劉新亮，德 英，趙來喜

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081)

垂穗披堿草(Elymusnutans)為禾本科(Gramineae)小麥族(Triticeae)披堿草屬(Elymus)多年生疏叢型草本植物，又名鉤頭草、彎穗草[1]，染色體組構(gòu)成為StStYYHH(2n=42)[2]。國外主要分布于俄羅斯、土耳其、印度、蒙古等地，我國主要分布于西北、西南、華北地區(qū)[1]。垂穗披堿草根莖分蘗能力強，具有極強的抗寒性和抗旱性，能適應(yīng)各種不同類型的土壤，灘地、溝谷、陰坡山麓地帶到灌叢草甸和高山草甸均能生長。開花期前垂穗披堿草質(zhì)地柔軟，無刺毛、剛毛，無異味，為馬、牛、羊喜食牧草，整個生長季節(jié)粗蛋白含量變化幅度較小，屬中上等品質(zhì)牧草[1-6]，同時也是最具經(jīng)濟意義的草種[7-8]。簡單序列重復(fù)區(qū)間(inter-simple sequence repeat，ISSR)是Zietkiewicz等[9]于1994年創(chuàng)建的以重復(fù)序列的單一引物為主要引物序列的PCR標記，它結(jié)合了SSR和RAPD的優(yōu)點，主要特點是操作簡單，遺傳多態(tài)性高，重復(fù)性好，耗資少，模板DNA用量少?；谶@些優(yōu)點，ISSR分子標記已廣泛應(yīng)用于牧草種質(zhì)資源鑒定、牧草遺傳多樣性與分類進化、DNA指紋圖庫的建立、親緣關(guān)系分析、遺傳圖譜構(gòu)建、分子標記輔助育種等方面的研究[10]。ISSR分子標記在披堿草屬植物研究中的應(yīng)用多見報道[11-12]，而其在垂穗披堿草研究中應(yīng)用相對較少。ISSR分子標記反應(yīng)條件易受模板DNA、dNTPs、Mg2+、TaqDNA聚合酶、引物等因素的影響，ISSR擴增結(jié)果，若以單因素試驗，難免忽視其互作效應(yīng)，而正交試驗?zāi)軌蚍治龈饕蛩刂g的內(nèi)在規(guī)律，具有均衡分散、整齊可比和效應(yīng)明確的優(yōu)點，能較快地找到最優(yōu)組合，找出影響擴增的主要因素和次要因素[13]。本研究利用正交試驗設(shè)計，從模板DNA、dNTPs、Mg2+、TaqDNA聚合酶、引物5個因素4個水平，對垂穗披堿草ISSR-PCR反應(yīng)體系進行優(yōu)化，以期獲得垂穗披堿草的最佳反應(yīng)體系。

1 材料與方法

1.1材料 供試的17份試驗材料由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所提供(表1)，于2010年5月在溫室育苗，待幼苗長到一定高度，采集嫩葉，置于-80℃保存?zhèn)溆谩⒖捡R嘯[11]和祁娟[3]所用引物序列，由上海生工生物工程有限公司合成(表2)。PCR所用的dNTPs、Mg2+、TaqDNA聚合酶、10×buffer(不含Mg2+)均購自大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)。

1.2方法

1.2.1DNA提取 采用改良過的CTAB法[14]提取基因組DNA，利用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，利用UNICO公司生產(chǎn)的UN 4802型紫外分光光度計檢測DNA的濃度和DNA純度，并將質(zhì)量濃度稀釋到30 ng/μL。

表1 試驗所用垂穗披堿草材料

表2 試驗所采用的引物序列

1.2.2ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化 以UBC822為試驗引物，引物序列為(TC)8A，用EN001樣品DNA作為模板，選用L16(45)正交表對Mg2+、Taq DNA聚合酶、模板DNA、dNTPs、引物5個因素各4個水平設(shè)計PCR擴增體系的因素-水平試驗(表3)。

表3 ISSR-PCR體系的因素水平

將表4的處理重復(fù)2次，PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，除表4所列變化因素外,每個組合中還含有10×buffer(不含Mg2+)2.5 μL，用ddH2O補充總體積至25 μL。

表4 ISSR-PCR正交試驗數(shù)據(jù)表

1.2.3PCR擴增 PCR擴增反應(yīng)是在DNAEngine(PTC-200)PCR儀上進行。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性1 min，51℃退火1 min，72℃延伸2 min，共40個循環(huán)，72℃延伸10 min，擴增完后4℃保存[11]，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，DL2000為Marker，在Bio-RAP凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.2.4引物退火溫度的確定 在試驗最佳反應(yīng)體系確定的基礎(chǔ)上，在DNAEngine(PTC-200)PCR儀上進行最佳退火溫度的篩選，從25條引物中篩選出多態(tài)性豐富的引物，根據(jù)理論退火溫度對每個引物進行退火溫度的梯度試驗，設(shè)置8個梯度：47.7、49.2、51.5、54.4、57.8、60.6、62.8和64.4℃。

1.2.5循環(huán)次數(shù)、延伸時間的確定 利用最佳反應(yīng)體系和最適退火溫度對循環(huán)次數(shù)進行梯度試驗，設(shè)定梯度為：35、37、39、41、43和45次，每個梯度2個重復(fù)；利用最佳反應(yīng)體系、最適退火溫度、最佳循環(huán)次數(shù)對體系延伸時間進行梯度試驗，設(shè)60、90、120 s 3個梯度，每個梯度2個重復(fù)。

1.2.6最佳體系的驗證 利用優(yōu)化出的結(jié)果即最佳反應(yīng)體系，引物的最適退火溫度、最適循環(huán)數(shù)、最適延伸時間對試驗材料進行驗證，以提高優(yōu)化體系的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1DNA提取結(jié)果 通過紫外分光光度計檢測，所提取的DNA OD260/OD280的比值為1.70～1.90，說明DNA純度比較高，進一步通過0.8%的瓊脂糖電泳檢測(圖1)，得到清晰、無降解的條帶，說明DNA完整性較好，可用于ISSR-PCR擴增反應(yīng)。

圖1 CTAB法提取的垂穗披堿草基因組DNA

2.2正交試驗的直觀分析 垂穗披堿草正交試驗的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2，正交試驗的結(jié)果不盡相同，原因可能是其組合與最佳組合組分相差較大。1～16組合擴增出的條帶分別為：0、0；4、1；6、1；1、2；8、8；8、9；9、10；10、10；2、0；9、9；10、10；7、9；4、0；8、8；8、7；6、4?？梢钥闯鎏幚?、6、7、8、10、11、14、15擴增條帶較多，而6、7、11、15主帶更為清晰明顯，因此這4個處理在垂穗披堿草中擴增效果最好。

從表5均值分析和表6的極差分析可知，各因素對垂穗披堿草ISSR-PCR反應(yīng)的影響程度從大到小依次為：TaqDNA聚合酶、Mg2+、引物、dNTPs、模板DNA。

圖2 正交試驗PCR電泳產(chǎn)物(引物UBC822)

表5 因素水平均值分析

2.3方差分析 直觀分析法比較簡單易懂，只需對結(jié)果作少量計算，就可以得到最佳配合比和因素影響程度，但直觀分析法不能正確估計試驗過程中誤差的大小，不能說明某因素水平所對應(yīng)的差異究竟是因素水平引起的還是試驗誤差引起的，但是方差分析能彌補這個不足，本試驗用SAS 8.0對試驗結(jié)果進行方差分析。

各因素對垂穗披堿草ISSR-PCR反應(yīng)的影響程度從大到小依次為：TaqDNA聚合酶、Mg2+、引物、dNTPs、模板DNA，結(jié)果與極差分析相同(表7)。

方差分析的結(jié)果表明，模板DNA濃度、dNTPs對結(jié)果的影響未達到顯著水平；引物濃度對結(jié)果的影響達到了顯著水平，而TaqDNA聚合酶、Mg2+對結(jié)果的影響都達到了極顯著水平，所以有必要對TaqDNA聚合酶用量、Mg2+、引物濃度進行水平間的多重比較。

2.4各因素對ISSR-PCR擴增的影響

2.4.1TaqDNA聚合酶濃度對ISSR-PCR擴增的影響 TaqDNA聚合酶濃度在PCR中的用量受到反應(yīng)體積、酶活性、酶耐熱性等因素的制約，TaqDNA聚合酶用量過多會引起非特異性反應(yīng)，在凝膠上出現(xiàn)較深的背景，影響檢測結(jié)果，而且還會增加成本；TaqDNA聚合酶濃度過低，合成產(chǎn)物的量會減少，也會影響試驗結(jié)果。極差分析和方差分析發(fā)現(xiàn)，本試驗條件下TaqDNA聚合酶用量對試驗結(jié)果影響最大，與謝運海等[16]的研究結(jié)果相似。當TaqDNA聚合酶用量為1.0 U時，垂穗披堿草擴增效果最好，高于或者低于此用量，擴增條帶數(shù)變少(圖3)。從圖2可知，TaqDNA聚合酶為1.0 U時，條帶最清晰，主帶最明顯，帶數(shù)更多。經(jīng)多重比較分析(圖3)，TaqDNA聚合酶酶量為1.0 U時，與0.5、1.5、2.0 U 3個水平間差異均達到顯著水平。故本試驗條件下，TaqDNA聚合酶的最適用量為1.0 U。

表6 因素水平極差分析

表7 正交試驗方差分析

圖3 不同TaqDNA聚合酶量下DNA條帶數(shù)的均值

2.4.2Mg2+濃度對ISSR-PCR擴增的影響 TaqDNA聚合酶是Mg2+依賴性酶，對Mg2+濃度較為敏感，Mg2+濃度除影響酶活性外，還影響引物退火、模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度、引物二聚體的形成等[10]，所以Mg2+的濃度對PCR產(chǎn)物的特異性和產(chǎn)量影響明顯。過量的Mg2+會導(dǎo)致酶催化非特異性產(chǎn)物的擴增，而Mg2+濃度過低，又使酶的催化活性降低[17]。Mg2+濃度為1.0 mmol/L時擴增條帶數(shù)最少，高于此濃度時，條帶數(shù)明顯增多，濃度為2.0 mmol/L時條帶數(shù)最多(圖4)。由圖2可知，當Mg2+濃度為1.0 mmol/L時(1、5、9、13號泳道)，只有1/4的泳道條帶數(shù)較明顯、清晰。多重比較表明(圖4)，Mg2+濃度為1.0 mmol/L時，DNA條帶數(shù)顯著低于其他3個水平，而其他3個水平間差異不顯著。所以確定的Mg2+最適濃度為2.0 mmol/L。

圖4 Mg2+與條帶均值關(guān)系

2.4.3引物濃度對ISSR-PCR擴增的影響 ISSR擴增條帶數(shù)與引物濃度密切相關(guān)，引物濃度過低時，PCR產(chǎn)物量降低，引物濃度過高又會促進引物的錯誤引導(dǎo)，導(dǎo)致非特異性擴增，還會增加引物二聚體的形成[18]，非特異性產(chǎn)物和引物二聚體又可作為PCR反應(yīng)的底物，與靶序列競爭DNA聚合酶和dNTPs底物，從而使靶序列的擴增量減少[17]。當引物濃度為0.20 μmol/L時，擴增條帶數(shù)最少，低于或高于此濃度，擴增條帶數(shù)逐漸增加(圖5)。多重分析表明，引物濃度為0.25 μmol/L時，與其他3個水平均有顯著差異，且相對于其他水平，條帶也更為清晰(圖2)，故確定引物濃度為0.25 μmol/L。

圖5 引物濃度與條帶均值關(guān)系

2.4.4dNTPs濃度對ISSR-PCR擴增的影響 dNTPs濃度直接影響PCR擴增，當dNTPs濃度較低時，產(chǎn)生的條帶較少且弱，當dNTPs濃度過低時，其與TaqDNA聚合酶競爭Mg2+，從而降低TaqDNA聚合酶活性，影響PCR結(jié)果。dNTPs在0.15、0.20和0.25 mmol/L水平上差異不顯著，三者顯著高于0.30 mmol/L(圖6)，dNTPs 濃度為0.25 mmol/L時擴增條帶最清晰(圖2)，主帶最明顯，當dNTPs 濃度為0.25 mmol/L時擴增條帶最多。故該試驗采用的最適dNTPs 濃度為0.25 mmol/L。

圖6 dNTPs濃度與條帶均值關(guān)系

2.4.5模板DNA濃度對ISSR-PCR擴增的影響 模板DNA是ISSR擴增的基礎(chǔ)，主要從純度和反應(yīng)量產(chǎn)生影響，模板量過低，引物不能有效配對，產(chǎn)物量小，模板量過高則過早消耗掉引物，使退火發(fā)生在模板DNA間或PCR間，反應(yīng)終止[19]。試驗所選的4個水平的模板DNA濃度對PCR擴增結(jié)果影響差異不顯著(圖7)，與白錦軍等[19]結(jié)果不同，但與桂騰琴等[20]的研究結(jié)果相似，這可能是與模板DNA的純度有關(guān)。本試驗選取30～120 ng作為最佳模板質(zhì)量。

圖7 模板DNA與條帶均值關(guān)系

2.5退火溫度的確定 退火溫度決定著PCR的特異性。引物復(fù)性所需的溫度和時間取決于引物堿基組成、長度，降低退火溫度能保證模板與引物穩(wěn)定結(jié)合，但也可能導(dǎo)致產(chǎn)生錯誤擴增，一定范圍內(nèi)提高退火溫度可減少引物和模板之間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。根據(jù)正交試驗結(jié)果所得的最佳反應(yīng)體系，即TaqDNA聚合酶1.0 U，Mg2+2.0 mmol/L，模板DNA 30～120 ng，dNTPs 0.25 mmol/L，引物0.25 μmol/L在DNAEngine(PTC-200)PCR儀上進行退火溫度梯度試驗。由圖8可知，退火溫度較低時(47.7、49.2℃)，擴增條帶較弱，較彌散，條帶不清晰，擴增條帶特異性差，54.4℃時條帶最清晰，條帶數(shù)最多，主帶最明顯，隨著退火溫度的升高擴增的條帶數(shù)減少，到60.6℃幾乎沒有條帶，由此確定引物UBC822的最適退火溫度為54.4℃。通過對篩選出的11條擴增穩(wěn)定、多態(tài)性較好的引物進行了退火溫度梯度試驗，并確定了各引物的最佳退火溫度(表8)。

表8 試驗所選引物序列和退火溫度

圖8 溫度梯度PCR電泳圖

2.6最佳循環(huán)數(shù)和最適延伸時間的確定 根據(jù)正交試驗結(jié)果所得的最佳反應(yīng)體系，在最適退火溫度下，對PCR循環(huán)數(shù)進行梯度試驗，設(shè)置6個梯度。循環(huán)數(shù)較少時(35次)條帶不清晰，擴增不穩(wěn)定，37次時擴增條帶逐漸變清晰，但其主帶不明顯，循環(huán)數(shù)為41次時擴增效果最好，循環(huán)數(shù)大于41次時，擴增結(jié)果也不理想(圖9)。因此，41次作為引物UBC822的最佳循環(huán)次數(shù)。

圖9 最佳循環(huán)數(shù)的選擇

延伸時間的長短取決于待擴增模板序列的長度和濃度，以及延伸溫度的高低，在條件一定的情況下，延伸時間過短無法完成擴增導(dǎo)致擴增產(chǎn)量低，延伸時間太長會引起非特異性條帶的產(chǎn)生[17]。利用最佳反應(yīng)體系、最適退火溫度和最佳循環(huán)數(shù)，對PCR延伸時間進行梯度試驗，設(shè)置3個梯度。延伸時間為60 s時擴增條帶彌散，延伸時間為120 s時主帶不明顯也帶有一定的彌散現(xiàn)象，延伸時間為90 s時擴增效果最好(圖10)，故確定最適延伸時間為90 s。

2.7最佳反應(yīng)體系的驗證 運用正交設(shè)計所獲得的最佳反應(yīng)體系和程序隨機選用引物UBC825對17份不同的野生垂穗披堿草進行ISSR擴增，結(jié)果顯示，擴增條帶清晰，穩(wěn)定性好、多態(tài)性豐富(圖11)，表明該反應(yīng)體系和反應(yīng)程序穩(wěn)定性、重復(fù)性較好，適合于垂穗披堿草進行ISSR-PCR反應(yīng)。

圖10 最適延伸時間的選擇

圖11 最佳反應(yīng)體系的驗證

3 結(jié)論

本研究利用正交優(yōu)化設(shè)計建立了垂穗披堿草的ISSR-PCR反應(yīng)體系，試驗過程中對影響PCR擴增的TaqDNA聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物等因素進行了正交優(yōu)化，對PCR程序進行了梯度試驗，通過對擴增結(jié)果的量化分析得到了穩(wěn)定性好的反應(yīng)體系和擴增程序，即：TaqDNA聚合酶1.0 U，Mg2+2.0 mmol/L，模板DNA 30～120 ng，dNTPs 0.25 mmol/L，引物0.25 μmol/L；PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性1 min，51℃退火1 min(視不同引物而定)，72℃延伸1.5 min，共41個循環(huán)，72℃后延伸10 min，擴增完后4℃保存。

正交設(shè)計相對于其他設(shè)計方法節(jié)省了人力和財力，對結(jié)果的分析更均衡更完善，但對擴增效果的評價方面帶有一定的主觀性，不能很好地評估各因素之間的交互作用，還需更客觀的評價標準。此外，在正交優(yōu)化中所設(shè)置的濃度梯度較大，可采用與單因素試驗或細調(diào)性正交試驗[21]相結(jié)合的方法進一步確定最優(yōu)體系。盡管如此，本研究所建立的較為穩(wěn)定的ISSR-PCR反應(yīng)體系，可以為垂穗披堿草的研究提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)，同時為披堿草屬內(nèi)其他種在品種鑒定、遺傳多樣性研究、親緣關(guān)系分析等領(lǐng)域提供一定的依據(jù)。

[1] 陳默君,賈慎修.中國飼用植物[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：119-120.

[2] 周永紅，鄭有良，楊俊良，等.10種披堿草屬植物的RAPD分析及其系統(tǒng)學(xué)意義[J].植物分類學(xué)報，1999，37(5)：425-432.

[3] 祁娟.披堿草屬植物野生種質(zhì)資源生態(tài)適應(yīng)性研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[4] 陳智華，苗佳敏，鐘金城，等.野生垂穗披堿草種質(zhì)遺傳多樣性的SRAP研究[J].草業(yè)學(xué)報，2009，18(5)：192-200.

[5] 馬嘯，周永紅，于海清，等.野生垂穗披堿草種質(zhì)的醇溶蛋白遺傳多樣性分析[J].遺傳，2006，28(6)：699-706.

[6] 嚴學(xué)兵.披堿草屬植物遺傳多樣性研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 2005.

[7] 劉蓉，張衛(wèi)國，江小雷，等.垂穗披堿草群落退化演替的植被特性及其與土壤性狀的相關(guān)性研究[J].草業(yè)科學(xué)，2010，27(10)：96-103.

[8] 李治強.紫花苜蓿與垂穗披堿草混播防治褐斑病試驗[J].草業(yè)科學(xué)，2009，26(10)：177-180.

[9] Zietkiewicz E,Rafalske A,Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat(SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics,1994,20：176-183.

[10] 周延清.DNA分子標記技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[11] 馬嘯.老芒麥野生種質(zhì)資源的遺傳多樣性及群體遺傳結(jié)構(gòu)研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[12] 李永祥，袁慶華.披堿草屬12個物種遺傳多樣性的ISSR和SSR比較分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38(8)：1522-1527.

[13] 蓋鈞益.試驗統(tǒng)計方法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000：28-288.

[14] 李榮華，夏巖石，劉順枝，等.改進的CTAB提取植物DNA方法[J].實驗室研究與探索，2009，28(9)：14-16.

[15] 董如何，肖必華，方永水.正交設(shè)計的理論分析方法及應(yīng)用[J].安徽建筑工業(yè)學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版)，2004，12(6)：103-106.

[16] 謝運海，夏德安，姜靜，等.利用正交設(shè)計優(yōu)化水曲柳ISSR-PCR反應(yīng)體系[J].分子植物育種，2005，3(3)：445-450.

[17] 屈伸，劉志國.分子生物學(xué)實驗技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007：80-86.

[18] Jackson J A，Hemken R W.Calcium and cation-anion balance effects on feed intake,body weight gain,and hunoral response of dairy calves[J].Journal of Dairy Science,1994，77：1430-1436.

[19] 白錦軍，魏安智，王佳，等.仁用杏ISSR分析體系的正交優(yōu)化[J].分子植物育種，2009 (6)：1237-1244.

[20] 桂騰琴，孫敏，喬愛民，等.正交優(yōu)化果梅ISSR反應(yīng)體系[J].果樹學(xué)報，2009，26(1)：108-112.

[21] 陳志宏，黃琳凱，張新全，等.正交優(yōu)化法建立沙打旺ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34(13)：2980-2982.