于 露 (荊州市環(huán)境保護(hù)局,湖北荊州434000)

李凡修 (長(zhǎng)江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北荊州434023)

1 分光光度法

2)甲苯胺藍(lán)光度法 何戰(zhàn)勝等[5]研究發(fā)現(xiàn)羥自由基可與甲苯胺藍(lán)發(fā)生氧化反應(yīng),且在612nm處羥自由基對(duì)甲苯胺藍(lán)溶液具有強(qiáng)烈的褪色作用,能使甲苯胺藍(lán)的吸光發(fā)生變化,提出了間接檢測(cè)Fenton反應(yīng)中羥自由基濃度的新方法。研究發(fā)現(xiàn),最佳測(cè)定條件為pH=4.0。該法穩(wěn)定性好,操作簡(jiǎn)便,測(cè)定快速,是篩選抗羥自由基的清除劑和有效抗氧化劑藥物的簡(jiǎn)便方法。

4)丁基羅丹明B法 丁基羅丹明B無(wú)論在酸性介質(zhì)中,還是在堿性介質(zhì)中均顯紅色,但在稀硫酸介質(zhì)中,羥自由基與丁基羅丹明B發(fā)生反應(yīng),使丁基羅丹明B褪色。翟繼英[7,8]在722型分光光度計(jì)480～620nm范圍內(nèi)測(cè)定丁基羅丹明B的吸光度,發(fā)現(xiàn)最大吸收波長(zhǎng)在554nm處,因此可利用722型光度計(jì)上554nm處吸光度的變化,間接測(cè)定羥自由基的生成量。

6)萃取-催化氧化光度法 稀土元素的氧化物溶液能催化過(guò)氧化氫產(chǎn)生羥基自由基(OH),OH可氧化二苯基碳酰肼生成紅色二苯基碳酰腙,經(jīng)CHCl3萃取后,其萃取液在最大吸收波長(zhǎng)563nm處,ΔA563與過(guò)氧化氫、稀土的量呈量效關(guān)系。劉德啟[14]利用上述原理建立萃取-催化氧化光度法測(cè)定H2O2的羥基自由基的新方法。在好氧生物體過(guò)氧化氫含量的實(shí)際水平范圍內(nèi),該法在離體篩選抗氧劑方面更接近生物體過(guò)氧化氫含量的水平,比Fenton試劑要靈敏的多。該法具有儀器簡(jiǎn)單、體系穩(wěn)定、操作方便等優(yōu)點(diǎn),非常適合于篩選羥基自由基消除劑。

另外利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基與染料試劑溴甲酚綠 (Bromocresol green,B G)[15]、溴鄰苯三酚紅、桑色素等發(fā)生氧化反應(yīng)后使其吸光度值降低,都可建立間接測(cè)定羥基自由基的方法[8]。賈之慎等用水揚(yáng)酸捕獲OH后,與Na2WO4和NaNO2顯色,510nm比色測(cè)定,間接測(cè)定羥自由基含量。徐向榮等[9]用DMSO捕獲OH形成甲基亞磺酸,在420nm比色測(cè)定Fe2+-H2O2體系產(chǎn)生的OH,上述方法均可用于羥自由基清除劑的篩選。

2 熒光光度法

1)苯基熒光酮熒光法 苯基熒光酮 (Phenylfluorone,簡(jiǎn)稱本芴酮)與Fenton試劑作用后,可使其熒光大大降低,其最大激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別500nm和420nm,基于苯基熒光酮在反應(yīng)前后的熒光變化,吳南等建立了一種新的可間接地測(cè)定羥自由基方法,并通過(guò)順磁共振法測(cè)定苯基熒光酮加入前后的波譜變化來(lái)進(jìn)一步證實(shí)該方法的正確性。該方法具有較高的靈敏度,可作為尋找羥自由基清除劑的方法,也可作為醫(yī)學(xué)上部分藥品性能檢驗(yàn)的有效方法。

在此基礎(chǔ)上,任風(fēng)蓮等[16]提出了一種快速、簡(jiǎn)便地測(cè)定Sn(Ⅱ)-H2O2體系產(chǎn)生羥自由基 (OH)的新方法。由于Sn2+可與H2O2作用發(fā)生類(lèi)似Fenton反應(yīng),產(chǎn)生大量羥自由基,采用苯基熒光酮phenylfluorone作為Sn(Ⅱ)-H2O2反應(yīng)體系的熒光試劑,再利用其產(chǎn)生的羥自由基氧化苯基熒光酮,使苯基熒光酮的強(qiáng)度發(fā)生變化,可間接地測(cè)定羥自由基的產(chǎn)生量。苯基熒光酮熒光法對(duì)儀器要求低,方法簡(jiǎn)便,操作易行,選擇性好,準(zhǔn)確可靠,是一種值得推廣的新型測(cè)定羥自由基的有效方法,特別適用于檢測(cè)離體體系中羥自由基的氧化效應(yīng)及其清除羥自由基的機(jī)理研究。

2)吡啶熒光法 谷學(xué)新等[17]利用羥基自由基氧化二甲亞砜 (DMSO)生成的甲醛與乙酰丙酮、氨發(fā)生Hantzsch反應(yīng),其產(chǎn)物3,5-二乙酰-1,4-二氫吡啶可產(chǎn)生特征熒光,其最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)分別為419.4nm和505.5nm,通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度的變化可間接定量羥基自由基的產(chǎn)生量。該方法簡(jiǎn)便可靠,不需昂貴儀器,操作簡(jiǎn)便,易于被一般實(shí)驗(yàn)室采用,對(duì)于抗氧化劑的篩選以及羥基自由基的機(jī)理研究具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

3)楊基熒光酮熒光法 水楊基熒光酮 (salicylfluorone,SAF)是一種多羥基芳香酮,由于具有多羥基及較好的剛性平面結(jié)構(gòu),它本身就能產(chǎn)生熒光,因此任何改變其結(jié)構(gòu)的變化都能改變它的熒光。基于以上原理,Fenton試劑產(chǎn)生的羥自由基與水楊基熒光酮SAF作用后,可生成另外一種熒光物質(zhì),從而發(fā)生了熒光的變化,可利用熒光強(qiáng)度變化來(lái)間接測(cè)定所產(chǎn)生的羥自由基[18]。

任鳳蓮[19]實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Co2+與H2O2反應(yīng)生成羥自由基的產(chǎn)率比Fenton試劑的高100倍以上,從而建立水楊基熒光酮 (SAF)-CoⅡ-H2O2熒光法測(cè)定羥自由基的新體系,其激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為510nm和500nm,利用該測(cè)定體系在反應(yīng)前后的熒光變化,可間接測(cè)定羥自由基產(chǎn)生量。該法不需昂貴的儀器設(shè)備,方法靈敏,操作簡(jiǎn)單易行。清除率實(shí)驗(yàn)及ESR波譜法檢測(cè)均證明了該方法的準(zhǔn)確可靠,對(duì)于醫(yī)用篩選抗羥自由基藥物及抗羥自由基機(jī)理研究等方面具有應(yīng)用價(jià)值。

4)Ce3+熒光法 徐向榮等[20,21]利用Ce3+在稀硫酸中能產(chǎn)生特征熒光,其最大激發(fā)波長(zhǎng)OH和發(fā)射波長(zhǎng)分別為280nm和360nm。利用Fenton反應(yīng)或Sn2+與H2O2作用能將Ce3+氧化成無(wú)熒光Ce4+,通過(guò)測(cè)定Ce3+的熒光強(qiáng)度變化可間接測(cè)定羥基自由基的產(chǎn)生量。該法儀器簡(jiǎn)單,操作簡(jiǎn)便,測(cè)定快速,適于羥自由基的在線測(cè)定和監(jiān)控。

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