，多由于脂肪族CH2、CH3振動(dòng)引起[9]，提示F.monophora黑素具有更多的脂肪族基團(tuán)。該光譜結(jié)果與裴氏著色霉及其他臨床暗色真菌 (例如疣狀瓶霉、卡氏枝孢瓶霉和甄氏外瓶霉等)不一樣。Corbellini等[17]研究發(fā)現(xiàn)裴氏著色霉的黑素在1 230～1 650 cm-1與2 800～3 000 cm-1附近出現(xiàn)高吸收峰。這可能與研究選擇不同的培養(yǎng)基有關(guān)，研究者選用脂肪瓊脂培養(yǎng)基，而本研究選用PDA培養(yǎng)基。黑素因含有穩(wěn)定的自由基 (例如自由移動(dòng)的π電子)而呈現(xiàn)有特征性EPR波譜，不同的真菌黑素具有半波長(zhǎng)在4～7 eV和g值為2.003 6～2.004 2的信號(hào)[13，18]。裴氏著色霉和F.monophora黑素均具有對(duì)稱(chēng)的典型單線(xiàn)一次EPR微商波譜[8]。綜合F.monophora提取黑素的化學(xué)性質(zhì)、光譜分析等結(jié)果定性分析，證實(shí)F.monophora黑素具有黑素的一般共性，而從紅外光譜分析結(jié)果可推斷出所提取的黑素含有多巴黑素。

圖1 A.F.monophora黑素的紫外可見(jiàn)光譜圖 (3種濃度的黑素溶液在紫外光區(qū)200～300 nm之間均有最大吸收峰，隨著波長(zhǎng)的增大吸收值逐漸降低)；B.3種濃度 (1∶3、1∶2、1∶1)的黑素溶液在300～700 nm的吸光值取對(duì)數(shù)后對(duì)波長(zhǎng)作圖可以得到3條斜率為負(fù)值的擬合直線(xiàn)，斜率分別為-0.003 38，-0.003 52，-0.003 20；C.F.monophora黑素紅外光譜圖；D.合成多巴黑素紅外光譜圖；E.F.monophora黑素的EPR圖譜 圖2 黑素的抑制試驗(yàn)結(jié)果 (A～E (正面)/A1～E1 (反面)依次為含1 mmol/L L-DOPA的PDA、空白對(duì)照PDA、含0.05 mmol/L疊氮化鈉的PDA、含溶解DHN黑素抑制劑同等容量的無(wú)水乙醇的PDA和含200 mg/L曲酸的PDA) 圖3 黑素的抑制試驗(yàn)結(jié)果 (A～C (正面)/A1～C1 (反面)依次為含100 mg/L苯肽的PDA、含溶解DHN黑素抑制劑同等容量的無(wú)水乙醇的PDA和含100 mg/L三環(huán)唑的PDA) 圖4 黑素提取定量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果L-DOPA可使F.monophora黑素的合成增多；疊氮化鈉可明顯抑制F.monophora黑素的合成。“*”表示兩組數(shù)值統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異 (P<0.05) 圖5 黑素提取定量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果DHN黑素抑制劑苯肽 (PH)和三環(huán)唑 (TRI)均能抑制F.monophora黑素的合成。“*”表示兩組數(shù)值統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異 (P<0.05)

Fig.1 A.UV-visible spectroscopic properties of melanin pigment.100 mg/L of melanin fromF.monophorawas diluted to 1∶1,1∶2 and 1∶3 dilutions,all of them show maximum absorption peak between 200 and 300 nm wavelength and the absorption value decreases gradually with the increase of the wavelength;B.Log absorbance of three different concentrations (1∶3,1∶2,1∶1) of melanin solution between 300 and 700nm wavelength VS wavelengths plot three fitted straight line negative slope and the slope present -0.003 38,-0.003 52 and -0.003 20;C.FT-IR spectrum of the melanin pigment fromF.monophora;D.FT-IR spectrum of the Synthetic DOPA-melanin;E.EPR spectral analysis of the melanin pigment fromF.monophoraFig.2 Results of melanin inhibited test (A-E and A1-E1 present the front and back of the medium respectively) present the cells cultured on the mediums consecutively PDA with 1 mmol/L of L-DOPA,the blank contrast PDA,PDA with 0.05 mmol/L of sodium azide,PDA with equivalent quantity ethanol dissolving the DHN melanin inhibitors and PDA with 200 mg/L of Kojic acid Fig.3 Results of melanin inhibited test (A-C and A1-C1 present the front and back of the medium respectively) present the cells cultured on the mediums consecutively PDA with 100 mg/L of Phthalide,PDA with equivalent quantity ethanol dissolving the DHN melanin inhibitors and PDA with 100 mg/L of tricyclazole Fig.4 Quantitative statistical analysis of extracted melanin shows that L-DOPA increase the production of melanin while the sodium azide obviously inhibit the synthesis of melanin inF.monophora.“*” Statistically significant difference were found between two groups (P<0.05) Fig.5 Quantitative Statistical analysis of extracted melanin shows that both the DHN melanin inhibitors Phthalide and tricyclazole inhibit the synthesis of melanin inF.monophora.“*” Statistically significant difference were found between two groups (P<0.05)

真菌黑素主要經(jīng)DHN、DOPA和L-酪氨酸降解3種途徑合成[19]。根據(jù)黑素合成途徑和中間代謝產(chǎn)物的不同，又可分為真黑素、棕黑素、膿黑素和DHN黑素[20]。多數(shù)子囊菌通過(guò)DHN途徑合成黑素，如裴氏著色霉、皮炎外瓶霉、甄氏外瓶霉、卡氏枝孢瓶霉、煙曲霉、黑曲霉等[21]。真黑素和棕黑素均經(jīng)DOPA途徑合成，統(tǒng)稱(chēng)DOPA黑素，漆酶 (多酚氧化酶)為該途徑的主要催化酶。新生隱球菌、白念珠菌、莢膜組織胞漿菌等則通過(guò)DOPA途徑合成黑素[15]。膿黑素主要經(jīng)對(duì)羥苯丙酮酸羥化酶催化底物酪氨酸合成，可見(jiàn)于裴氏著色霉、申克孢子絲菌、巴西孢子絲菌、煙曲霉菌和新生隱球菌[9，22-24]。膿黑素具有可溶性，由真菌分泌至胞外，而其他兩種黑素是疏水性且與胞壁結(jié)合[9]。裴氏著色霉同時(shí)具有通過(guò)DHN途徑和膿黑素合成途徑合成黑素，其胞外的可溶性色素和胞壁上的黑素誘發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)互不相同，前者可增強(qiáng)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞對(duì)菌體的吞噬能力及氧化殺傷效應(yīng)[7]，而后者具有抵御H2O2及NO的氧化殺傷作用[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)F.monophora可能共同存在DOPA黑素和DHN黑素合成途徑，主要合成L-DOPA黑素。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)不少真菌可聯(lián)合兩種或兩種以上途徑合成黑素。例如，申克孢子絲菌可通過(guò)DHN途徑和DOPA途徑合成黑素，還可通過(guò)酪氨酸降解途徑合成膿黑素[25]；馬爾尼菲藍(lán)狀菌可通過(guò)DHN和DOPA兩種途徑合成黑素[14]；新生隱球菌可通過(guò)DOPA途徑及酪氨酸降解途徑合成黑素[26]。煙曲霉菌和裴氏著色霉可合成DHN黑素及分泌至胞外的可溶性黑素[5-6，23]。三環(huán)唑和苯肽是特異的DHN黑素抑制劑。本研究首先在PDA培養(yǎng)基加入DHN黑素抑制劑觀察F.monophora菌落及周?chē)囵B(yǎng)基顏色變化，雖然菌落黑素較其空白對(duì)照減少，但并未完全脫失。這與申克孢子絲菌、馬爾尼菲藍(lán)狀菌、裴氏著色霉等相關(guān)研究結(jié)果類(lèi)似，三環(huán)唑不能完全抑制這些真菌黑素合成[14，21，27]，但可完全抑制馬杜拉足菌腫黑素合成[28]。本研究進(jìn)一步在PDA培養(yǎng)基加入黑素合成前體L-DOPA、漆酶抑制劑疊氮化鈉和酪氨酸酶抑制劑曲酸觀察F.monophora黑素合成變化，以明確該菌是否存在DOPA合成途徑。結(jié)果顯示，L-DOPA能增加菌落黑素產(chǎn)生，疊氮化鈉有部分抑制黑素作用，而曲酸對(duì)菌落黑素?zé)o明顯影響。新近對(duì)F.monophora轉(zhuǎn)錄組研究顯示該菌同時(shí)存在DHN和DOPA兩種黑素合成途徑的關(guān)鍵酶，如聚酮合酶、多銅氧化酶、漆酶、酪氨酸酶和尿黑酸雙加氧化酶等，其表達(dá)水平在野生株和白化株中存在明顯差異[19]。F.monophora不同種類(lèi)的黑素在著色芽生菌病發(fā)病機(jī)制毒力機(jī)制尚未闡明，隨著基因組測(cè)序及蛋白質(zhì)分析技術(shù)的快速發(fā)展，為黑素合成代謝及功能的研究提供更多基礎(chǔ)，可望為著色芽生菌病治療上的突破上提供幫助。

[1] Queiroz-Telles F,de Hoog S,Santos D W,et al.Chromoblastomycosis[J].Clin Microbiol Rev,2017,30(1):233-276.

[2] Najafzadeh M J,Vicente V A,Sun J,et al.Fonsecaeamultimorphosasp.nov,a new species of Chaetothyriales isolated from a feline cerebral abscess[J].Fungal Biol,2011,115(10):1066-1076.

[3] Xi L,Sun J,Lu C,et al.Molecular diversity ofFonsecaea(Chaetothyriales) causing chromoblastomycosis in southern China[J].Med Mycol,2009,47(1):27-33.

[4] Fransisca C,He Y,Chen Z,et al.Molecular identification of chromoblastomycosis clinical isolates in Guangdong[J].Med Mycol,2017.

[5] Franzen A J,de Souza W,Farina M,et al.Morphometric and densitometric study of the biogenesis of electron-dense granules inFonsecaeapedrosoi[J].FEMS Microbiol Lett,1999,173(2):395-402.

[6] Franzen AJ,Cunha MM,Miranda K,et al.Ultrastructural characterization of melanosomes of the human pathogenic fungusFonsecaeapedrosoi[J].J Struct Biol,2008,162(1):75-84.

[7] Alviano DS,Franzen AJ,Travassos LR,et al.Melanin fromFonsecaeapedrosoiinduces production of human antifungal antibodies and enhances the antimicrobial efficacy of phagocytes[J].Infection and Immunity,2004,72(1):229-237.

[8] Cunha MM,Franzen AJ,Seabra SH,et al.Melanin inFonsecaeapedrosoi:a trap for oxidative radicals[J].BMC Microbiol,2010,10(1):80.

[9] Pal AK,Gajjar DU,Vasavada AR.DOPA and DHN pathway orchestrate melanin synthesis inAspergillusspecies[J].Med Mycol,2014,52(1):10-18.

[10] Xi L,Lu C,Sun J,et al.Chromoblastomycosis caused by a meristematic mutant ofFonsecaeamonophora[J].Med Mycol,2009,47(1):77-80.

[11] Teixeira PA,De Castro RA,Ferreira FR,et al.L-DOPA accessibility in culture medium increases melanin expression and virulence ofSporothrixschenckiiyeast cells[J].Med Mycol,2010,48(5):687-695.

[12] Kumar CG,Mongolla P,Pombala S,et al.Physicochemical characterization and antioxidant activity of melanin from a novel strain ofAspergillusbridgeriICTF-201[J].Lett Appl Microbiol,2011,53(3):350-358.

[13] Sajjan S,Kulkarni G,Yaligara V,et al.Purification and physiochemical characterization of melanin pigment fromKlebsiellasp.GSK[J].J Microbiol Biotechnol,2010,20(11):1513-1520.

[14] Liu D,Wei L,Guo T,et al.Detection of DOPA-melanin in the dimorphic fungal pathogenPenicilliummarneffeiand its effect on macrophage phagocytosis in vitro[J].PLoS One,2014,9(3):e92610.

[15] 陳映丹，陸春，馮佩英.黑素與真菌抗藥性的研究進(jìn)展[J].中國(guó)真菌學(xué)雜志,2016,11(4):248-251.

[16] de A S R,Angluster J,de Souza W,et al.Carbohydrate and lipid components of hyphae and conidia of human pathogenFonsecaeapedrosoi[J].Mycopathologia,1995,132(2):71-77.

[17] Corbellini VA,Scroferneker ML,Carissimi M,et al.Lipolytic activity of chromoblastomycosis agents measured by infrared spectroscopy and chemometric methods[J].Med Mycol,2009,47(1):63-69.

[18] Gessler NN,Egorova AS,Belozerskaia TA.Melanin pigments of fungi under extreme environmental conditions (review)[J].Prikl Biokhim Mikrobiol,2014,50(2):125-134.

[19] Li XQ,Guo BL,Cai WY,et al.The role of melanin pathways in extremotolerance and virulence ofFonsecaearevealed by de novo assembly transcriptomics using illumina paired-end sequencing[J].Stud Mycol,2016,83:1-18.

[20] Langfelder K,Streibel M,Jahn B,et al.Biosynthesis of fungal melanins and their importance for human pathogenic fungi[J].Fungal Genet Biol,2003,38(2):143-158.

[21] Franzen AJ,Cunha MM,Batista EJ,et al.Effects of tricyclazole (5-methyl-1,2,4-triazol[3,4] benzothiazole),a specific DHN-melanin inhibitor,on the morphology ofFonsecaeapedrosoiconidia and sclerotic cells[J].Microsc Res Tech,2006,69(9):729-737.

[22] Revankar SG,Sutton DA.Melanized fungi in human disease[J].Clin Microbiol Rev,2010,23(4):884-928.

[23] Schmaler-Ripcke J,Sugareva V,Gebhardt P,et al.Production of pyomelanin,a second type of melanin,via the tyrosine degradation pathway inAspergillusfumigatus[J].Appl Environ Microbiol,2009,75(2):493-503.

[24] Alviano D S,Franzen A J,Travassos L R,et al.Melanin fromFonsecaeapedrosoiinduces production of human antifungal antibodies and enhances the antimicrobial efficacy of phagocytes[J].Infect Immun,2004,72(1):229-237.

[25] Almeida-Paes R,Frases S,Araujo G D S,et al.Biosynthesis and functions of a melanoid pigment produced by species of theSporothrixcomplex in the presence of L-tyrosine[J].Appl Environ Microbiol,2012,78(24):8623-8630.

[26] Frases S,Salazar A,Dadachova E,et al.Cryptococcusneoformanscan utilize the bacterial melanin precursor homogentisic acid for fungal melanogenesis[J].Appl Environ Microbiol,2007,73(2):615-621.

[27] Romero-Martinez R,Wheeler M,Guerrero-Plata A,et al.Biosynthesis and functions of melanin inSporothrixschenckii[J].Infect Immun,2000,68(6):3696-3703.

[28] van de Sande WW,de Kat J,Coppens J,et al.Melanin biosynthesis inMadurellamycetomatisand its effect on susceptibility to itraconazole and ketoconazole[J].Microbes Infect,2007,9(9):1114-1123.

[本文編輯] 衛(wèi)鳳蓮

Detection of physiochemical characterization and synthesis pathway of melanin fromFonsecaeamonophora

CHEN Ying-dan1,LU Chun1,LI Mei-rong1,MA Han1,YING Song-chao1,ZHENG Zhi-xin1,LI Hai-yi1,XI Li-yan2,FENG Pei-ying1

(1.DepartmentofDermatology,ThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;2.DepartmentofDermatology,SunYat-senmemorialHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China)

Objective To study the melanin physiochemical characterization and melanin synthesis pathway ofFonsecaeamonophora.Methods Pure melanin mass was extracted from theF.monophoraisolate using the cell wall crude extract method.Then we used Ultravolet (Uv),Fourier transformed infrared (FT-IR) and electron paramagnetic resonance (EPR) spectra assay to evaluate the physiochemical characterization of melanin.Furthermore,we observed the pigment production of the colonies on different mediums (PDA,PDA with L-DOPA,PDA with DOPA-melanin inhibitors and PDA with DHN-melanin inhibitors),and the quantity of melanin produced on different above media were measured using BioTek Eon microplate reader.Results The melanin extracted fromF.monophorashared similar physiochemical and spectroscopic properties with the synthetic L-DOPA melanin.The formation of melanin pigment statistically significant increased on the L-DOPA medium,and decreased on the DOPA-melanin inhibitor medium (sodium azide) and DHN-melanin inhibitors medium (phthalide and tricyclazole) compare to their blank contrast medium.Conclusions The melanin produced byF.monophorais mainly DOPA melanin,and it may synthesize simultaneously by DOPA-melanin and DHN-melanin pathway.

Fonsecaeamonophora;melanin;physiochemical characterization;melanin synthesis pathway

國(guó)家自然科學(xué)基金 (81401650)

陳映丹，女 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:chenyingdan89@163.com

陸春,E-mail:luliyuan@tom.com；馮佩英,E-mail:fengpeiying@medmail.com.cn

·論著·

陳映丹1陸春1李美榮1馬寒1尹頌超1鄭智心1李海儀1席麗艷2馮佩英1

(1.廣州市中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚科，廣州 510630；2.廣州市中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院皮膚科，廣州 510120)

R 379.9

A

1673-3827(2017)12-0129-06

2017-02-13