藥食兩用類食品中赭曲霉毒素A的高效液相色譜-熒光檢測方法

傅武勝，邱文倩，鄭奎城，呂華東，郭 斌，嚴(yán)小波

(1.福建省疾病預(yù)防控制中心，福建 福州 350001；2.福建醫(yī)科大學(xué) 福建省疾病預(yù)防控制中心教學(xué)基地，福建 福州350001；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350001；4.福州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福建 福州 350001)

藥食兩用類食品中赭曲霉毒素A的高效液相色譜-熒光檢測方法

傅武勝1,2，邱文倩1，鄭奎城1，呂華東1，郭 斌3，嚴(yán)小波4

(1.福建省疾病預(yù)防控制中心，福建 福州 350001；2.福建醫(yī)科大學(xué) 福建省疾病預(yù)防控制中心教學(xué)基地，福建 福州350001；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350001；4.福州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福建 福州 350001)

目的：采用免疫親和凈化和高效液相色譜技術(shù)，建立淀粉、糖類藥食兩用食品中赭曲霉毒素A的測定方法。方法：樣品粉末經(jīng)甲醇-水(8∶2，V/V)渦旋、超聲及振搖提取，提取液以磷酸鹽緩沖液稀釋后，用商品免疫親和柱凈化，含有赭曲霉毒素A的甲醇洗脫液用高效液相色譜技術(shù)分析，C18反相色譜柱分離，熒光檢測器測定。結(jié)果：赭曲霉毒素A的最低檢出濃度為1.0μg/kg(RSN＝3)；在0.5～100ng/mL范圍內(nèi)，峰面積與質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系(r=0.9995)；以不含赭曲霉毒素A的太子參、蓮子、薏苡、麥冬和龍眼肉為加標(biāo)基質(zhì)，加標(biāo)水平為1～8μg/kg時(shí)，平均回收率在81.8%～107%之間，RSD為1.66%～15.0%(n＝3)。結(jié)論：免疫親和柱能和高效液相色譜-熒光檢測相結(jié)合取得較為滿意的結(jié)果，準(zhǔn)確度高、精密度好，滿足歐盟對食品飼料中OTA檢測方法的要求，適合于淀粉、糖類藥食兩用食品中赭曲霉毒素A的測定。

藥食兩用食品；赭曲霉毒素A；免疫親和凈化；高效液相色譜法

赭曲霉毒素(ochratoxins)是曲霉屬和青霉屬的某些菌種產(chǎn)生的一種具有致癌、致畸、免疫抑制和肝腎毒性的有機(jī)酸類真菌毒素，有A、B、C、D四種化合物[1]，國際上較為關(guān)注的是赭曲霉毒素A(OTA)，其在霉變谷物、飼料中較為常見。WHO/FAO食品添加劑和污染物聯(lián)合專家委員會制定了OTA的暫定每周最大耐受劑量[2]，歐盟評估了人群膳食暴露水平[3]。國際食品法典已制定了食品中OTA的限量和良好操作規(guī)范[2]，以降低OTA的健康危害。我國規(guī)定谷類和豆類OTA的限量為5μg/kg[4]，歐盟對OTA的控制更為嚴(yán)格、具體[3]，2010年歐盟增加了香辛調(diào)味料和甘草中OTA的限量，分別不能超過15～30μg/kg和20μg/kg[5]。甘草、橙花、咖啡、茶藨子、酸橙花、黑胡椒、胡荽、姜黃、干姜和人參等植物和/或芳香調(diào)味料OTA的污染較為普遍[6-10]，有些，如甘草污染水平較高，50%的樣品含量超過5.3μg/kg[9-10]。含甘草提取物的食品也檢出0.34～2.96μg/kg的OTA，兒童每周由此攝入的OTA相當(dāng)于PTWI的8.94%[11]。

香辛調(diào)味料、植物藥中OTA的檢測方法有薄層色譜法[12]、酶聯(lián)免疫吸附法[8,13]、熒光光度法[14]、高效液相色譜法[10,15-17]和液相色譜/質(zhì)譜法[10,14]等。薄層色譜法法為半定量方法，靈敏度較低，重復(fù)性差，如未經(jīng)過充分凈化，雜質(zhì)干擾比較嚴(yán)重。ELISA法被用于初篩，成本低，但用于檢測中樣品時(shí)假陽性率較高。液相色譜/質(zhì)譜法是一種確證性方法，檢出限低至0.3μg/kg，但儀器也十分昂貴，分析成本高。高效液相色譜法結(jié)合熒光檢測器，靈敏度較高，定量結(jié)果準(zhǔn)確。生物樣品中OTA含量低(μg/kg級)，基體復(fù)雜，干擾較多，因此IAC(immunoaffinity column)凈化效果更好。雖有免疫親合柱上顯色快速篩查法[18]用于色素含量較高的甘草、姜、肉豆蔻、黑胡椒、白胡椒和辣椒，以及IAC-TLC法[12]用于測定綠咖啡中OTA測定的報(bào)道，但應(yīng)用最普遍、效果最好的還是IAC-HPLC法，已經(jīng)有較為成熟的商品IAC柱出售，國外有用于植物藥的報(bào)道[10,17]。此外，也有商品多功能親和柱，可用于同時(shí)凈化、檢測人參、干姜和松果菊中的OTA和黃曲霉毒素[7,16]。國內(nèi)應(yīng)用該法于香辛料和藤蔓水果干中OTA的檢測[14]，但未見用于藥食兩用類食品樣品。因此本實(shí)驗(yàn)從福建省主產(chǎn)的淀粉或糖含量較高的6種藥食兩用食品入手，發(fā)展基于IAC凈化的HPLC-熒光檢測器檢測技術(shù)，為開展污染調(diào)查提供良好的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

太子參、蓮子、薏苡、澤瀉、麥冬、龍眼干樣品在2009年6月至2010年3月間，購于福州市各大連鎖藥店、超市和福建省部分產(chǎn)地，樣品經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院吳錦忠教授鑒定為太子參(Pseudostellaria heterophylla (M iq.) Pax ex Pax et Hoffm)、澤瀉(Alisma orientale (Sam.) Juz.[A.plantago-aquatica L.var. orientale Sam.])、蓮子(Nelumbo Nucifera Gaertn.)、薏苡(Coiχ lacroyma-jobi L. var. ma-yuen (Roman.) Stapf)、麥冬(Ophiopogonjaponicus (Thunb.) Ker-Gawl.)、龍眼肉(Euphoria longan (Lour.) Steud.)。樣品處理方法：用高速粉碎機(jī)粉碎1～2min，每份樣品粉碎完后，去除參與粉末，再用75%乙醇清洗和消毒粉碎機(jī)腔體和機(jī)蓋；用電吹風(fēng)吹干表面后，再粉碎下一個(gè)樣品；樣品粉末冷卻至室溫后，裝入密封袋中于冰箱冷藏。

免疫親和柱為德國LC Tech公司的OtaCLEANTM(3mL/支)和美國Vicam公司的Afla TestR-P(1mL/支)、50mL聚丙烯塑料離心管(美國Corning公司)、0.45μm水系微孔濾膜(直徑50mm)、玻璃微纖維濾紙(直徑110mm)。

甲醇(色譜純) 美國Fisher公司；冰乙酸、乙醇(均為優(yōu)級純)；氯化鈉、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀(均為分析純)；赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)液(OTA，50μg/mL) 美國Supelco公司。

OTA標(biāo)準(zhǔn)儲備液(10μg/mL)的配制：移取OTA標(biāo)準(zhǔn)液(50μg/mL)，移入10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，渦旋混勻，-20℃放置備用，進(jìn)一步配制為100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2)的配制：稱取10.03g Na2HPO4溶于140mL超純水中，再稱取1.932g KH2PO4溶于70mL超純水中，將兩種溶液混合后加入8.5g NaCl，充分溶解混勻，得到母液，母液稀釋5倍后供使用。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AD型高效液相色譜儀(配RF-10AXL熒光檢測器) 日本Shimadzu公司；DFY-80型搖擺式高速萬能粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司；CP225D型電子天平(感量0.1mg) 瑞士Sartorius公司；YP202N型電子天平(感量0.01g) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；G-560E漩渦混合器 美國Scientific Industries公司；18型高速離心機(jī)、Allegra 25R型臺式高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司；溶劑抽濾裝置 河北津騰公司；KQ-500B型、KQ3200型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；固相萃取裝置 美國Phenomenex公司；振蕩器 美國IKA公司；精密移液槍(100、200、1000μL)美國Gilson公司；5mL移液槍 上海大龍公司；超純水機(jī) 北京歷元電子儀器公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確移取適量OTA標(biāo)準(zhǔn)使用液(100ng/mL)，加入甲醇，渦旋30s，配成質(zhì)量濃度為0.500、1.250、2.500、5.000、10.000ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，進(jìn)行HPLC分析。以峰面積(Y)對OTA的濃度(X，ng/mL)以最小二乘法作線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 液相色譜分析條件

采用自動(dòng)進(jìn)樣方式，將適宜濃度的OTA溶液注入高效液相色譜儀。色譜條件如下：色譜柱：Shiseido C18柱(4.6mm×150mm，3μm)；柱溫：35℃；流動(dòng)相：甲醇-2%冰乙酸(65∶35，V/V)；流速：0.8mL/min；熒光檢測器：激發(fā)波長(λex)為333nm，發(fā)射波長為(λem) 447nm；進(jìn)樣量：20μL。

1.4 樣品制備和OTA測定

1.4.1 樣品的提取和凈化

提?。簻?zhǔn)確稱取5.0g樣品粉末于50mL塑料離心管中，加入1g NaCl和20mL 80%甲醇，渦旋5s，使充分分散于溶劑中，超聲30min，再以300r/min的速度振蕩30min。結(jié)束后，以5000r/min速度離心10min，準(zhǔn)確移取2.0mL上清液加入磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至25mL，充分搖勻，用玻璃微纖維濾紙過濾，收集濾液。

IAC凈化：取上述濾液10mL加到預(yù)先平衡至室溫的IAC柱，調(diào)節(jié)流速，使不超過1.0mL/min。待流干后，先用10mL PBS(pH7.2)淋洗，后用10mL超純水淋洗。淋洗結(jié)束后，用吸耳球把柱內(nèi)殘余溶液盡可能擠掉，再用1.5mL甲醇分兩次充分洗脫，用2.0mL塑料離心管收集洗脫液。洗脫液充分渦旋混勻后12000r/min離心3min，輕輕倒出上層液體于進(jìn)樣瓶中，供HPLC分析，外標(biāo)法定量。進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)時(shí)，取5mL純水代替粉末樣品，其余步驟相同。

1.4.2 樣品溶液的測定

HPLC分析條件同1.3.2節(jié)。如所測溶液濃度超過標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，應(yīng)將樣品溶液稀釋后再行測定。如超過IAC柱的最大親和容量，則應(yīng)降低取樣量或者擴(kuò)大稀釋倍數(shù)后，重新用IAC制備樣品溶液，再進(jìn)行HPLC測定。

1.5 結(jié)果的計(jì)算

外標(biāo)法定量，以保留時(shí)間定性，峰面積定量，則樣品中OTA的濃度X/(μg/kg)為：

式中：C為待測溶液中OTA的質(zhì)量濃度/(ng/mL)；F為稀釋倍數(shù)(F=25)；m為稱樣質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜和樣品凈化條件的優(yōu)化

2.1.1 OTA測定條件

[1]的方法，采用的流動(dòng)相為甲醇-2%冰乙酸(65∶35，V/V)，激發(fā)波長(λem)為333nm，發(fā)射波長(λem)=447nm，以Shiseido C18柱反相色譜柱作為分離柱，所得OTA色譜峰形對稱，基線平穩(wěn)(圖1)；經(jīng)IAC柱凈化的樣品在此條件下，也得到較為理想的色譜峰。對HPLC儀器重復(fù)性進(jìn)行了考察，對質(zhì)量濃度10ng/mL的OTA溶液連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，所得峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.748%，說明儀器性能穩(wěn)定，自動(dòng)進(jìn)樣的精密度高。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)和太子參樣品(B)中OTA的色譜圖Fig.1 Chromatograms of OTA in standard solution and in prince ginseng root extract

2.1.2 OTA的穩(wěn)定性(再現(xiàn)性)實(shí)驗(yàn)

取同一OTA標(biāo)準(zhǔn)液系列，連續(xù)進(jìn)樣6d。OTA的日間RSD在1.70%～5.16%之間(表1)，這說明儀器的再現(xiàn)性較好，也說明OTA化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定，可放置至少6d。

表1 OTA溶液的穩(wěn)定性(再現(xiàn)性)實(shí)驗(yàn)Table 1 Stability evaluation of OTA solution during 6-day storage

2.1.3 樣品凈化條件的優(yōu)化

2.1.3.1 親和速度(流速)的優(yōu)化

IAC柱裝填有能與OTA特異性結(jié)合的抗體材料，這種特異性免疫親和作用通常需要保持一定的時(shí)間，因此親和過程中待測溶液流經(jīng)IAC柱的速度可能影響到抗體對目標(biāo)物OTA的親和作用。實(shí)驗(yàn)比較了流速對兩個(gè)品牌IAC柱的影響。由于LC tech公司的IAC柱內(nèi)徑較Vicam公司IAC柱大，容量多達(dá)3mL，因此通過固相萃取裝置的調(diào)節(jié)閥來控制流速；Vicam公司IAC柱內(nèi)徑較小，流速較慢，因此采用加壓的方式來提高流速。發(fā)現(xiàn)流速過快(大于1mL/min)時(shí)，兩種柱的回收率為67.0%～70.9%，明顯低于較低流速(小于1mL/min)時(shí)的回收率(88.4%～95.0%)。因此在上樣時(shí)要控制流速，如果工作效率允許，盡量用較低的流速。

3.1.3.2 淋洗液對回收率的影響

不同的淋洗液對雜質(zhì)的淋洗效果可能會有差異，從而影響IAC柱對OTA的特異性免疫親和，同時(shí)也可能由于淋洗不充分而導(dǎo)致檢測時(shí)有雜質(zhì)干擾。比較純水(10＋10)mL、PBS緩沖液(10＋10)mL、PBS 10mL＋純水10mL三種淋洗液對麥冬和龍眼肉中OTA測定的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，淋洗液對OTA的回收率無明顯影響，回收率在85.5%～95.0%之間(表2)?？紤]到基質(zhì)的復(fù)雜多樣，為保證有較好的淋洗效果，保護(hù)抗體的穩(wěn)定性，又減少緩沖液中鹽類進(jìn)入色譜柱，通常緩沖液對抗體的保護(hù)能力更強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)選擇了PBS 10mL＋純水10mL這種3種淋洗方式。

2.2 方法學(xué)指標(biāo)的考察

2.2.1 最低檢出限

表2 淋洗液對樣品OTA回收率的影響Table 2 Effect of selected eluents on recovery rate of OTA

將0.5ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液(OTA)稀釋后再進(jìn)樣，得到信噪比為3時(shí)的OTA溶液濃度為0.20ng/mL。以5g樣品計(jì)算，按照前述的稀釋步驟，計(jì)算最低檢出限為1.0μg/kg，滿足了樣品中OTA檢測和污染控制的要求。

2.2.2 線性范圍

在0.5～100ng/mL范圍內(nèi)，峰面積Y與OTA濃度X/ (ng/mL)呈線性關(guān)系，得到回歸方程Y=9946.5X-8664.2，相關(guān)系數(shù)r=0.9995。在實(shí)際樣品檢測時(shí)，考慮到OTA標(biāo)準(zhǔn)液較為昂貴，同時(shí)減少操作中OTA的職業(yè)暴露風(fēng)險(xiǎn)，采用了0.5～10ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，折算為實(shí)際樣品含量，相當(dāng)于2.5～50μg/kg，完全滿足日常檢測的要求。

2.2.3 準(zhǔn)確度

選擇不含OTA的6種淀粉糖類藥食兩種食品樣品(太子參、蓮子、薏苡、澤瀉、麥冬和龍眼)，以此作為加標(biāo)基質(zhì)，加入不同體積的OTA(C=100ng/mL)標(biāo)準(zhǔn)溶液，使加標(biāo)水平在1～8μg/kg之間，放置30min后，進(jìn)行不同水平的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，按照1.4節(jié)的樣品制備和測定方法進(jìn)行操作，結(jié)果見表3。在此水平下，除了澤瀉4.0μg/kg加標(biāo)水平回收率略高(116%)外，其余各類基質(zhì)中OTA的平均回收率均在81.8%～107%之間，較為理想，滿足歐盟對食品中OTA檢測的質(zhì)量控制要求[19](1～10μg/kg時(shí)，回收率在70%～110%)，說明所用的兩種商品IAC柱性能穩(wěn)定、效果較好，操作過程容易控制。

表3 某些基質(zhì)中OTA的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝3)Table 3 Mean recovery rates and RSDs for OTA in spiked food matrices (n＝3)

2.2.4 精密度

為進(jìn)一步考察樣品制備直至HPLC分析整個(gè)過程中，OTA結(jié)果的一致性，對6種藥食兩用食品進(jìn)行了重復(fù)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)(n＝3)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)的RSD在1.66%～15.0%之間，精密度較為理想，優(yōu)于歐盟對食品OTA檢測的室內(nèi)重復(fù)性RSD控制要求[19](1～10μg/kg時(shí)，RSDr＜20%)。也說明商品OTA柱性能穩(wěn)定，操作過程容易控制。

3 結(jié) 論

3.1 建立了6種淀粉糖類藥食兩用食品中赭曲霉毒素A的免疫親和凈化-液相色譜熒光檢測方法，最低檢出限為1.0μg/kg，平均回收率在81.8%～107%之間，RSD為1.66%～15.0%，各項(xiàng)性能指標(biāo)滿足該類食品中OTA檢測和污染控制的要求。

3.2 免疫親和柱凈化效果理想，操作簡便快速，易于掌握，重復(fù)性和再現(xiàn)性好，值得進(jìn)一步推廣用于其他品種食品和中赭曲霉毒素A的檢測。

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Determination of Ochratoxin A in Edible and Medicinal Foods by HPLC-Fluorescence Technology

FU Wu-sheng1,2，QIU Wen-qian1，ZHENG Kui-cheng1，LU Hua-dong1，GUO Bin3，YAN Xiao-bo4
(1. Fujian Center for Disease Prevention and Control, Fuzhou 350001, China；2. Teaching Base of Fujian Center for Disease Prevention and Control for Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China；3. Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350001, China；4. College of Chemistry and Chemical Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350001, China)

Objective∶ To develop a method to determine ochratoxin A (OTA) in edible and medicinal foods using immunoaffinity column purification and high performance liquid chromatography (HPLC). Methods∶ Powdered samples were extracted with methanol-water (8∶2, V/V) sequentially by vortex mixing, ultrasonic treatment and shaking. The resulting extract was diluted with phosphate buffer solution, filtrated and cleaned up on immunoaffinity column (IAC) containing antibodies specific to OTA . The pooled eluate was separated on a C18 column (4.6 mm × 150 mm, 3μm) and detected by fluorescence detector (FLD). Results∶The limit of detection (LOD, RSN = 3) was 1.0μg/kg for OTA. An excellent linear relationship between peak area and OTA concentration was observed in the OTA concentration range of 0.5-100 ng/mL with correlation coefficient of 0.9995. The average recovery rates for OTA in prince ginseng root, lotus seed, coix seed, Radiχ Ophiopgonis, dried longan pulp and oriental water plantain rhizome spiked with OTA standard at a level of 1-8μg/kg were varied from 81.8%-107% with a relative standard deviation (RSD) of 1.66%-15.0% (n = 3). Conclusion∶ This method has the advantages of satisfactory results and high accuracy and precision and can meet the requirements of the Europe Union for the determination of OTA in food and feed, thus providing a suitable method for determining OTA edible and medicinal foods rich in starch or sugar.

foods；ochratoxin A；immunoaffinity cleanup；high performance liquid chromatography

O656.31

A

1002-6630(2011)14-0298-05

2010-08-19

福建省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2008Y0029)

傅武勝(1971—)，男，副主任技師，博士，研究方向?yàn)槲廴疚锘瘜W(xué)與風(fēng)險(xiǎn)評估。E-mail：fwsfqm@126.com