張森浩，嚴(yán)學(xué)兵，王成章，文開新，許來俊

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

2006年10月2日，瑞典皇家卡羅琳醫(yī)學(xué)院的諾貝爾大會(huì)宣布，本年度諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)由美國(guó)馬薩諸塞醫(yī)學(xué)院的克雷格·梅洛(Craig C．Mello)教授和斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授安德魯·法爾(Andrew Z．Fire)分享，以表彰他們發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象的貢獻(xiàn)[1]。RNA干擾是指外源或內(nèi)源性的雙鏈RNA進(jìn)入細(xì)胞后引起與其同源的RNA特異性降解，從而抑制相應(yīng)基因表達(dá)，表現(xiàn)出特定基因缺失的現(xiàn)象，它與植物中的共抑制(co-suppression)或轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)、真菌中的基因阻抑(quelling)一樣，均是生物體內(nèi)普遍存在的一種生理機(jī)制[2]。RNA干擾現(xiàn)象普遍存在于動(dòng)植物中[3]。在過去的20年，RNA干擾作為沉默基因表達(dá)的本能機(jī)制而出現(xiàn)，這種古老的抗病毒反應(yīng)可以用來特定地抑制某種目的基因功能，RNA干擾正在成為一個(gè)非常有效的研究工具用于揭示許多基因的功能[4]。目前，有關(guān)RNA干擾機(jī)理尚未闡明，相關(guān)的研究主要集中在治療人類疾病和提高植物的性狀方面[5]。通過調(diào)查研究新秀桿線蟲(Caenorhabditiselegans)、果蠅(Drosophilamelanogaster)及許多的無脊椎動(dòng)物、植物[如擬南芥(Arabidopsisthaliana)]、真菌[如粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa)，但不包括釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)]、老鼠胎兒期干細(xì)胞、卵母細(xì)胞及早期的胚胎等，發(fā)現(xiàn)了通過提供與所要沉默的基因序列一致的雙鏈RNA(dsRNA)可以從中中斷任何基因的表達(dá)[6]。

1 RNA干擾的發(fā)現(xiàn)

查爾酮合成酶基因CHS(chalcone synthase)與花色的關(guān)系密切，基因表達(dá)量的增加或減少都可能導(dǎo)致花色產(chǎn)生變異[7]。1990年，Napoli等[8]嘗試在有顏色的矮牽牛(Petuniahybrida)花翼瓣中通過介入CHS基因使查爾酮合成酶過量表達(dá)，來加深花瓣的顏色。出人意料的是，花瓣顏色不僅未加深，而且42%的介入CHS基因的植物的花全部變白或有白色或灰白圖案。當(dāng)時(shí)他們稱之為基因的共抑(co-suppression)，并認(rèn)為這種現(xiàn)象與甲基化作用(methylation)有關(guān)。在植物中，dsRNA可以在基因組的同源序列位點(diǎn)上誘導(dǎo)DNA發(fā)生甲基化[9]。甲基化是不對(duì)稱的，且不僅限于cpG或cpxpG序列，若甲基化發(fā)生在編碼區(qū)，對(duì)該基因座的基因轉(zhuǎn)錄無顯著影響，但是會(huì)引起轉(zhuǎn)錄后基因沉默；若發(fā)生在啟動(dòng)子區(qū)，則誘發(fā)轉(zhuǎn)錄水平基因沉默(transcriptional gene silencing，TGS)，它與PTGS不同，具有穩(wěn)定和可遺傳的特點(diǎn)[10]。1991年，F(xiàn)ire等[11]把RNA注入新秀桿線蟲以控制基因的表達(dá)。1992年，Romano和Macino[12]在粗糙鏈孢霉中發(fā)現(xiàn)外源基因的導(dǎo)入可以抑制具有同源序列的內(nèi)源基因的表達(dá)，稱之為基因表達(dá)的阻抑作用。1995年，美國(guó)康奈爾大學(xué)的Guo和Kemphues[13]試圖利用反義RNA技術(shù)阻斷線蟲par-1基因的表達(dá)，出現(xiàn)了par-1基因關(guān)閉的現(xiàn)象。Waterhouse等[14]發(fā)現(xiàn)，在植物中雙鏈RNA分子能誘導(dǎo)PTGS的現(xiàn)象，證明在被病毒感染后，能同時(shí)產(chǎn)生與病毒基因組同源的正義和反義RNAs的植物比那些只能產(chǎn)生正義或反義RNA的植物能更有效地抵御病毒的入侵。在特定的生物學(xué)系統(tǒng)中把RNA導(dǎo)入到細(xì)胞中可以阻止內(nèi)在基因功能的表達(dá)[15]。1998年，美國(guó)華盛頓卡耐基研究院的Fire等[16]在研究RNA干擾所需的結(jié)構(gòu)和傳遞條件的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，把dsRNA正義鏈和反義鏈的混合物注入線蟲體內(nèi)，比注入單獨(dú)的任意一個(gè)正義鏈或反義鏈的效果均要好；把純化的正義或反義鏈注入成年動(dòng)物體內(nèi)效果較弱，然而雙鏈的混合物則產(chǎn)生強(qiáng)有力的、特定的干擾，這種干擾的效應(yīng)不僅存在于被注入dsRNA的動(dòng)物，在后代中同樣有效。實(shí)際上，每個(gè)受感染的細(xì)胞只需要很少分子的dsRNA便能引起足夠的效應(yīng)來干擾內(nèi)在同源基因(endogenous mRNA)的表達(dá)，并認(rèn)為在干擾的進(jìn)程中存在催化或放大作用，他們將這種現(xiàn)象命名為RNAi。

2 RNA干擾的過程

2.1RNA干擾的特點(diǎn)

2.1.1特異性 RNAi具有很高的特異性，只降解與其序列相應(yīng)的單個(gè)內(nèi)源基因的mRNA，而對(duì)不相關(guān)序列的表達(dá)無干擾作用。不同目的基因結(jié)構(gòu)序列合成的dsRNA產(chǎn)生的效應(yīng)存在顯著差異，外顯子序列的dsRNA能產(chǎn)生特異和高效的基因抑制，而只針對(duì)內(nèi)含子序列的dsRNA則不能產(chǎn)生這種作用[17]。

2.1.2高穩(wěn)定性 siRNA(small interfering RNA)分子是3′端有突出的非配對(duì)堿基的雙鏈分子，在細(xì)胞內(nèi)可穩(wěn)定存在3～4 d[18]，半衰期遠(yuǎn)長(zhǎng)于反義寡聚核苷酸；RNAi還具有對(duì)靶mRNA的切割位點(diǎn)的準(zhǔn)確性和高穿透性等特點(diǎn)。

2.1.3高效性 RNA干擾抑制基因表達(dá)具有很高的效率，對(duì)目的基因表達(dá)的抑制可以達(dá)到缺失突變體表型的程度；而且數(shù)量相對(duì)很少的dsRNA分子(數(shù)量遠(yuǎn)少于內(nèi)源mRNA的數(shù)量)即能完全抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，許多生物學(xué)和遺傳學(xué)證據(jù)表明，RNA干擾效應(yīng)中存在信號(hào)分子的擴(kuò)增機(jī)制[16]。

2.1.4可傳播性和遺傳性 dsRNA分子能夠通過細(xì)胞膜、細(xì)胞間隙和細(xì)胞屏障而被轉(zhuǎn)運(yùn)。如經(jīng)線蟲小腸微注射或浸潤(rùn)喂食線蟲的方法進(jìn)入其體內(nèi)的dsRNA能被有效轉(zhuǎn)運(yùn)至全身各處，在各組織中對(duì)靶基因進(jìn)行抑制，在體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中都能檢測(cè)到RNA的表達(dá)，并且其子代也產(chǎn)生了對(duì)靶基因強(qiáng)烈而特異的抑制效應(yīng)。說明RNA干擾機(jī)制中可能存在維持mRNA降解序列特異性的信號(hào)分子。但這種遺傳只限于子一代，子二代往往又回復(fù)到野生型[19]。Palauqui等[20]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因引起基因沉默的植株可以通過嫁接從沉默砧木傳播到未沉默接穗上，通過將含有已沉默基因的植株嫁接到未沉默基因的寄主植株上，誘發(fā)寄主植株發(fā)生了RNA干擾。

2.1.5ATP依賴性 去除內(nèi)源性ATP后，dsRNA對(duì)目的基因的抑制作用明顯降低或消失，而加入外源性ATP后，仍不能加強(qiáng)其抑制作用，顯示RNAi是一個(gè)ATP依賴的過程。Zamore等[21]認(rèn)為，RNAi中至少有兩個(gè)過程需要ATP供能：一是dsRNA被Dicer酶酶切產(chǎn)生siRNA；二是siRNA與RISC結(jié)合解鏈后形成有活性的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。

2.2參與RNA干擾的幾個(gè)重要因子

2.2.1Dicer酶 Dicer酶是一種ATP依賴性核酸內(nèi)切酶，屬于RNase Ⅲ酶家族的成員之一[22]。Dicer酶能產(chǎn)生RNA干擾所必需的siRNA和miRNA(micro RNA)，這些小的RNA的特性由Dicer酶蛋白的結(jié)構(gòu)決定；Dicer酶蛋白包括RNA HELICs、PAZ、RNase和dsRNA結(jié)合域。不同生物體具有不同數(shù)量的Dicer酶，各Dicer酶既有功能上的各自獨(dú)立，又有冗余和交叉。在進(jìn)化過程中，Dicer酶的數(shù)量逐漸減少，卻逐步整合從而表現(xiàn)出更多功能[23]。

2.2.2小干涉RNA siRNA是通過Dicer酶或類Dicer酶從長(zhǎng)的雙鏈RNA切割產(chǎn)生或通過化學(xué)途徑合成的，大小為21～25個(gè)核苷酸(nt)，siRNA可以與多細(xì)胞蛋白結(jié)合形成RISC[5]。

2.2.3RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物 RISC是一種核酸和蛋白質(zhì)的復(fù)合物(包括蛋白質(zhì)和siRNA)，可以將同源的mRNA分解成siRNA；RISC已經(jīng)在果蠅和人類細(xì)胞中得到純化，而且都含有Argonaute蛋白家族的成員[24]，這種蛋白被認(rèn)為是該復(fù)合物的核心成分[25]。Tabara等[26]的研究表明，Argonaute蛋白質(zhì)RDE-1、QDE2和AGO1是RNAi過程中至關(guān)重要的成分，其作用與蠕蟲、果蠅和植物中的干涉過程類似。Argonaute及其同源蛋白質(zhì)的分子量大約100 kD，稱為PPD蛋白質(zhì)，均含有PAZ和PiWi結(jié)構(gòu)域；PAZ結(jié)構(gòu)域有一個(gè)很穩(wěn)定的褶層和一個(gè)桶狀中心，側(cè)旁的附屬物能與長(zhǎng)于5 nt的單鏈RNA和雙鏈RNA呈現(xiàn)很弱的結(jié)合[27]。

2.2.4RNA依賴的RNA聚合酶 RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-directed RNA polymerase，RdRP)在轉(zhuǎn)錄后基因沉默中起著重要作用。現(xiàn)已從植物中分離純化了RdRP，通過SDS-PAGE及天然條件下蔗糖密度梯度離心測(cè)定其分子量分別為128和115 kD，二者相差約10%，揭示RdRP可能是一種球狀蛋白[28]。實(shí)驗(yàn)顯示，RdRP在無引物條件下也可以催化轉(zhuǎn)錄，其主要作用是放大RNA沉默信號(hào)，使雙鏈RNA得到擴(kuò)增。目前已發(fā)現(xiàn)多種RdRP蛋白，如：SGS2/SDE1、RDR2、EGO-1、QDE-1等[29]。

2.3RNA干擾的機(jī)理 遺傳學(xué)和生物學(xué)的研究表明，RNAi是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，涉及許多未知功能的蛋白質(zhì)[30]。近年來的研究表明，長(zhǎng)的雙鏈RNA在類似于RNaseln的Dicer酶的作用下，通過核酸內(nèi)切作用，以ATP依賴的方式在胞漿中斷裂生成21～23 nt的siRNA分子，而具有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)、長(zhǎng)度為70～80 nt的單鏈RNA前體(pre-miRNA)則被切割為21～25 nt的雙鏈miRNA；siRNA和miRNA的作用機(jī)理相似，與核蛋白粒子(RNPs)結(jié)合，分別形成siRNA核蛋白復(fù)合物和miRNA核蛋白復(fù)合物，然后重排為RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物[31]。一般將含有siRNA的復(fù)合物稱為RISC，而將含有miRNA的復(fù)合物稱為miRNP[32]。復(fù)合物中只含有小RNA的一條單鏈，由于反義鏈(與靶RNA互補(bǔ))的5′端熱力學(xué)穩(wěn)定性較差，因此反義鏈形成復(fù)合物的機(jī)率較高，沉默效率也較高，該過程需消耗ATP[33]。siRNA為RNAi的觸發(fā)物(trigger)，稱為小干涉RNA，它是RNA干擾賴以發(fā)生的重要中間效應(yīng)分子，siRNA的序列與所作用的目的RNA的序列具有同源性[22]。長(zhǎng)的雙鏈RNA被切割成siRNA的過程中，Dicer酶起重要作用[34]。PAZ結(jié)構(gòu)域首先識(shí)別雙鏈RNA分子3′端突出的2個(gè)單鏈堿基，起錨定作用，dsRBD結(jié)構(gòu)域識(shí)別并結(jié)合雙鏈RNA分子5′端，與PAZ結(jié)構(gòu)域聯(lián)合固定Dicer酶，最后在RNaseln活性域的作用下切割雙鏈RNA分子成siRNA分子。siRNA是RNAi的效應(yīng)物，兩條單鏈末端具有5′磷酸基團(tuán)和3′末端具有2 nt突出的非配對(duì)的堿基。這種結(jié)構(gòu)對(duì)于siRNA有效地引發(fā)RNAi反應(yīng)是相當(dāng)重要的[22]。雙鏈siRNA與一種蛋白復(fù)合物相結(jié)合，這種蛋白復(fù)合物含有一個(gè)siRNA和一個(gè)蛋白核酸酶分子，在siRNA的指導(dǎo)下，蛋白復(fù)合物形成了一種有活性的RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合體RISC，然后RISC中的siRNA引導(dǎo)沉默復(fù)合物識(shí)別靶向同源mRNA，接著RNA解旋酶完成靶向mRNA與siRNA正義鏈換位，在少量ATP參與的情況下，RNase在距離siRNA 3′端12 nt處切割靶mRNA，并使其降解，從而達(dá)到轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)的結(jié)果[35]。哺乳動(dòng)物中的RNAi主要以RISC為主，但植物中的RNAi還可以另外一種形式進(jìn)行，即RNA依賴RNA聚合酶RdRP[36]。在RdRp介導(dǎo)的沉默中：首先，被導(dǎo)入的dsRNA直接與目標(biāo)mRNA形成雙鏈，然后在Dicer酶的作用下形成siRNA，再進(jìn)一步以siRNA的反義鏈為引物、目標(biāo)mRNA為模板，在RdRP作用下發(fā)生類似PCR反應(yīng)，形成新的dsRNA，新形成的dsRNA被Dicer再次切割形成siRNA，達(dá)到干擾目的基因表達(dá)的效果[37]。Simmer等[38]在裂殖酵母上的研究表明，RdRp(Rdp1)可以在體內(nèi)從目標(biāo)RNA模板合成RNA，產(chǎn)生的這些RNA不與發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpin structure)同源。

3 RNA干擾在植物中的誘導(dǎo)方法及載體構(gòu)建

植物中RNAi的誘導(dǎo)方法包括農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)法、粒子轟擊法、聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)法、電擊穿孔法、病毒介導(dǎo)法(virus-induced gene silencing，VIGS)等[39]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法快速、可靠、成本低，用于將dsRNA引入植物使基因沉默[40]，也是常用的RNAi的誘導(dǎo)方法；粒子轟擊法相對(duì)快速，但轉(zhuǎn)化效率較低；PEG 介導(dǎo)法及電擊穿孔法等已在多種不同種屬的植物中成功應(yīng)用，但其周期過長(zhǎng)不適于大規(guī)模鑒定基因功能。病毒介導(dǎo)的基因沉默是一種研究基因瞬時(shí)表達(dá)的新方法，它利用改造的病毒作為載體，這種改造的病毒無致病能力或只表現(xiàn)出很輕的病癥，并且能復(fù)制，把這種載體通過體外轉(zhuǎn)錄直接侵染植物或通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍的方法，就可把目的基因序列導(dǎo)入宿主內(nèi)，病毒便在植物內(nèi)復(fù)制和傳播，從而誘導(dǎo)基因沉默[39]。

在植物RNA干擾的研究中，無論是驗(yàn)證未知基因功能還是改良作物品質(zhì)，構(gòu)建相應(yīng)的RNA干擾表達(dá)載體都是最基本的試驗(yàn)步驟和必要方法，尤其是在應(yīng)用RNA干擾技術(shù)進(jìn)行作物品質(zhì)改良時(shí)，要得到可穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株，構(gòu)建RNAi的表達(dá)載體必不可少：由于要誘發(fā)植物中的RNA干擾機(jī)制，必須要求導(dǎo)入的外源基因片段具有正反相連的RNAi結(jié)構(gòu)。所以，構(gòu)建高效的植物RNAi表達(dá)載體，對(duì)于RNAi技術(shù)在植物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要的推動(dòng)作用[41]。用能夠表達(dá)產(chǎn)生dsRNA的質(zhì)粒或病毒載體轉(zhuǎn)化植物，或者通過轉(zhuǎn)基因及病毒感染的方法在植物中過量表達(dá)單鏈RNA從而引起共抑制反應(yīng)，都可以在植物中引發(fā)RNAi。其中利用T-DNA插入在植物中誘導(dǎo)產(chǎn)生RNAi的技術(shù)路線在擬南芥[42]和水稻(Oryzasativa)[43]等模式植物的功能基因組學(xué)研究中得到了較為廣泛的應(yīng)用。該路線的原理如下：PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因的cDNA片段，分別以正向和反向插入雙元植物表達(dá)載體，由強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄，正反片段之間由一段載體上的內(nèi)含子序列隔開以維持載體的穩(wěn)定性；該系統(tǒng)在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生帶發(fā)夾結(jié)構(gòu)的dsRNA，引發(fā)RNAi，從而抑制目的基因的表達(dá)[44]。

4 RNA干擾在植物中的研究進(jìn)展

4.1在基因功能研究中的作用 在后基因組時(shí)代，人們迫切需要一種工具大規(guī)模地研究基因的功能。RNAi技術(shù)有逆基因分析的特點(diǎn)，通過特異地抑制靶基因的表達(dá)，獲得功能喪失或降低的突變體，進(jìn)而找出該基因?qū)?xì)胞發(fā)育、分化及功能的相應(yīng)聯(lián)系，同時(shí)對(duì)鄰近基因的結(jié)構(gòu)、功能及表達(dá)無影響。RNA干擾在植物中被發(fā)現(xiàn)作為干擾核酸的機(jī)制而存在，例如通過小的(20～26 nt)RNA分子干擾病毒和轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，也是植物的一種防御方式。近來研究發(fā)現(xiàn)，RNA干擾通過多種途徑發(fā)生，內(nèi)源干擾途徑在基因轉(zhuǎn)錄、RNA的穩(wěn)定性及翻譯水平上發(fā)揮了重要作用[45]。

2010年，Vaistij等[46]證明，在擬南芥中可以通過RNA干擾來抑制miRNA的積累；通過運(yùn)用設(shè)計(jì)的靶向初級(jí)miRNA轉(zhuǎn)錄和啟動(dòng)子的發(fā)夾RNAi結(jié)構(gòu)，可以顯著地降低miR163和miR171a的積累；靶向的啟動(dòng)子區(qū)域DNA的甲基化表明抑制miRNA初期的轉(zhuǎn)錄是可行的，可以實(shí)現(xiàn)miRNA表達(dá)的敲除，從而為打亂miRNA的目標(biāo)配對(duì)和研究miRNA的功能提供了一個(gè)簡(jiǎn)單的方法。在棉花(Gossypiumspp.)纖維中基因編碼的類成束蛋白-阿拉伯半乳聚糖蛋白質(zhì)(fasciclin-like arabinoglactan proteins，F(xiàn)LAs)的作用通過構(gòu)建RNA干擾體進(jìn)行驗(yàn)證；根據(jù)GhAGP4的序列的RNA干擾使mRNA的水平顯著下降，其他3個(gè)FALs蛋白則部分受到抑制；在轉(zhuǎn)基因植株中，纖維的初始長(zhǎng)度和伸長(zhǎng)受到抑制，成熟的轉(zhuǎn)基因棉花纖維的長(zhǎng)度明顯變短并且纖維質(zhì)量變差。對(duì)GhAGP4的RNA干擾影響了纖維細(xì)胞中纖維素的沉積。在培養(yǎng)過程中，GA3可以上調(diào)FLAs基因的表達(dá)，特別是GhAGP2和GhAGP4，結(jié)果表明FLAs基因?qū)w維的初始長(zhǎng)度和伸長(zhǎng)起著十分重要的作用[47]?？祰?guó)章等[48]采用RT-PCR方法從小麥(Triticumaestivum)品種的發(fā)育籽粒中克隆出SSIII基因部分cDNA片段，并以pWM101質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建了由35S啟動(dòng)子調(diào)控的SSIII基因的反義表達(dá)載體，還以pF6C5941質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建了SSIII基因的RNAi干擾載體，把這兩種載體導(dǎo)入小麥中，可降低或抑制SSIII基因的表達(dá)，通過分析轉(zhuǎn)基因小麥籽粒內(nèi)支鏈淀粉組分的變化來研究SSIII基因在調(diào)控小麥支鏈淀粉合成中的作用。

RNAi技術(shù)能快速、高效、特異地使靶基因失活，從而可以非常有效地鑒定特定基因的功能，為解析植物基因的功能開辟了一條捷徑。研究鑒定植物中的優(yōu)良基因或致病基因，可以給育種工作及減輕病害提供幫助，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有指導(dǎo)意義。

4.2在抗病性研究中的作用 利用RNAi技術(shù)的原理，根據(jù)病毒的基因序列設(shè)計(jì)與之同源的dsRNA，導(dǎo)入到植物中，引發(fā)RNAi，可以對(duì)病毒進(jìn)行特異性的切割，達(dá)到抑制病毒的作用。小麥條紋花葉病毒(wheat streak mosaic virus，WSMV)通過小麥卷葉纓螨(wheat curl mite)傳播，對(duì)美國(guó)和加拿大平原地區(qū)的經(jīng)濟(jì)有很大影響。2010年，F(xiàn)ahim等[49]在澳大利亞發(fā)現(xiàn)了小麥條紋花葉病毒，該病毒在小麥種植區(qū)迅速傳播。由于在小麥體內(nèi)很難找到抵御這種病毒的抗體，促使其通過基于RNAi的方法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因抗體。小麥可以和兩種質(zhì)粒穩(wěn)定地共轉(zhuǎn)化：表達(dá)包含WSMV序列的發(fā)夾RNA(hairpin RNA)的pStargate-NIa質(zhì)粒和含有nptII選擇性標(biāo)記的pCMneoSTLS2質(zhì)粒。Southern印跡雜交分析表明，hpRNA整合到了小麥基因組中，而且來自hpRNA轉(zhuǎn)基因序列的小RNA的積累與免疫力呈正相關(guān)關(guān)系，證明通過這種技術(shù)產(chǎn)生非標(biāo)記的WSMV免疫的轉(zhuǎn)基因植株是可行的，這是第一次在小麥中報(bào)告運(yùn)用捻接內(nèi)含子hpRNA表達(dá)的策略來對(duì)WSMV產(chǎn)生免疫。

馬鈴薯(Solanumtuberosum)是世界上廣泛種植的糧、菜、飼兼用型作物，在我國(guó)干旱、半干旱地區(qū)種植面積較大，但對(duì)病害比較敏感[50]。馬鈴薯中StRFP1基因抵抗晚疫病的功能已經(jīng)通過表達(dá)和構(gòu)建RNA干擾媒介進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)StRFP1基因的植株致病比正常植株慢，用RNA干擾把StRFP1基因沉默掉則對(duì)病原體的感染敏感，證明StRFP1基因?qū)Φ挚柜R鈴薯中的致病疫酶起著很重要的作用[51]。

棉花病蟲害是制約其產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一，每年可造成大量減產(chǎn)。棉花曲葉病毒在巴基斯坦、印度等熱帶地區(qū)經(jīng)常肆虐，減產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，Asad等[52]通過構(gòu)建含棉花曲葉病毒DNA的載體轉(zhuǎn)化煙草(Nicotianatabacum)表達(dá)病毒正義和反義的RNAs，結(jié)果25%的轉(zhuǎn)基因煙草顯示穩(wěn)定的病毒抗性。姜洋等[53]通過農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)，轉(zhuǎn)化攜帶pTiC58 T-DNA的煙草葉片，獲得攜帶正、反向吲哚乙酰胺水解酶基因(iaaH)序列的轉(zhuǎn)基因植株，ELISA分析生長(zhǎng)素的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植物葉片的內(nèi)源生長(zhǎng)素含量明顯降低，僅為pTiC58 T-DNA轉(zhuǎn)化植株的56%，說明轉(zhuǎn)基因煙草中發(fā)生iaaH基因轉(zhuǎn)錄后沉默，為利用該基因序列啟動(dòng)RNA干擾、抑制冠癭瘤病發(fā)生提供了依據(jù)。對(duì)抗病毒轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)了dsRNA和siRNA，說明轉(zhuǎn)錄后基因沉默是最有可能引起抗病毒的機(jī)制；這些研究為以后在棉花上應(yīng)用RNAi進(jìn)行抗棉花曲葉病毒研究指明了方向，也為其他抗病毒研究工作提供了有益的參考[54]。在植物的抗病性研究方面，通過RNAi技術(shù)，可以特異地抑制相應(yīng)的致病基因，不僅保護(hù)了植物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上也增加了收益。

4.3在遺傳改良研究中的作用 隨著生活水平的提高，人們對(duì)植物所提供產(chǎn)品的要求也越來越高，例如要求食物的主要營(yíng)養(yǎng)成分含量更高且比例更平衡，抗?fàn)I養(yǎng)成分更少。傳統(tǒng)的育種方法顯然不能完全滿足人們的需求，而RNAi技術(shù)的出現(xiàn)使一切成為可能。

利用RNAi技術(shù)可以改變花色。應(yīng)用RNAi技術(shù)干涉與色素形成有關(guān)的基因，能誘導(dǎo)產(chǎn)生一些不同尋常顏色甚至花型的花，如日本和澳大利亞研究者利用RNAi沉默玫瑰(Rosarugosa)中二氫黃酮醇4-還原酶基因，培育出了藍(lán)色玫瑰[55]。Shoji等[56]在郁金香(Tulipagesneriana)花色試驗(yàn)證明，TgVit1基因的表達(dá)和TgFER1基因的抑制對(duì)花被底部的藍(lán)色是至關(guān)重要的。

利用RNAi技術(shù)可以提高油酸含量。陳葦?shù)萚57]利用已獲得的甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)種子貯存蛋白——十字花科蛋白(cruciferin)基因的啟動(dòng)子和終止子，構(gòu)建了無選擇標(biāo)記基因且同時(shí)具有正義和反義結(jié)構(gòu)的油酰去飽和酶基因(Fad2)種子特異表達(dá)RNAi載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，獲得了只含有油菜原有基因且Fad2基因表達(dá)受抑制的轉(zhuǎn)基因植株。RT-PCR分析結(jié)果表明，在油酸含量達(dá)83.9%的轉(zhuǎn)基因植株中未檢測(cè)到在非轉(zhuǎn)基因植株中普遍存在的Fad2基因轉(zhuǎn)錄mRNA——一種典型的RNA干擾現(xiàn)象，通過對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)的觀察比較，該高油酸含量轉(zhuǎn)基因株系并未表現(xiàn)出雙突變體中由于Fad2基因的失活所引起的植株抗寒能力差、發(fā)育遲緩、花蕾死亡、結(jié)實(shí)率低等不利的農(nóng)藝學(xué)性狀。李蘭玉等[58]利用甘藍(lán)型油菜種子特異性貯存蛋白基因cruciferin啟動(dòng)子及NOS終止子構(gòu)建了無選擇標(biāo)記基因且含有反義結(jié)構(gòu)的油酸脫飽和酶基因的RNAi表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，獲得了無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株。再生植株的PCR檢測(cè)表明，外源基因已高頻率地整合到油菜基因組中，而且脂肪酸含量分析表明，獲得的轉(zhuǎn)基因種子油酸含量比對(duì)照有了很大的提高。錢春等[59]指出，纖維素酶、果膠裂解酶和伸展蛋白是參與草莓(Fragariaananassa)果實(shí)成熟軟化的關(guān)鍵因子，并提出了利用RNA干擾等生物技術(shù)對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行調(diào)控，降低相關(guān)酶的mRNA表達(dá)，提高草莓果實(shí)硬度從而延長(zhǎng)保存時(shí)間的研究思路。

利用RNAi可以改善植物中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量。Ogita等[60]利用RNAi技術(shù)抑制咖啡植物中編碼可可堿合成酶(CaMXMT1)基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植物中可可堿含量下降了30%～80%，咖啡因含量下降50%～70%。柴曉杰等[61]克隆了玉米(Zeamays)淀粉分支酶(starch branching enzymes，SBE)基因，構(gòu)建了高效的siRNA表達(dá)體系，通過花粉管通道法導(dǎo)入玉米自交系，Northern雜交分析表明，該目的基因在轉(zhuǎn)基因植株中能正常轉(zhuǎn)錄并導(dǎo)致內(nèi)源SBE mRNA含量下降，直鏈淀粉的含量提高了約50%。郭志鴻等[62]采用RNAi技術(shù)通過沉默內(nèi)源Sbe 1和Sbe 2，獲得高直鏈淀粉含量的馬鈴薯。馬建等[63]的實(shí)驗(yàn)證明，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)可有效抑制大豆(Glycinemax)籽粒中脂肪氧化酶基因表達(dá)，降低脂肪氧化酶活性，提高大豆脂肪含量，改良大豆品質(zhì)，創(chuàng)造優(yōu)良大豆種質(zhì)。

利用RNAi還可以改良牧草。牧草種質(zhì)資源是發(fā)展草地畜牧業(yè)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，是篩選和培育優(yōu)良牧草新品種的基本材料[64]。黑麥草(Loliumperenne)原產(chǎn)于亞洲和北非的溫帶地區(qū)，具有抗寒、耐踐踏、再生能力強(qiáng)、成坪快、營(yíng)養(yǎng)豐富、生物產(chǎn)量高、可消化性高、適口性好等特點(diǎn)，成為我國(guó)最重要的冷季牧草之一[65-66]。Bhalla等[67]通過反義RNA技術(shù)，構(gòu)建表達(dá)lolp5基因反義RNA載體，用基因槍將其轉(zhuǎn)入多年生黑麥草中，使lolp5基因表達(dá)受到抑制或表達(dá)下調(diào)，獲得可育的、該基因表達(dá)遭到破壞的、低致敏的轉(zhuǎn)基因黑麥草。Singh和Bhalla[68]通過引入突變使黑麥草花粉致敏蛋白結(jié)構(gòu)折疊發(fā)生改變，而使花粉不能對(duì)人產(chǎn)生致敏的副作用。

5 RNA干擾存在的問題展望

RNA干擾技術(shù)被發(fā)現(xiàn)以來，盡管僅20年時(shí)間，但在植物上的發(fā)展相當(dāng)迅速。目前該方面還存在一些問題需要進(jìn)一步深入研究，如RNAi具體的作用機(jī)制、RISC的形成及作用機(jī)理、切割靶mRNA的過程、設(shè)計(jì)合成有效的siRNA、選擇合適的siRNA轉(zhuǎn)染試劑、構(gòu)建有效的干擾載體等。此外，并非所有的RNA序列都能比較容易的接近siRNA、被識(shí)別、切割，有些靶序列可能隱藏在二級(jí)結(jié)構(gòu)下，或者位于高度折疊的區(qū)域中，而有些序列可能與蛋白質(zhì)形成緊密的復(fù)合物，阻礙了與siRNA的識(shí)別；一些與靶基因同源性高的基因可能會(huì)被沉默等。這些都有待于科研工作者進(jìn)行更加深入的研究。令人興奮的是，RNAi與其他技術(shù)相比具有高效性、安全性和特異性，且操作簡(jiǎn)單、成本低。隨著已知基因數(shù)目和EST(expressed sequence tag)測(cè)序項(xiàng)目的增加，人們對(duì)植物體基因組研究的深入和RNAi技術(shù)的不斷完善，RNAi在植物中的研究及應(yīng)用前景將更加廣闊，也將在不斷的應(yīng)用中進(jìn)一步發(fā)展，同時(shí)給人們帶來更大的科研價(jià)值及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

[1] 趙永娟，章靜波.RNA干擾[J].解剖學(xué)報(bào)，2006,37(6):720-723.

[2] 黃偉素.水稻穗頸伸長(zhǎng)基因6872的功能驗(yàn)證[D].杭州:浙江大學(xué)，2006.

[3] Sidahmed A M,Wilkie B.Endogenous antiviral mechanisms of RNA interference: a comparative biology perspective[J].Methods in Molecular Biology,2010,623:3-19.

[4] Mocellin S,Provenzano M.RNA interference: learning gene knockdown from cell physiology[J].Journal of Translational Medicine,2004(2):39-44.

[5] Tang G L,Galili G.Using RNAi to improve plant nutritional value: from mechanism to application[J].Trends in Biotechnology,2004,22(9):463-469.

[6] Cogoni C,Romano N,Macino G.Suppression of gene expression by homologous transgenes[J].Antonie van Leeuwenhoek,1994,65:205-209.

[7] 蔣明，曹家樹.查爾酮合成酶基因[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志，2007,29:525-529.

[8] Napoli C,Lemieux C,Jorgensen R.Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into Petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans[J].Plant Cell,1990,2(4):279-289.

[9] Wassenegger M,Heimes S,S?nger H L.An infectious viroid RNA replicon evolved from an in vitro-generated non-infectious viroid deletion mutant via a complementary deletion in vivo[J].EMBO Journal,1994,13(24):6172-6177.

[10] Jones L,Ratcliff F,Baulcombe D C.RNA-directed transcriptional gene silencing in plants can be inherited independently of the RNA trigger and requires Met1 for maintenance[J].Current Biology,2001,11:747-757.

[11] Fire A,Albertson D,Harrison S,etal.Production of antisense RNA leads to effective and specific inhibition of gene expression inC.elegansmuscle [J].Development,1991,113:503-514.

[12] Romano N,Macino G.Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences[J].Molecular Microbiology,1992,6(22):3343-3353.

[13] Guo S,Kemphues K J.par-1,a gene required for establishing polarity inC.elegansembryos,encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed[J].Cell,1995,81(4):611-620.

[14] Waterhouse P M,Graham M W,Wang M B.Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1998,95:13959-13964.

[15] Nellen W,Lichtenstein C.What makes an mRNA anti-sense-itive[J].Trends in Biochemical Sciences,1993,18(11):419-423.

[16] Fire A,Xu S,Montgomery M,etal.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA inCaenorhabditiselegans[J].Nature,1998,391(6669):806-811.

[17] Kawasaki H,Taira K.Short hairpin type of dsRNA that are controlled by tRNA(Val) promoter significantly induce RNAi mediated gene silencing in the cytoplasm of human cells[J].Nucleic Acids Research,2003,31:700-707.

[18] 石智，符立梧.RNAi及其在腫瘤中的應(yīng)用[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2004,31(6):492-499.

[19] Caplen N J,Fleenor J,Fire A,etal.dsRNA-mediated gene silencing in cultured Drosophila cells[J].Gene,2000,252:95-105.

[20] Palauqui J C,Elmayan T,Pollien J M,etal.Systemic acquired silencing: transgene-specific post-transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions[J].EMBO Journal,1998,16(15):4738-4745.

[21] Zamore P D,Tuschl T,Sharp P A,etal.RNAi:dsRNA directs the ATP dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals[J].Cell,1999,101:25-33.

[22] 馬超，郝青南，馬兵鋼.RNA干擾在植物中的作用機(jī)理及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報(bào)，2008,28(9):1920-1927.

[23] Peng J J,Yan F,Chen H R,etal.Progress of studies on Dicer structure and function[J].Yi Chuan,2008,30(12):1550-1556.

[24] Zilbrtmsn D,Cao X,Jacobsen S E.ARGONAUTE4 control of locus-specific siRNA accumulation and DNA and histons methylation[J].Science,2003,299:716-719.

[25] Martinez J,Patkaniowska A,Urlaub Hetal.Single-straned antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNA[J].Cell,2002,110:563-574.

[26] Tabara H,Sarkissian M,Kelly W G,etal.The rde-1 gene,RNA interference,and transposon silencing inC.elegans[J].Cell,1999,99:123-132.

[27] Lingel A,Simon B,Izaurralde E,etal.Structure and nucleic-acid binding of the Drosophila Argonaute 2 PAZ domain[J].Nature,2003,426:465-469.

[28] Ceruttl L,Mian N,Bateman A.Domains in gene silencing and cell diferentiation proteins: The novel DAZ domain and redefinition of Piwi domain[J].Trends in Biochemical Sciences,2000,25:481-482．

[29] 馬建，劉藝苓，王丕武.植物RNA干擾的研究進(jìn)展[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2008,30(2):252-259.

[30] Montgomery M K,Fire A.Double-stranded RNA as a mediator in sequence-specific genetic silencing and co-suppression [J].Trends in Genetics,1998,14:255-258.

[31] Hammond S M,Bernstein E,Beach D,etal.An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells[J].Nature,2000,404(6775):293-296．

[32] Mourelatos Z,Dostie J,Paushkin S,etal.miRNPs:a novel class of ribonucleo-proteins containing numerous microRNAs[J].Genes & Development,2002,16(6):720-728.

[33] 滑國(guó)華，楊利國(guó).RNA干擾及其在動(dòng)物繁殖研究中的應(yīng)用[J].動(dòng)物學(xué)雜志，2007,42(2):148-152.

[34] Matranga C,Zamore P D.Small silencing RNAs[J].Current Biology,2007,17(18):789-793.

[35] Bartel D P.microRNAs: genomics,biogenesis,mechanism and function[J].Cell,2004,116:281-297.

[36] Chiu Y L,Rana T M.RNAi in Human cells: Basic structural and functional features of small interfering RNA[J].Molecular Cell,2002,10(3):549-561.

[37] Voinnet O.Use,tolerance and avoidance of amplified RNA silencing by plants[J].Trends in Plant Science,2008,13(7):317-328.

[38] Simmer F,Buscaino A,Kos-Braun I C,etal.Hairpin RNA induces secondary small interfering RNA synthesis and silencing in trans in fission yeast[J].EMBO Reports,2010,11(2):112-118.

[39] 陳李淼，趙琳，郝迪，等.植物中RNA干擾技術(shù)的研究與應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009,40(10):122-128.

[40] Sch?b H,Kunz C,Meins F J.Silencing of transgenes introduced into leaves by agroinfiltration: a simple,rapid method for investigating sequence requirements for gene silencing[J].Molecular and General Genetics,1997,256(5):581-585.

[41] 馬建，魏益凡，厲志，等.植物RNA干擾表達(dá)載體構(gòu)建方法的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009,37(18):8364-8366.

[42] Matthew L.RNAi for plant functional genomics [J].Comparative and Functional Genomics,2004(5):240-244.

[43] Miki D,Itoh R,Shimamoto K.RNA silencing of single and multiple members in a gene family of rice[J].Plant Physiology,2005,138:1903-1913.

[44] 彭昊，翟英，張芊，等.水稻高效RNA干涉體系的建立及其功能分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006,39(9):1729-1735.

[45] Voinnet O.RNA silencing as a plant immune system against viruses [J].Trends in Genetics,2001,17(8):449-459.

[46] Vaistij F E,Elias L,George G L,etal.Suppression of microRNA accumulation via RNA interference inArabidopsisthaliana[J].Plant Molecular Biology,2010,73:391-397.

[47] Li Y,Liu D,Tu L,etal.Suppression of GhAGP4 gene expression repressed the initiation and elongation of cotton fiber[J].Plant Cell Reports,2010,29(2):193-202.

[48] 康國(guó)章，官春云，肖向紅，等.小麥淀粉合酶基因Ⅲ片段的克隆及反義和RNA干擾載體的構(gòu)建[J].中國(guó)生物工程雜志，2007,27(8):40-45.

[49] Fahim M,Ayala-N L,Millar A A,etal.Hairpin RNA derived from viral NIa gene confers immunity to wheat streak mosaic virus infection in transgenic wheat plants [J].Plant Biotechnology Journal,2010(8):1-14.

[50] 張茹，李金花，柴兆祥，等.Chi基因的克隆及轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的獲得[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2009,18(6):51-58.

[51] Ni X,Tian Z,Liu J,etal.Cloning and molecular characterization of the potato RING finger protein gene StRFP1 and its function in potato broad-spectrum resistance against Phytophthora infestans[J].Journal of Plant Physiology,2010,167(6):488-496.

[52] Asad S,Haris W A A,Bashir A,etal.Transgenic tobacco expressing geminiviral RNAs are resistant to the serious viral pathogen causing cotton leaf curl disease[J].Archives of Virology,2003,148:2341-2352.

[53] 姜洋，肖尊安，李俊全.RNA干擾降低煙草植株中內(nèi)源生長(zhǎng)素水平[J].北京師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2006,42(4):401-404.

[54] 洪偉東，李付廣，劉傳亮，等.RNA干涉及其在棉花研究中的應(yīng)用[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009,28(3):601-606.

[55] 白描，楊國(guó)順，陳石，等.植物RNAi的特點(diǎn)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2009,8: 6-10.

[56] Shoji K,Momonoi K,Tsuji T.Alternative expression of vacuolar iron transporter and ferritin genes leads to blue/purple coloration of flowers in tulip cv.‘Murasakizuisho’[J].Plant and Cell Physiology,2010,51(2):215-224.

[57] 陳葦，李勁峰，董云松，等.甘藍(lán)型油菜Fad2基因的RNA干擾及無篩選標(biāo)記高油酸含量轉(zhuǎn)基因油菜新種質(zhì)的獲得[J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，2006,32(6):665-671.

[58] 李蘭玉，陳葦，楊清輝，等.甘藍(lán)型油菜反義Fad2基因RNAi載體無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008,21(6):1527-1530.

[59] 錢春，張興國(guó)，梁國(guó)魯.草莓果實(shí)成熟軟化相關(guān)基因研究進(jìn)展[J].中國(guó)蔬菜，2009(22):6-12.

[60] Ogita S,Uefuji H,Yamaguchi Y,etal.RNA interference:Producing decaffeinated coffee plants[J].Nature,2003,423:823.

[61] 柴曉杰，王丕武，關(guān)淑艷，等.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)降低玉米支鏈淀粉含量[J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，2005,31(6):625-630.

[62] 郭志鴻，張金文，王蒂，等.用RNA干擾技術(shù)創(chuàng)造高直鏈淀粉馬鈴薯材料[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008,41(2):494-501.

[63] 馬建，張君，曲靜，等.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)創(chuàng)造低脂肪氧化酶活性大豆新種質(zhì)[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009,42(11):3804-3811.

[64] 南麗麗，贠旭疆，李曉芳，等.牧草種質(zhì)資源中心庫(kù)庫(kù)存資源經(jīng)濟(jì)價(jià)值多樣性[J].草業(yè)科學(xué),2010,27(6):108-114.

[65] 于玉紅，王亮，黃曉露，等.6個(gè)多年生黑麥草品種的交播性狀比較[J].草業(yè)科學(xué)，2009,26(8):172-176.

[66] 黃勤樓，鐘珍梅，陳恩，等.施氮水平與方式對(duì)黑麥草生物學(xué)特性和硝酸鹽含量的影響[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2010,19(1):103-112.

[67] Bhalla P L,Swoboda I,Singh M B.Antisense-mediated silencing of a gene encoding a major ryegrass pollen allergen[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1999,96:11676-11680.

[68] Singh M B,Bhalla P L.Hypoallergenic derivatives of major grass pollen allergens for allergy vaccination[J].Immunology and Cell Biology,2003,81:86-91.