高效液相色譜-熒光檢測法測定蜂蜜中的果糖、葡萄糖和麥芽糖

張其安，王 娟，戴建曉，杜培粉，王素輕，盧德梅，楊少波,*

(1.山東華康蜂業(yè)有限公司，山東 日照 276500；2.山東水利職業(yè)學院，山東 日照 276826；3.咸陽健康蜂業(yè)有限公司，陜西 咸陽 713400)

高效液相色譜-熒光檢測法測定蜂蜜中的果糖、葡萄糖和麥芽糖

張其安1，王 娟2，戴建曉1，杜培粉1，王素輕1，盧德梅3，楊少波1,*

(1.山東華康蜂業(yè)有限公司，山東 日照 276500；2.山東水利職業(yè)學院，山東 日照 276826；3.咸陽健康蜂業(yè)有限公司，陜西 咸陽 713400)

建立反相離子對色譜法同時測定蜂蜜中果糖、葡萄糖、麥芽糖含量的方法。樣品經對氨基苯甲酸衍生化后，采用ODS柱，以0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(20mmol/L四丁基硫酸氫銨，pH2.5)∶乙腈=95∶5為流動相，熒光檢測器檢測，外標法定量。結果表明，果糖、葡萄糖、麥芽糖的檢出限分別為210、96、240μg/kg，線性范圍分別為130～140、52～98、154～98mg/kg，在其線性范圍內相關系數(shù)r≥0.9988；該方法加標回收率在98.2%～101.2%之間，RSD在3.4%～5.4%之間。該方法靈敏、結果可靠。

高效液相色譜；熒光檢測；蜂蜜；還原糖

蜂蜜是蜜蜂采集植物花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物結合后，在巢脾內轉化、脫水貯存至成熟而成的天然甜物質[1-2]。蜂蜜中含有超過180種活性物質，其主要成分為果糖和葡萄糖及4%～5%的低聚果糖，另外蜂蜜中還含有豐富的氨基酸、維生素、活性酶、類黃酮、多酚類、類胡蘿卜素等活性物質及多種礦物質[3]。蜂蜜具有抗氧化、抗菌、加速創(chuàng)傷修復、增強免疫力等多種生理活性[4-6]，因而蜂蜜不但被作為一種直接有效的營養(yǎng)補充來源，而且被應用于治療肝炎、癌癥、傷口感染、便秘以及改善胃腸功能、提高機體免疫力等[7-8]。近年來，蜂蜜作為一種藥食兩用的天然保健品，受到越來越多的青睞。

我國是養(yǎng)蜂及蜂蜜出口大國，20世紀90年代我國蜂蜜出口量占世界年貿易量的40%。然而，蜂蜜是一種極易摻假的食品，近年來由于摻假等質量問題，使我國蜂蜜產品的信譽越來越低，出口量逐年下降[9]。為了規(guī)范蜂蜜市場，國家標準化委員會于2005年10月26日發(fā)布了GB 18796—2005《蜂蜜》國家強制性標準，并規(guī)定自2006年3月1日起實施。GB 18796—2005規(guī)定蜂蜜中果糖和葡萄糖含量應大于等于60%，而歐盟、日本等蜂蜜進口國還規(guī)定了蜂蜜中還原糖含量及果葡比等參數(shù)。因此，必須建立一系列蜂蜜中還原糖的測定方法，既可以保護消費者利益，又對蜂蜜生產企業(yè)的生產具有指導意義。

目前，關于蜂蜜中還原糖測定的方法主要有滴定法、旋光法、薄層色譜、高效液相色譜法、離子色譜脈沖安培法、氣質聯(lián)用法、高效毛細管電泳法、核磁共振法等[10-17]。但是傳統(tǒng)的滴定法、薄層色譜法、旋光度法操作繁瑣而且準確度不高。高效液相色譜法采用示差折光檢測器或蒸發(fā)光散射檢測器，靈敏度較低，且受溫度、流動相影響大。離子色譜脈沖安培法用于單糖、二糖、小分子寡糖的測定，具有靈敏度高、選擇性好、不用衍生、操作簡便等有點。但是，離子色譜對試劑、進樣樣品要求較高，樣品前處理步驟要求嚴格，而且需要專門的離子色譜和脈沖安培檢測器[18]。毛細管電泳、氣質聯(lián)用、核磁共振等方法設備昂貴，不易在國內中小型蜂蜜生產企業(yè)內普及。本實驗采用柱前衍生高效液相色譜-熒光檢測法，旨在建立一種同時測定蜂蜜中的果糖、葡萄糖、麥芽糖的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

對氨基苯甲酸 上海化學試劑供應站試劑廠；氰基硼氫化鈉 德國Emerck公司； 果糖(99%)、葡萄糖(99%)、麥芽糖(99%) 上?；瘜W試劑公司；甲醇、乙腈、冰乙酸(均為色譜純) 天津市光復精細化工研究所；磷酸氫二鈉、磷酸(均為分析純) 天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心；超純水。

LC-10AVP Plus高效液相色譜儀(配有RF-10AXL熒光檢測器、DGU-20A3在線脫氣機、LC-20ATXL泵、CTO-10ASVP柱溫箱、手動進樣器、LC-Solution數(shù)據處理軟件)和AUY220型分析天平 日本島津公司；DZKW-D-2型恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.2 標準液的配制

1.2.1 果糖、葡萄糖、麥芽糖標準液的配制

分別準確稱取3g果糖、2.4g葡萄糖、0.24g麥芽糖標準物質置于3個100mL的容量瓶中，用超純水定容，4℃保存。

1.2.2 混合標準液的配制

分別吸取1.2.1節(jié)中各單糖標準液1mL，充分混勻，待衍生化。

1.3 樣品處理

準確稱取2g蜂蜜置于100mL的燒杯中，加入30mL超純水，使樣品完全溶解，轉移至100mL的容量瓶中，然后用超純水潤洗定容，混勻，待衍生化。

1.4 衍生劑的配制

稱取0.7g對氨基苯甲酸、1g冰乙酸、0.1g氰基硼氫化鈉于具塞試管中，以10mL甲醇定容，4℃保存。

1.5 衍生化反應條件

取50μL單糖標準液、混合標準液或樣品溶液，加入100μL衍生劑，充分混勻，于70℃恒溫水浴中衍生[19]，60min后，冷卻定容至2mL。分別稀釋不同的倍數(shù)，以0.45μm的微孔濾膜過濾后進樣。

1.6 色譜條件

色譜柱：Sinochrom ODS-BP柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(20mmol/L四丁基硫酸氫銨，pH2.5)∶乙腈=95∶5；流速：0.5mL/min；熒光檢測波長：λex為313nm，λex為358nm；柱溫：30℃；進樣量：20μL。

2 結果與分析

2.1 衍生化反應條件優(yōu)化結果

圖1 衍生物的峰面積隨反應時間的變化曲線Fig.1 Effect of reaction time on derivative peak area

從圖1可以看出，在50min內葡萄糖和麥芽糖衍生化產物產率達到最高，50min后葡萄糖和麥芽糖衍生化產物產率開始降低，而果糖衍生化產物產率在60min后達到最高值。由此可見果糖對衍生化試劑對氨基苯甲酸反應不敏感，產物產率較低，為了提高果糖衍生化產物產率，從而增加果糖測定的靈敏度。采用文獻[19]中衍生化反應溫度，本研究選擇反應溫度70℃，反應時間60min為衍生化反應條件。

2.2 色譜條件優(yōu)化結果

由于單糖為高度親水性化合物，在C18柱上保留時間較短且不能得到較好的分離，高效液相色譜法分析糖類物質時一般需專用的氨基柱。通過衍生化可以改變單糖的局部結構，有助于單糖在C18柱上保留和分離。實驗中考察了Sinochrom ODS-BP柱、SHIMADZU VP-ODS C18柱(4.6mm×150mm，5μm)為分離色譜柱對蜂蜜中單糖的分離效果。結果表明，Sinochrom ODS-BP柱能將3中還原糖很好的分離，這可能是因為Sinochrom ODSBP柱更適合分離極性較強的化合物，因此選擇Sinochrom ODS-BP柱為該方法的分離色譜柱。

圖2 磷酸鹽緩沖液-乙腈(90∶10)作為流動相時混合標樣(A)和蜂蜜中還原糖(B)色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of mixed monosaccharide standards and reducing sugars in honey using 0.1 mol/L phosphate buffer solution-acetonitrile at 90∶10 as mobile phase

圖3 磷酸鹽緩沖液-乙腈(95∶5)作為流動相時混合標樣(A)和蜂蜜中還原糖(B)色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of mixed monosaccharide standards and reducing sugars in honey using 0.1 mol/L phosphate buffer solution-acetonitrile at 95∶5 as mobile phase

以含有20mmol/L四丁基硫酸氫銨的磷酸鹽緩沖液-乙腈體系作為流動相，考察不同配比磷酸鹽緩沖液-乙腈體系對單糖的分離情況。以磷酸鹽緩沖液-乙腈(90∶10)作為流動相時混合標樣中各單糖組分得到較好的分離，但是蜂蜜中果糖色譜峰前有一雜峰，且分離效果不好，結果見圖2。因此，適當減少流動相中乙腈的含量，以磷酸鹽緩沖液(20mmol/L四丁基硫酸氫銨，pH2.5)-乙腈(95∶5)作為流動相時混合標樣和蜂蜜中各單糖組分均得到較好的分離，且峰形對稱，結果見圖3。

2.3 方法的線性范圍和檢出限

將1.5節(jié)中衍生化反應后單糖的混合標準液稀釋成一些列不同質量濃度的標準工作液，在以上優(yōu)化后的高效液相條件下分析。以標準峰面積對標準工作液的濃度進行線性回歸，得到3種單糖的線性回歸方程和相關系數(shù)。同時，使用標準溶液逐步稀釋法測得3種單糖的檢出限(以RSN=3計)，結果見表1。

表1 回歸方程、相關系數(shù)、檢出限及線性范圍Table 1 Regression equations, correlation coefficients, detection limits and linear ranges

2.4 方法的精密度和回收率實驗

在上述優(yōu)化好的色譜條件下，分別在蜂蜜測試樣品中添加標樣，進行添加回收率和精密度實驗，其測試回收率均在98.2%～101.2%之間，重復測定7次，計算各組分相對標準偏差(RSD)在3.4%～5.4%之間(表2)。結果表明，該方法精密度較高，能夠滿足實際樣品的測定。

表2 方法加標回收率和精密度實驗(n=7)Table 2 Spike recoveries and precise RSDs of fructose, glucose, and maltose in honey (n=7)

2.5 蜂蜜中單糖含量測定結果

圖4 洋槐蜜中還原糖色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of reducing sugars in robinia honey

以優(yōu)化條件對5種蜂蜜樣品進行分析，分離效果較好，結果如圖4(以洋槐蜜為例)所示。將樣品測定的單糖峰面積代入上述回歸方程，計算出各種單糖的含量，結果見表3。

表3 蜂蜜樣品中糖含量的測定結果Table 3 Fructose, glucose, and maltose contents in real honey samples

3 結 論

熒光檢測器具有靈敏度高、選擇性高、線性范圍寬、受外界條件影響小等優(yōu)點，因而在藥物和生化分析中起著不可替代的作用。但是單糖本身并不帶有熒光基團，而且在C18柱上保留時間短，不容易分離。對單糖進行衍生化處理后，可以使其帶上熒光基團，便于熒光檢測。同時，經過衍生化改變了單糖分子的局部結構，使其在C18柱上獲得較好的保留和分離。本實驗以對氨基苯甲酸為衍生化試劑對蜂蜜中的還原糖進行衍生化處理后，以0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(20mmol/L四丁基硫酸氫銨，pH2.5)∶乙腈=95∶5為流動相，熒光檢測器測定蜂蜜中的3種還原糖，檢出限分別為果糖210μg/kg、葡萄糖96μg/kg、麥芽糖240μg/kg。本方法的局限性：由于對氨基苯甲酸只能與還原糖反應，因此本方法不能測定蜂蜜中的蔗糖等非還原糖。

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Determination of Fructose, Glucose, and Maltose in Honey by HPLC-FLD

ZHANG Qi-an1，WANG Juan2，DAI Jian-xiao1，DU Pei-fen1，WANG Su-qing1，LU De-mei3，YANG Shao-bo1,*
(1. Shandong Huakang Honey Products Co. Ltd., Rizhao 276500, China；2. Shandong Vocational College of Water Conservancy, Rizhao 276826, China；3. Xianyang Jiankang Honey Products Co. Ltd., Xianyang 713400, China )

An ion-pair reversed-phase high performance liquid chromatographic method was developed to simultaneous determine fructose, glucose, and maltose in honey using p-aminobenzoic acid (p-AMBA) for pre-column derivatization. The chromatographic separation was achieved on an ODS column using a mobile phase made up of 0.1 mol/L phosphate buffer solution (20 mmol/L tetrabutylammoniumhydrogen sulfate, pH 2.5) and acetonitrile (95∶5, V/V). The analytes were detected using a fluorescence detector and quantified by external standard method. The results showed that the detection limits of fructose, glucose and maltose were 210, 96μg/kg and 240μg/kg, respectively, and the linear ranges were 130 -140, 52-98 mg/kg, and 154-98 mg/kg (r ＞ 0.9988). The spike recoveries ranged from 98.2% to 101.2%， with RSDs between 3.4% and 5.4%.

high performance liquid chromatographic；fluorescence detection；honey；reducing sugars

R155.5

A

1002-6630(2011)14-0249-04

2010-09-09

張其安(1966—)，男，會計師，本科，研究方向為蜂產品加工與檢測。E-mail：sdhkfy@126.com

*通信作者：楊少波(1978—)，男，助理工程師，碩士，研究方向為蜂產品加工與檢測。E-mail：shboyg@126.com