黑龍江小麥麥胚多肽的制備及抗氧化功能研究Ⅱ.超濾法精制抗氧化麥胚多肽工藝條件的優(yōu)化

張洪微，楊銘鐸，吳瑩瑩，張 玲，賈慶勝

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)中式快餐研究發(fā)展中心博士后科研基地，黑龍江 哈爾濱 150076；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；4.黑龍江生物科技職業(yè)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150025；5.黑龍江北大荒豐緣麥業(yè)集團(tuán)有限公司，黑龍江 哈爾濱 150076)

黑龍江小麥麥胚多肽的制備及抗氧化功能研究Ⅱ.超濾法精制抗氧化麥胚多肽工藝條件的優(yōu)化

張洪微1,2,3，楊銘鐸1,2,*，吳瑩瑩1,2，張 玲4，賈慶勝5

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)中式快餐研究發(fā)展中心博士后科研基地，黑龍江 哈爾濱 150076；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；4.黑龍江生物科技職業(yè)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150025；5.黑龍江北大荒豐緣麥業(yè)集團(tuán)有限公司，黑龍江 哈爾濱 150076)

采用3ku和6ku的超濾膜對(duì)麥胚多肽進(jìn)行分級(jí)分離，考察3種分離產(chǎn)物對(duì)DPPH·的清除能力，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量在3ku以下的麥胚多肽對(duì)DPPH·的清除率可達(dá)75.32%，高于其他分離產(chǎn)物。采用響應(yīng)面試驗(yàn)方法對(duì)麥胚多肽的超濾條件進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果表明，最佳超濾條件為超濾壓力0.08MPa、超濾時(shí)間23min、超濾pH6.83、溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，此時(shí)膜通量為4.85L/(m2·h)。所得分子質(zhì)量小于3ku的麥胚多肽在質(zhì)量分?jǐn)?shù)11%時(shí)，其DPPH·清除率為78.93%。超濾法精制的麥胚多肽具有良好的DPPH·的清除能力。

麥胚多肽；DPPH·清除作用；超濾法

小麥胚芽因含有豐富的蛋白質(zhì)、油脂、碳水化合物、維生素等人體需要的營(yíng)養(yǎng)素及谷胱甘肽、黃酮類物質(zhì)和二十八烷醇等生理活性物質(zhì)而被營(yíng)養(yǎng)學(xué)家譽(yù)為“人類天然營(yíng)養(yǎng)寶庫(kù)和人類的生命資源”[1-2]。小麥胚芽中的蛋白質(zhì)含量高達(dá)30%，而且氨基酸比例合理，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源[3]。麥胚蛋白在酶的作用下多肽鏈被打斷，釋放各種肽類化合物，使其功能性質(zhì)得到改善，并具有一定的生物活性。有研究表明[4]，小麥蛋白經(jīng)過(guò)水解后的多肽具有抗氧化活性，多肽的抗氧化活性還同分子質(zhì)量有關(guān)[5-6]。

超濾技術(shù)是在0.05～0.1MPa的靜壓差推動(dòng)下，截留蛋白質(zhì)、酶等相對(duì)分子質(zhì)量大于500u的大分子及膠體，形成濃縮液，達(dá)到溶液的凈化、分離及濃縮目的[7]。采用超濾技術(shù)對(duì)酶解后的麥胚多肽進(jìn)行分級(jí)分離，可以得到具有較高抗氧化活性的多肽產(chǎn)品[8]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)麥胚蛋白的酶解產(chǎn)物進(jìn)行超濾，得到具有較高DPPH·清除能力的麥胚多肽，并采用響應(yīng)面分析方法對(duì)超濾條件進(jìn)行優(yōu)化，為麥胚多肽的生產(chǎn)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥胚芽 黑龍江北大荒豐源麥業(yè)；堿性蛋白酶Alcalase F G、木瓜蛋白酶 諾維信酶制劑公司；DPPH· (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼) 日本W(wǎng)ako公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3、6ku圓片平板聚醚砜超濾膜、MSC300型杯式超濾器 上海摩速科學(xué)器材有限公司；R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申勝生物技術(shù)有限公司；ZDO-2型真空冷凍干燥箱 寧夏亞麻技術(shù)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 麥胚多肽的制備工藝流程

小麥胚芽→粉碎→過(guò)100目篩→脫脂→堿提(pH 10.0)→酸沉(pH4.0) →離心→棄上清液→冷凍干燥→麥胚蛋白粉→酶解→麥胚蛋白酶解物→超濾→冷凍干燥→麥胚多肽

1.3.2 清除DPPH·能力的測(cè)定

取一定濃度的樣品1mL，加入1×10-4mol/L DPPH·無(wú)水乙醇溶液1mL，混均后在室溫避光保存30min，在517nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定吸光度，空白組以等體積無(wú)水乙醇溶液代替DPPH·溶液，對(duì)照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液，并以等體積蒸餾水和無(wú)水乙醇混合液空白調(diào)零，所有測(cè)定值均為3次結(jié)果的平均值，清除率計(jì)算[9]公式如下：

式中：A0為對(duì)照組吸光度；Ai為樣品組吸光度；Aj為空白組吸光度。

1.3.3 膜通量的確定式中：V為透過(guò)液的體積/L；S為膜的有效面積/ m2；t為運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間/h；L為膜通量/(L/(m2·h))。1.4試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 超濾膜的選擇

將麥胚蛋白酶解物依次通過(guò)6ku和3ku的超濾膜，將麥胚蛋白酶解物分級(jí)為＜3、3～6、＞6ku，將分級(jí)后的麥胚多肽水溶液進(jìn)行冷凍干燥，測(cè)其對(duì)DPPH·清除效果，選擇抗氧化效果最好的組分進(jìn)行超濾條件的確定。

1.4.2 超濾條件的優(yōu)化

1.4.2.1 單因素試驗(yàn)

超濾時(shí)膜通量的大小主要受超濾壓力、超濾時(shí)間、pH值和溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，因此選擇以上4個(gè)因素進(jìn)行超濾條件優(yōu)化的單因素試驗(yàn)，試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.4.2.2 響應(yīng)曲面法對(duì)超濾條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)超濾條件進(jìn)行優(yōu)化，選取超濾壓力、超濾時(shí)間、pH值、溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)4個(gè)因素為自變量，以膜通量為響應(yīng)值，因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)曲面分析因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in the response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾膜的選擇結(jié)果分析

圖1 不同分子質(zhì)量范圍的麥胚多肽對(duì)DPPH·清除率的影響Fig.1 DPPH free radical scavenging rates of wheat germ peptides with different molecular weights

由圖1可知，經(jīng)過(guò)分級(jí)后的麥胚多肽，其清除DPPH·的能力有所不同。隨著麥胚多肽分子質(zhì)量的降低，其清除DPPH·的能力逐步提高，當(dāng)分子質(zhì)量在3ku以下時(shí)，其清除能力達(dá)到75.32%，比6ku以上的麥胚多肽清除能力提高了17.74%。這是因?yàn)榻?jīng)過(guò)3ku膜超濾處理的麥胚多肽，除去了大部分的大分子蛋白，使得其疏水性氨基酸含量大大增加，而這些疏水氨基酸對(duì)體外抗氧化有著很好的效果。此結(jié)論與大豆多肽[10]、雞胚多肽[11]、雞骨膠原蛋白肽[12]結(jié)論相同。

2.2 超濾條件優(yōu)化的結(jié)果分析

2.2.1 超濾壓力對(duì)膜通量的影響

圖2 超濾壓力對(duì)膜通量的影響Fig.2 Effect of pressure on membrane flux

由圖2可以看出，隨著超濾壓力的增加，膜通量呈上升趨勢(shì)，超濾壓力由0.05MPa上升到0.07MPa過(guò)程中，膜通量上升迅速，而由0.07MPa上升到0.09MPa時(shí)，膜通量趨于平穩(wěn)。這是因?yàn)椋瑸V壓力增大的初期，隨著超濾壓力的增加，膜兩側(cè)的壓力逐步加大，使得膜通量迅速增加；當(dāng)超濾壓力繼續(xù)增加時(shí)，會(huì)很快造成濃差極化現(xiàn)象，而當(dāng)壓力過(guò)大時(shí)，反而會(huì)造成組分中物質(zhì)的沉積，造成膜通量下降[13]。因此，超濾壓力的選擇不宜過(guò)大，本試驗(yàn)中，選擇0.07MPa作為單因素試驗(yàn)中的最佳超濾壓力。

2.2.2 超濾時(shí)間對(duì)膜通量的影響

圖3 超濾時(shí)間對(duì)膜通量的影響Fig.3 Effect of time on membrane flux

由圖3可以看出，隨著超濾時(shí)間的增加，膜通量呈下降趨勢(shì)，在20～30min內(nèi)，膜通量下降緩慢，在40～50min時(shí)，膜通量下降迅速。這是因?yàn)?，?dāng)超濾時(shí)間增加時(shí)，造成溶液中組分沉積，濃差極化現(xiàn)象嚴(yán)重，因此，選擇適當(dāng)?shù)墓ぷ髦芷?，可以有效地防止膜通量下降，本試?yàn)選擇30min作為一個(gè)工作周期。

2.2.3 超濾pH值對(duì)膜通量的影響

麥胚蛋白在pH4時(shí)達(dá)到等電點(diǎn)，在等電點(diǎn)時(shí)，未被酶解的蛋白從溶液中沉淀出來(lái)，會(huì)造成超濾膜的堵塞，膜通量下降，隨著pH值向中性偏移，溶液中的麥胚蛋白不再析出，膜通量上升，而當(dāng)pH值過(guò)高時(shí)，堿性環(huán)境會(huì)造成蛋白的變性[14]，溶液黏度增加，反而不利于超濾的進(jìn)行。因此，選擇pH7作為超濾單因素試驗(yàn)中的最佳pH值。

圖4 pH值對(duì)膜通量的影響Fig.4 Effect of pH on membrane flux

2.2.4 溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)膜通量的影響

圖5 溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)膜通量的影響Fig.5 Effect of wheat germ hydrolysate concentration on membrane flux

由圖5可以看出，隨著溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，超濾的膜通量逐漸下降，這是因?yàn)槿芤嘿|(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，超濾時(shí)會(huì)造成過(guò)多的組分沉積在超濾膜上，影響超濾效果。但是，過(guò)小的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，會(huì)造成超濾過(guò)程中的實(shí)際膜效能降低[15]，增加后期冷凍干燥的工作量，因此超濾單因素試驗(yàn)中的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%。

2.2.5 響應(yīng)曲面法對(duì)超濾條件的優(yōu)化

2.2.5.1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(見(jiàn)表3)

2.2.5.2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果分析

應(yīng)用Design expert 7.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到回歸方程為：

Y=4.7-0.078A＋0.017B＋0.1C+2.5×10-3D-0.028AB-0.1AC-0.03AD-0.02BC＋0.068BD＋0.06CD＋0.02A2-0.051B2-0.13C2-0.013D2

對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，得到結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，模型項(xiàng)、A、AC影響顯著，C、C2影響極顯著，失擬項(xiàng)不顯著。說(shuō)明模型的擬合性良好，可以用于模型分析。決定系數(shù)和校正決定系數(shù)分別為0.7765和0.5531，說(shuō)明該模型的擬合性良好，可以用于模型分析。本模型的信噪比為7.539，說(shuō)明該模型可以用于生產(chǎn)應(yīng)用當(dāng)中。

表3 麥胚蛋白酶解物超濾條件優(yōu)化響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

由于AC影響顯著，作響應(yīng)面圖見(jiàn)圖6。由圖6可以看出，隨著超濾壓力的增大，超濾膜通量呈逐漸增加的趨勢(shì)，在超濾壓力達(dá)到0.08MPa時(shí)，膜通量達(dá)到4.72L/(m2·h)；而超濾膜通量隨pH值的變化先增大后減小，這是因?yàn)辂溑叩鞍酌附馕镌谒嵝原h(huán)境中，由于接近其等電點(diǎn)，會(huì)造成沉積物析出，而當(dāng)其處于堿性環(huán)境中時(shí)，又會(huì)造成蛋白的變性。因此，選擇中性的pH值超濾效果最好。

通過(guò)對(duì)回歸方程的分析，得到超濾條件的優(yōu)化結(jié)果為超濾壓力0.08MPa、超濾時(shí)間22.68min、超濾pH6.83、溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.00%。

表4 響應(yīng)曲面方差分析表Table 4 Variance analysis of the established regression model

圖6 超濾壓力與超濾pH值交互作用的等高線與響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of pressure and pH on membrane flux

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，但在超濾時(shí)間的選擇上考慮實(shí)驗(yàn)的可操作性，將最佳的超濾時(shí)間修正為23min。在此條件下，膜通量可達(dá)到4.85L/(m2·h)，較為理想。同時(shí)對(duì)超濾精制后的麥胚多肽進(jìn)行DPPH·清除能力的測(cè)定，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，精制后的麥胚多肽其DPPH·清除能力較高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)11%的麥胚多肽溶液對(duì)DPPH·清除率達(dá)到78.93%，說(shuō)明麥胚多肽有較強(qiáng)的清除DPPH·的能力。

3 結(jié) 論

3.1 分級(jí)分離后的麥胚多肽，其抗氧化性能有所不同，其中分子質(zhì)量在3ku以下的麥胚多肽組分抗氧化活性最高，其DPPH·清除能力可達(dá)到75.32%。

3.2 通過(guò)單因素及響應(yīng)曲面法對(duì)3ku以下的麥胚多肽超濾條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳超濾條件為超濾壓力0.08MPa、超濾時(shí)間23min、超濾pH6.83、溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，此時(shí)膜通量為4.85L/(m2·h)。

3.3 精制后的麥胚多肽具有較好的DPPH·清除能力，麥胚多肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11%時(shí)，其DPPH·清除率達(dá)78.93%。

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Preparation and Antioxidant Activity of Germ Peptides from Helongjiang Wheat Ⅱ∶ Optimization of Ultra-filtration Separation of Wheat Germ Peptides

ZHANG Hong-wei1,2,3，YANG Ming-duo1,2,*，WU Ying-ying1,2，ZHANG Ling4，JIA Qing-sheng5
(1. Institute of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China；2. Postdoctoral Research Base of the Chinese Fast Food Research and Development Center, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China；3. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China；4. Heilongjiang Vocational College of Biology Scienece and Technology, Harbin 150025, China；5. Heilongjiang Beidahuang Fengyuan Wheat Industry Group Co. Ltd., Harbin 150076, China)

Wheat germ protein hydrolysate prepared by enzymatic hydrolysis was separated with ultra-filtration membranes with a molecular weight cutoff (MWCO) of 3 ku and 6 ku, respectively. Four ultra-filtration parameters such as pressure, time, pH and sample concentration were optimized by response surface methodology to be 0.08 MPa, 23 min, 6.83 and 2%, respectively. Under these conditions, the ultra-filtration membrane flux of was 4.85 L/(m2·h). The obtained fraction of less than 3 ku in molecular weight exhibited a DPPH free radical scavenging rate of 78.93% at the concentration of 11%.

wheat germ peptide；DPPH free radical scavenging activity；ultra-filtration

TS210.9

A

1002-6630(2011)14-0171-05

2010-12-17

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C201041)

張洪微(1975—)，女，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：fcwei_2004@126.com

*通信作者：楊銘鐸(1956—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)閭鹘y(tǒng)食品工業(yè)化。E-mail：yangmingduo5663@163.com