楊 華，莊陳豐

(1.浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 3 15100；2.寧波市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點實驗室，浙江 寧波 315100)

響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取龍須菜多糖工藝及其抗氧化活性研究

楊 華1,2，莊陳豐1

(1.浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 3 15100；2.寧波市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點實驗室，浙江 寧波 315100)

研究優(yōu)化龍須菜多糖的提取工藝條件及其抗氧化活性，并對龍須菜微波輔助提取工藝進行響應(yīng)面法優(yōu)化。結(jié)果表明微波提取的最佳條件為功率495W、提取時間17min、液料比100:1，在此條件下龍須菜多糖提取率為33.11%?？寡趸瘜嶒烇@示龍須菜能有效清除DPPH自由基。

龍須菜；響應(yīng)面法；多糖；微波輔助提??；抗氧化

龍須菜(Gracilaria lamaneiformis)又名海發(fā)菜，屬于紅藻門、真紅藻綱、杉藻目、江蘺科，在我國沿海地區(qū)，如廣東、福建、臺灣等都有大量種植。據(jù)報道，龍須菜本身能吸收無機氮和無機磷，因此能通過吸附海水中的氮、磷和二氧化碳，從而達到緩解赤潮，降低海水富營養(yǎng)化的作用[1-2]。除了有凈化水域的功用，它也是一種重要的經(jīng)濟海藻，可作為沿海鮑魚養(yǎng)殖的優(yōu)質(zhì)飼料，同時也是可供人類食用的天然海洋蔬菜，因為它不僅含高膳食纖維、高蛋白，而且脂肪含量少，富含礦物質(zhì)和維生素。早在明代，李時珍就在《本草綱目》中就提到過龍須菜具有軟堅化痰、清熱利水的功效。因此，具有藥用、食用和經(jīng)濟性的龍須菜，就成為了繼海帶、紫菜和裙帶菜之后，我國第4種人工栽培海藻。龍須菜多糖等眾多海藻多糖，都是一類高活性物質(zhì)。龍須菜多糖的功能包括：抑制腫瘤，可減少癌細胞的擴散；調(diào)節(jié)免疫活性，提高人體抵抗力；幫助降低血脂，預(yù)防高血壓等心腦血管疾??；抗凝血、抗菌、抗病毒等多種生理活性和藥理活性[3-4]。

目前，龍須菜多糖的提取主要有熱水浸提、冷水浸提、酶解法浸提、微波和超聲輔助提取等[5]，但是由于龍須菜藻體較硬，進行多糖提取前先要對其進行機械方法破壞其細胞壁，這樣就大大提高了多糖的溶出率，然后再采取合適的方法提取多糖。本實驗利用響應(yīng)面軟件對龍須菜多糖微波提取條件進行優(yōu)化，并對提取出的多糖進行抗氧化性研究，以期為龍須菜多糖的產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

龍須菜購于溫州洞頭縣。

濃硫酸、蒽酮、葡萄糖、乙醇、T CA和D P P H寧波奧博試劑有限公司。

RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、WFZ UV-2000分光光度計、移液器、中型機械WP750微波爐、高速離心機等。

1.2 方法

1.2.1 龍須菜粗多糖的提取

采用微波輔助提取龍須菜多糖：選取料水比1:40～1:130(g/mL)、提取功率128～872W、微波提取時間4～36min進行單因素試驗，由單因素結(jié)果確定響應(yīng)面試驗的分析因素和水平，采用響應(yīng)面法得到最佳的微波提取的方案，每組試驗加入5g龍須菜粉末作為提取原料，利用微波對龍須菜進行提取前，先在90℃熱水中萃取2 h，再進行微波提取。

1.2.2 多糖總含量測定

采用蒽酮-硫酸比色法[2-3]，根據(jù)蒽酮-硫酸比色法測得葡萄糖質(zhì)量濃度與620nm處吸光度的關(guān)系，繪制標準曲線圖，得出標準曲線回歸方程為A＝0.009C，R2＝0.9901。將所測得的吸光度代入標準曲線方程，計算樣品溶液中的多糖質(zhì)量濃度(C)/(mg/L)。

1.2.3 多糖抗氧化性的測定

DPPH法[6-7]：取3只10mL試管，向1號管內(nèi)準確移取2mL的給出濃度多糖溶液，再向其中加入2mL的DPPH使用液，室溫避光靜置30min后在517nm處測定其吸光度(Ai)。向2號管準確移取2mL多糖溶液，再向其中加入2mL 50%乙醇，室溫避光靜置30min后在517nm處測定其吸光度(Aj)。向3號管準確移取2mL DPPH使用液后加入2mL的蒸餾水，室溫避光靜置30min后在517nm處測定其吸光度(Ac)。試驗以50%乙醇溶液作為參比溶液，且每種樣品均做3個平行試驗。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert 7.0 軟件和EXCEL進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 微波功率對龍須菜多糖提取率的影響

在固定提取時間20min、液料比(mL/g)70:1的條件下，不同微波功率對多糖得率的影響如圖1所示。

圖1 微波功率對龍須菜多糖提取率的影響Fig.1 Effect of microwave power on polysaccharide yield

由圖1可得，不同微波功率對龍須菜多糖提取率的影響很顯著，隨著微波功率的不斷增大，多糖提取率也隨之升高，當(dāng)微波功率達到500W時，多糖提取率達到最高點，提取率為30.2%。當(dāng)微波功率達到872W時，多糖的提取率明顯下降，這可能是多糖被微波分解所致，原因有待進一步研究。

2.1.2 提取時間對龍須菜多糖提取率的影響

提取時間延長能夠提高多糖得率。在固定微波功率500W、液料比70:1條件下，不同提取時間對多糖得率的影響如圖2所示。

圖2 提取時間對龍須菜多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction duration on polysaccharide yield

由圖2可知，隨著提取時間的增加，龍須菜多糖的提取率也隨之升高，在4～12min，提取率的變化比較明顯，而當(dāng)微波時間達到20min時，多糖提取率迅速增加，達到最大值，提取率為29.3%。而當(dāng)微波時間達到24min時，多糖的提取率顯著下降。多糖提取率的下降可能由于微波時間過長，多糖和雜質(zhì)相結(jié)合離心除去而造成損失或是微波對多糖有分解的作用。

2.1.3 液料比對龍須菜多糖提取率的影響

在固定微波功率500W、提取時間20min條件下，不同提取液料比對多糖得率的影響如圖3所示。

圖3 液料比對龍須菜多糖提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-to-material ratio on polysaccharide yield

由圖3可得，隨著液料比的增大，多糖得率逐漸增大，當(dāng)液料比在40～70mL/g時，多糖得率上升很快；當(dāng)液料比大于70:1時，增長趨勢趨于緩慢。這是因為對于一定量的龍須菜粉末，溶劑用量的增加可以增加固液接觸面積和質(zhì)量濃度差，有利于擴散速度的提高。當(dāng)料液比繼續(xù)增大，固液質(zhì)量濃度差的增幅逐漸降低，多糖得率的增加也趨于平緩，過多使用提取溶液會造成后續(xù)處理的難度和提高成本，所以最優(yōu)選擇是液料比70:1。

2.2 響應(yīng)面法對微波提取龍須菜多糖工藝的優(yōu)化

表1 微波提取龍須菜多糖響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 1 Experimental design and corresponding results for response surface analysis for optimizing microwave-assisted extraction of polysaccharides from Gracilaria lamaneiformis

根據(jù)單因素試驗確定自變量，分別為功率、微波提取時間、液料比，以龍須菜多糖提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理進行響應(yīng)面試驗，具體見表1。

利用Design Expert 7.0 軟件對設(shè)計表進行多元回歸擬合，得出龍須菜多糖提取率(Y)對功率(A)、微波提取時間(B)、液料比(C)的二次多項回歸模型方程為：Y＝22.00＋6.78A＋1.15B＋3.63C＋0.82AB＋2.97AC＋0.37BC-0.52A2-1.86B2-2.26C2。

回歸方程中各變量對響應(yīng)面值影響的顯著性由F檢驗來判斷，P值越小，則響應(yīng)變量的顯著程度越高。從表2可知，在所有試驗因素中，功率對多糖的提取率高低起到至關(guān)重要的作用。由表2數(shù)據(jù)可看出，試驗因素和響應(yīng)值之間不是簡單的線性關(guān)系，二次項和交互項都和響應(yīng)值有聯(lián)系，由此說明，響應(yīng)面軟件生成的方程具有充分的擬合性，回歸方程的顯著性也越高，另相關(guān)系數(shù)R2為0.9931。R2＝0.8898與R2Adj＝0.9843相差不大，也證明了回歸方程可以很好的表述各自變量與響應(yīng)面值之間的確切關(guān)系，說明該回歸方程能夠確定最佳的多糖提取工藝。

表2 微波輔助提取龍須菜多糖的響應(yīng)面試驗方差分析表Table 2 Variance analysis of the established regression model for polysaccharide yield

從表2可知，上述回歸方程描述各試驗因素與響應(yīng)面值之間的關(guān)系時，其因變量與全部自變量的線性關(guān)系顯著，模型的顯著水平遠遠低于0.05，r＝模型/總量＝562.69/566.59＝0.9931，此時得出的回歸方程模型高度顯著，該試驗方法可靠。當(dāng)顯著水平小于0.05時，它所對應(yīng)的條件對響應(yīng)值的作用越明顯，方程失擬誤差越不明顯，可用響應(yīng)面得出的回歸方程代替試驗真實點對試驗結(jié)果進行分析。從表2的數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出，作用明顯的是A、B、C、A C、B2、C2，對龍須菜多糖提取率影響大小依次為功率、液料比、微波提取時間，即功率對龍須菜多糖提取率的影響最為顯著。

圖4 各兩因素對龍須菜多糖提取率交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots showing the interactive effects of microwave power, extraction duration and liquid-to-material ratio on polysaccharide yield

根據(jù)上述的回歸分析結(jié)果，在響應(yīng)面軟件中生成相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖，以確認功率、液料比、微波提取時間3因素對多糖提取率的影響。圖4直觀地反映了各試驗因素對響應(yīng)值的影響。圖4響應(yīng)面曲線的最高點和等高線上存在所謂的極限值，反映在響應(yīng)面曲面圖和等高線上，就是曲面最高點同時也是等值線中面積最小的橢圓中心點。對三組圖進行分析后得知，功率(A)對龍須菜多糖提取率的影響最為明顯，表現(xiàn)為曲線傾斜率大；而液料比(C)和微波提取時間(B)的曲線表現(xiàn)的相對平緩，說明B、C對響應(yīng)值的影響較小。

2.3 最佳工藝條件的預(yù)測和驗證

根據(jù)響應(yīng)面軟件得出的試驗?zāi)Ｐ停A(yù)測出理論條件下的最優(yōu)工藝條件為功率494.68W、液料比99.87:1、微波提取時間16.39min，相應(yīng)的龍須菜多糖提取率為33.05%。為實際操作的便利，將最優(yōu)值修正為提取溫度495W、液料比100:1、提取時間17min。實際測得的多糖平均得率為33.11%，與理論值的誤差約為0.06%。因此，基于響應(yīng)面法所得的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準確可靠，具有實用價值。

2.4 不同提取工藝條件下龍須菜多糖抗氧化性能研究

選取微波提取的多糖進行抗氧化性能研究，試驗數(shù)據(jù)見表1。從表1可知，14、16、17組所對應(yīng)的清除率明顯比其他組數(shù)高，都達到了50%以上的清除率，而6、7、8、9、10、11、13、15組多糖對DPPH自由基的清除率在30%～50%，最差的組數(shù)，其多糖對DPPH自由基的清除率也在20%左右。對數(shù)據(jù)進行比較分析后得出，清除率高的組數(shù)，其對應(yīng)的多糖提取條件為，在微波功率314～500W、提取時間12～20min、液料比70:1～100:1條件下，多糖提取率都在23%以上。對上述結(jié)果進行分析后得出，隨著多糖濃度的增加，其相應(yīng)的DPPH自由基清除率也增高，說明了龍須菜多糖具有較好的抗氧化活性。

3 結(jié) 論

采用響應(yīng)面軟件優(yōu)化龍須菜多糖的提取工藝后，得出以下微波提取法最佳工藝為提取溫度495W、液料比100:1、提取時間17min，多糖提取率為33.11%。并得到龍須菜多糖得率與微波處理各因素變量的二次方程模型，該模型回歸極顯著，對試驗擬合較好，有一定應(yīng)用價值。對微波提取的多糖的抗氧化性研究結(jié)果表明，對DPPH自由基有一定的清除效果。

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Gracilaria lamaneiformis Polysaccharides: Optimization of Microwave-assisted Extraction by Response Surface Methodology and Antioxidant Properties

YANG Hua1,2，ZHUANG Chen-feng1
(1. Faculty of Biological and Environmental Science, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, China；2. Ningbo Key Laboratory of Agricultural Products Processing Technology, Ningbo 315100, China)

In this study, the microwave-assisted extraction of polysaccharides from Gracilaria lamaneiformis was optimized by response surface methodology (RSM) and the antioxidant properties of extracted polysaccharides were studied. The results showed that the optimum conditions for polysaccharide extraction were microwave power of 495 W, extraction duration of 17 min, and water-to-material ratio of 100:1. Under the optimum conditions, the extraction yield of polysaccharides was 33.05%. Antioxidant analysis showed that polysaccharides from Gracilaria lamaneiformis could effectively remove DPPH free radicals.

Gracilaria lamaneiformis；response surface methodology (RSM)；polysaccharide；microwave-assisted extraction；antioxidant properties

TS254.58；Q539

：A

1002-6630(2011)20-0079-04

2011-05-22

寧波市漁業(yè)局科技專項(甬海200769)

楊華(1978—)，男，講師，碩士，研究方向為水產(chǎn)品加工及貯藏。E-mail：yanghua@zwu.edu.cn