董紅霞，黃新芳，劉玉平，柯衛(wèi)東

（武漢市蔬菜科學研究所，430065）

ISSR標記在芋遺傳多樣性研究中的應用前景

董紅霞，黃新芳，劉玉平，柯衛(wèi)東

（武漢市蔬菜科學研究所，430065）

ISSR是在SSR基礎上發(fā)展起來的一種分子標記技術(shù)，兼具SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子標記的優(yōu)點。對運用形態(tài)學和分子生物學手段研究芋的遺傳多樣性進展進行了綜述，并對ISSR分子標記技術(shù)在芋種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系、種質(zhì)資源鑒定和指紋圖譜構(gòu)建、基因定位和分子標記輔助選擇等方面的應用前景做出了分析和展望。

芋；ISSR；分子標記；遺傳多樣性

芋 [Colocasia esculenta（L.）Schott]又名芋艿、芋頭，是天南星科多年生草本植物，原產(chǎn)于中國、印度和馬來半島等熱帶沼澤地。芋作為一種具有地域特色的水生蔬菜，在全世界廣泛栽培[1]，其球莖富含淀粉及蛋白質(zhì)，不僅可作為蔬菜食用，而且在很多國家或地區(qū)還被作為主食。此外，芋也是釀制酒精的原料。芋耐運輸和貯藏，能解決蔬菜周年均衡供應的問題，并可作為外貿(mào)出口商品。相對其他作物而言，芋的相關(guān)研究尤其品種資源、遺傳進化方面研究一直未受到世界各國的重視。

1 芋遺傳多樣性研究現(xiàn)狀

1.1 芋種質(zhì)資源的形態(tài)學研究

我國作為芋的起源中心之一，擁有豐富的芋種質(zhì)資源，但我國在芋種質(zhì)資源方面的研究相對滯后，對芋種質(zhì)資源遺傳多樣性研究較少。目前主要的研究多停留在芋形態(tài)學的觀察，其中最為復雜和最有爭議的為芋的分類問題。由于芋的品種資源豐富，表型性狀相對比較復雜，任意一種表型特征都可以作為分類的依據(jù)，如葉柄的顏色、球莖芽色、球莖肉質(zhì)顏色、葉尖、葉基、葉形、地下莖形態(tài)、開花及花序、熟性以及水旱適應性等，因此分類時所依據(jù)的形態(tài)特征不同，分類方法也不盡相同。吳征鎰等[2]依據(jù)母芋與子芋的發(fā)達程度及子芋習性將芋分為多子芋、魁芋和多頭芋3類；張志[3]將芋分為葉柄變種和球莖變種，其中球莖變種又劃分為魁芋、多子芋和多頭芋3種類型；張谷曼等[4]根據(jù)芋的分蘗習性、染色體數(shù)目及地理分布，將芋分為4類：魁芋類（2n=2x=28）、魁子兼用類（2n=3x=42）、多子芋類（2n= 3x=42）及多頭芋[2n=2x（3x）=28（42）]；魏文麟等[5]又將芋分為葉用芋變種、花用芋變種和球莖變種3類，每個類型再根據(jù)葉柄和芋的顏色分為若干副型。由此可見，芋的分類存在容易混淆和方向模糊的問題。由于對芋的分類大多根據(jù)其形態(tài)特征，故反映不出研究材料本質(zhì)上的差異。另外，分類標準不統(tǒng)一，分類手段的局限，導致分類結(jié)果不一致。部分品種來源不清，品種親緣關(guān)系不明，同物異名及同名異物等現(xiàn)象十分普遍，不利于芋種質(zhì)資源的研究和品種的選育和推廣，也給種質(zhì)資源的保存、評價、創(chuàng)新、利用帶來極大的不便。

20世紀90年代后期發(fā)展起來的DNA指紋圖譜（DNA fingerprinting）技術(shù)具有多態(tài)性豐富、分辨率高、穩(wěn)定性強等優(yōu)點，目前已成為一種非常重要的研究種質(zhì)資源的技術(shù)手段。該技術(shù)可以用來對種質(zhì)資源進行評估以及對品種真實性和純度進行鑒定。因而深入利用現(xiàn)代生物技術(shù)，從DNA水平上進行芋種質(zhì)資源的遺傳多樣性分類研究顯得尤為重要。

1.2 國內(nèi)外芋遺傳多樣性的分子生物學研究進展

20世紀末，國內(nèi)外已開展關(guān)于芋資源的遺傳多樣性的分子標記研究。1991年Lebot等[6]就用同工酶對1個南亞的芋種質(zhì)資源庫和1個美拉尼西亞的芋種質(zhì)資源庫進行了分析，揭示了2種芋資源的進化歷程可能不同。Irwin等[7]1998年利用RAPD分子標記對44份芋種芋資源進行了遺傳多樣性分析，將印度尼西亞的芋種質(zhì)資源與夏威夷的芋種質(zhì)資源區(qū)別開來，同時也把二倍體和三倍體芋資源區(qū)別開來。2003年，Kreike等[8]采用AFLP標記技術(shù)對東南亞地區(qū)和太平洋地區(qū)（包括越南、泰國、馬來西亞、印度尼西亞、菲律賓、巴布亞新幾內(nèi)亞和瓦努阿圖）的255個芋種進行了遺傳背景和多樣性的分析，研究結(jié)果顯示相同國家或地域的芋種質(zhì)資源的遺傳相似性較高。Kreike等發(fā)現(xiàn)255個材料可以分為2大類，一類是亞洲國家的芋種質(zhì)資源，另一類是太平洋地區(qū)的芋種質(zhì)資源，但是泰國地區(qū)的的芋種質(zhì)資源卻劃入太平洋地區(qū)。2004年Quero-Garcia等[9]利用AFLP技術(shù)輔助分析了瓦努阿圖的450個芋樣本，與育種者常用的農(nóng)藝性狀分類方法的結(jié)果相比較，證實了分子標記分析技術(shù)是對芋種質(zhì)進行分類并指導其育種工作行之有效的方法。而用SSR標記對芋進行分析卻受SSR引物的開發(fā)和數(shù)量的限制。2007年Mace等[10，11]利用7對SSR引物對巴布亞新幾內(nèi)亞的859個芋種質(zhì)資源進行聚類分析，并與其農(nóng)藝性狀分類法的結(jié)果相比較，以保護當?shù)氐挠蠓N質(zhì)資源。

相對于國外而言，國內(nèi)在芋種質(zhì)資源保存和芋種質(zhì)資源遺傳多樣性方面的研究比較零散。據(jù)報道，福建農(nóng)學院收集了177份芋種質(zhì)資源，中國科學院昆明植物研究所收集了100余份云南芋種質(zhì)材料，國家種質(zhì)武漢水生蔬菜資源圃收集并保存了287份來自全國各地的芋種質(zhì)資源[12]。陳文炳等[13]應用聚丙烯酞胺垂直凝膠電泳檢測了177份中國芋種質(zhì)資源的酯酶同工酶，結(jié)果表明，栽培芋可能由野生芋進化而來，栽培芋和野生芋也有可能由不同來源繁衍而來。沈鏑等[14]對來自云南的28份芋種質(zhì)資源進行了12種同工酶的分析比較，篩選出酯酶 （EST）、過氧化物酶 （POD）、超氧化物歧化酶（SOD）等5種酶系；同時，沈鏑等[15，16]還對其進行了AFLP和RAPD的分子標記研究，研究表明，大多數(shù)芋野生種可以與栽培種聚在不同的類群，而且多數(shù)野生種與栽培種關(guān)系較遠，結(jié)果與國外分子標記的研究結(jié)果一致。但是也并非所有的野生種都能聚到一起，一些野生種混在栽培類群中，而與其他一些野生種關(guān)系較遠，體現(xiàn)出個體差異。沈鏑等的研究還表明，3種分析方法檢測的多態(tài)率均達85%以上，其中以同工酶法最高，AFLP和RAPD法相差較小，檢測的效率以AFLP法最高。由于AFLP和RAPD法直接對DNA序列進行比較，所以檢測差異效率要明顯高于同工酶法，尤其是AFLP分子標記法。龍雯虹等[17]也用RAPD分子標記對云南芋種質(zhì)資源進行了研究，但其所用材料較少，僅為10份。陳麗平[18]也用RAPD分子標記對47份芋屬材料和2份海芋屬材料進行了遺傳多樣性分析，結(jié)果將這些材料分為海芋屬和芋屬，其中芋屬分為6組：第1組為綠白芋類，第2組為紫芋類，第3組為魁芋類，第4組為紅芽芋類，第5組為葉用芋類，第6組為花莖用芋類（包括云南紅芋和湖北古夫芋的花、莖用芋類，屬于芋類的高級進化類型），此結(jié)果與植物學性狀分類法的結(jié)果相符合。這6組芋的親緣關(guān)系為花莖用芋類與葉用芋類最近，然后與紅芽芋類、魁芋類、紫芋類、綠白芋類的親緣關(guān)系依次變遠。目前，國內(nèi)在對芋遺傳多樣性方面所做的工作涉及面較小，較為零散，研究者多利用單一的AFLP或RAPD分子標記來研究芋的遺傳多樣性，但由于AFLP的操作復雜和RAPD的不穩(wěn)定性，導致芋遺傳背景的分析受到局限，試驗結(jié)果的科學性需要進一步驗證。

2 ISSR標記在芋遺傳多樣性研究中的應用前景

ISSR（inter-simple sequence repeats）是Zetkiewicz等[19]于1994年提出的一種微衛(wèi)星基礎上的分子標記。其基本原理是用錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，即在SSR序列的3'端或5'端加上2～4個隨機核苷酸，在PCR反應中，錨定引物可引起特定位點退火，導致與錨定引物互補的間隔不太大的重復序列間DNA片段進行PCR擴增。所擴增的inter SSR區(qū)域的多個條帶通過聚丙烯酞胺凝膠電泳得以分辨。

ISSR分子標記技術(shù)兼具 SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子標記的特點[20]，其重復性好、穩(wěn)定性高、操作簡單、多態(tài)性豐富、成本較低、DNA用量小、安全性較高。ISSR引物具有通用性，適用于任何物種，擴增譜帶多為顯性標記，呈Mendel式遺傳[21]，因而它是一種非常有發(fā)展前景的分子標記技術(shù)。目前，ISSR標記已廣泛應用于植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性等生物學研究中。與依據(jù)形態(tài)性狀的標記方法相比，ISSR分子標記能直接檢測到DNA分子結(jié)構(gòu)上的變異，反映出研究材料本質(zhì)上的差異，是育種家們更易接受的經(jīng)濟、實用的技術(shù)，在物種遺傳多樣性研究中也具有更為科學和更加廣闊的應用前景。

2.1 遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析

基因型不同的品種或親緣關(guān)系不同的物種，其基因組內(nèi)核苷酸序列存在差異，當使用同一ISSR引物對不同基因組進行體外擴增時，基因組上與引物互補的DNA片段（模板）的數(shù)目、位點不同，因而其擴增產(chǎn)物（DNA片段）的大小、數(shù)目也不同，即擴增產(chǎn)物表現(xiàn)出多態(tài)性。當使用一系列不同的ISSR引物擴增時，這種多態(tài)性更加豐富。這種擴增產(chǎn)物的多態(tài)性反映了被測材料的遺傳多樣性[22]。遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析是植物種質(zhì)資源研究和評價的主要內(nèi)容之一，它決定了這些種質(zhì)在今后育種實踐中有效利用的問題。ISSR分子標記技術(shù)憑借其多態(tài)性豐富等特點已經(jīng)被廣泛應用于植物種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究，如楊本超等[23]根據(jù)每個品種獨特的指紋圖譜，利用ISSR標記區(qū)分了24份具代表性的烤煙種質(zhì)的遺傳多樣性；姚明哲等[24]利用ISSR引物分析了我國36個茶樹無性系品種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，20個ISSR引物共擴增出368條譜帶，其中多態(tài)性譜帶占99.7%，親緣關(guān)系樹狀圖在分子水平上顯示了我國主要茶樹無性系品種間的親緣關(guān)系，為今后茶樹育種時親本的選配提供了理論依據(jù)。由此表明ISSR標記適于種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究和親緣關(guān)系分析。

2.2 種質(zhì)資源鑒定和指紋圖譜構(gòu)建

隨著種子產(chǎn)業(yè)的市場化發(fā)展，準確、快速、簡捷的種子質(zhì)量檢測技術(shù)和方法成為研究熱點。傳統(tǒng)的形態(tài)學性狀鑒定法需要進行品種的田間性狀調(diào)查，時間長、耗費高，難以用于新品種的區(qū)分。而ISSR分子標記技術(shù)以其穩(wěn)定可靠、重復性好、多態(tài)性豐富、成本低和周期短等優(yōu)點在種質(zhì)資源收集和品種鑒定中越來越受到重視。利用ISSR分子標記繪制植物種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜，作為其特征性狀建立種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫，可用于種質(zhì)鑒別[25]。

Kumar等[26]運用ISSR分子標記技術(shù)鑒定了4個因爭議引發(fā)官司的辣椒（Capsicum annum）品種，被認為是首次運用可靠的DNA分子標記方法來維護植物育種者權(quán)利的有益嘗試。Carvalho等[27]成功構(gòu)建了5個雜交小麥F1代與其親本的DNA指紋圖譜，用以檢測F1代的真實性和純度。說明利用ISSR標記進行種質(zhì)真實性的鑒定和遺傳圖譜的構(gòu)建是可行且有效的。

2.3 基因定位和分子標記輔助選擇

充分發(fā)掘和利用植物種質(zhì)資源這一天然的優(yōu)異基因庫是育種工作者一直以來努力的方向。植物育種中分子標記輔助選擇是通過分析與目標基因緊密連鎖的分子標記來判斷目標基因是否存在。利用ISSR標記對某一特定DNA區(qū)域內(nèi)的目的基因進行定位，進而獲得目的基因，用于種間或種內(nèi)目標基因的轉(zhuǎn)移，也是分子標記應用于育種，創(chuàng)造新材料的重要手段。陳學好等[28]以黃瓜單性結(jié)實品系EP-6和非單性結(jié)實品系ZR-2為親本構(gòu)建群體，用65條ISSR引物進行PCR擴增，其中引物N92在親本和DNA池之間擴增出1條大小為850 bp的多態(tài)性片段，對F2代群體135個單株驗證，該片段穩(wěn)定出現(xiàn)，在單性結(jié)實植株中表現(xiàn)為無帶，在非單性結(jié)實植株中表現(xiàn)為有帶，說明N92可以作為鑒別黃瓜單性結(jié)實與非單性結(jié)實的標記引物，為黃瓜單性結(jié)實基因的分子標記篩選和分子標記輔助育種奠定了基礎。

3 展望

ISSR作為一種新型的分子標記技術(shù)，以其簡便、經(jīng)濟、快速、多態(tài)性高、穩(wěn)定性強等優(yōu)點，在多種作物的種質(zhì)資源研究尤其是在種質(zhì)資源收集和鑒定、遺傳多樣性和親緣關(guān)系及基因定位等方面已經(jīng)得到較為廣泛的應用。中國雖然擁有豐富的芋種質(zhì)資源和古老的栽培歷史，但在芋種質(zhì)資源遺傳多樣性方面的研究還很不足，還未充分利用ISSR標記開展芋遺傳多樣性的研究。我們應積極借鑒ISSR分子標記在其他作物上成功應用的經(jīng)驗，加快芋遺傳多樣性研究的步伐，促使芋種質(zhì)資源發(fā)揮更大的作用。

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Application Prospects of ISSR Molecular Marker on Genetic Diversity of Taro

DONG Hongxia,HUANG Xinfang,LIU Yuping,KE Weidong
(Wuhan Vegetable Research Institute,Wuhan 430065)

ISSR is a molecular marker technology developed on the basis of SSR marker with advantages of SSR,RAPD, RFLP,AFLP markers.Developments of studies on genetic diversity of taro were summarized.Application of ISSR marker on genetic diversity and relationship,identification and fingerprints construction,gene mapping and molecular marker-assisted selection of taro germplasms were also analyzed and prospected.

Taro;ISSR;Molecular marker;Genetic diversity

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.16.011

董紅霞（1980-），女，博士，主要從事水生蔬菜品種資源研究，電話：027-88116313，E-mail：dhx1212@sohu.com

2011-07-11