UroVysion熒光原位雜交監(jiān)測膀胱癌復(fù)發(fā)的研究

李連印，姜君儀，劉俊江，李守賓，高雙友

0 引言

膀胱鏡和尿細胞學(xué)檢查是診斷膀胱移行細胞癌應(yīng)用較廣泛的方法。膀胱鏡檢查是一種侵入性檢查，且費用昂貴;而尿細胞學(xué)檢查對膀胱癌檢測靈敏度相對較差［1］。理想的監(jiān)測膀胱癌復(fù)發(fā)的手段不僅應(yīng)具有較高的靈敏性和特異性，且應(yīng)該具有無創(chuàng)性。近年來，有學(xué)者已提出通過檢測尿液來診斷膀胱癌，例如膀胱腫瘤抗原測試、細胞核基質(zhì)蛋白22、膀胱癌特異性核基質(zhì)蛋白4，尿端粒酶等［2-3］。雖然大部分已被證明比細胞學(xué)檢測敏感性高，但特異性仍然較低。熒光標記DNA探針的方法一定程度地解決了這個問題［4-5］。文中前瞻性地檢測后續(xù)治療的膀胱癌患者熒光原位雜交DNA探針(UroVysion原位雜交法)的敏感性和特異性，并將結(jié)果與尿細胞學(xué)比較，以評估其在膀胱癌復(fù)發(fā)檢測中的價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象2008年4月至2010年10月間，我科共收集接受經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切后膀胱尿路上皮癌患者58例，膀胱鏡檢查留取尿液樣本，部分被送往病理實驗室進行常規(guī)細胞學(xué)檢查，另一部分行細胞遺傳學(xué)熒光原位雜交分析。膀胱鏡、細胞學(xué)檢測和熒光原位雜交分析均獨立完成。如發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞或高度可疑的細胞，細胞學(xué)檢測定義為陽性發(fā)現(xiàn)。膀胱鏡檢查中發(fā)現(xiàn)有疑似病灶或腫瘤的患者將被安排做活檢或經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)，并記錄膀胱鏡下發(fā)現(xiàn)的腫瘤大小、位置和數(shù)目，并根據(jù)世界衛(wèi)生組織分級制度，同時依照膀胱癌臨床分期慣例進行分期。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 熒光原位雜交法將20～50ml新鮮尿液以2∶1比例與2%聚乙二醇混合，存放在4℃環(huán)境24 h內(nèi)處理。脫落細胞轉(zhuǎn)速500 r/min離心10 min，離心半徑為7 cm，用甲醇冰醋酸復(fù)合溶液按體積比3∶1固定后再次離心沉淀，將沉淀的細胞用10 μl固定液懸浮，制成切片。熒光原位雜交采用UroVysion膀胱癌DNA探針檢測試劑盒(美國雅培公司)，探針包括3個重復(fù)序列，以識別3號、7號和17號染色體的著絲粒部位。另外還有一特殊位點序列，可與9p21雜交。這些DNA序列分別由SpectrumRed，SpectrumGreen，SpectrumAqua和SpectrumGold熒光標記［5-6］。根據(jù)實驗步驟，將切片在檸檬酸鈉緩沖液溶液中73℃孵育2 min后，用含0.008%胃蛋白酶的0.01 mol/L的鹽酸溶液，37℃消化10 min。在PBS水洗后，用1%甲醛在室溫下固定，并脫水。UroVysion的溶劑滴加在載玻片上的特定區(qū)域，并將其蓋住。Codenaturation 80℃干燥烘箱烘干8 min后，可獲得變性探針和染色體DNA，在潮濕的環(huán)境下37℃放置20h，可完成雜交。雜交后用檸檬酸鈉緩沖液與0.3%乙基苯基聚乙二醇混合液73℃下沖洗2 min，隨后滴加檸檬酸鈉緩沖液與0.3%乙基苯基聚乙二醇混合液，在室溫下放置1 min。空氣干燥后，4′，6二月米基-2-苯基吲哚Ⅱ進行反染色染色，并根據(jù)試劑盒進行結(jié)果分析。雜交面積用×40物鏡檢視掃描細胞學(xué)上的非典型細胞核，例如細胞核增大、不規(guī)則輪廓，并呈片狀。不正常的細胞核指擁有2套DNA基因拷貝數(shù)，或者缺失9p21純合子的信號。不正常的標本指超過16%細胞有多重染色體，或者48%細胞缺失9p21純合子的信號(圖1)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行各數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理。采用多個樣本構(gòu)成比的比較。特異性計算方法=真陰性/(真陰性+假陽性);敏感性計算方法=真陽性/(真陽性+假陰性)。陽性預(yù)測值=真陽性/(真陽性+假陽性);陰性預(yù)測值=真陰性/(真陰性+假陰性)。以P≤0.05為差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 尿路正常上皮細胞和尿路上皮癌細胞的UroVysion熒光原位雜交法檢測結(jié)果Figure 1 Results of UroVysion FISH for bladder cancer and normal uroepithelium

2 結(jié)果

本次研究共納入研究對象58例，男女比例5.33∶1，平均年齡為68歲(67.5±8.4)歲，所有患者平均隨訪時間為(20.4±6.3)個月。41例患者確診為膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)。17例患者經(jīng)尿液細胞學(xué)檢查、UroVysion熒光原位雜交法檢查、膀胱鏡檢查均正常。其中，尿細胞學(xué)檢測18例為陽性(敏感性為43.9%)，熒光原位雜交檢測發(fā)現(xiàn)36例陽性(敏感性為87.8%)，敏感度明顯高于脫落細胞學(xué)檢查結(jié)果見表1。所有UroVysion熒光原位雜交法和尿脫落細胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)膀胱腫瘤患者均經(jīng)膀胱鏡檢查和病理診斷，證實膀胱癌復(fù)發(fā)，故熒光原位雜交和尿脫落細胞學(xué)檢查的特異性均為100%。特別需要指出的是，1例膀胱憩室內(nèi)臨床分期為Ⅰ期但是病理分級為3級的腫瘤復(fù)發(fā)，但細胞學(xué)檢測或熒光原位雜交檢測均陰性。在UroVysion熒光原位雜交法檢測陽性的病例中，17例為G3級腫瘤，12例為G2級腫瘤，7例為G1級腫瘤;相比之下，尿液細胞學(xué)檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，15例為G3級腫瘤，3例為G2級腫瘤，無G1級腫瘤陽性病例(表2)。實驗結(jié)果顯示，UroVysion熒光原位雜交法法比細胞學(xué)檢測更加有效。

表1 UroVysion熒光原位雜交法檢測與尿液脫落細胞學(xué)檢測膀胱癌復(fù)發(fā)結(jié)果(%)Table 1 Specificity and sensitivity of UroVysion FISH and urine cytology for the diagnosis of bladder cancer(%)

表2 UroVysion熒光原位雜交法檢測與細胞學(xué)檢測膀胱癌復(fù)發(fā)結(jié)果(n)Table 2 UroVysion FISH and urine cytology for the diagnosis of bladder cancer of different grades(n)

3 討論

膀胱癌好發(fā)于中老年男性，具有較高的復(fù)發(fā)率，對復(fù)發(fā)的早期發(fā)現(xiàn)，能夠提高患者治療效果和延長患者生存期。目前對膀胱癌術(shù)后的隨訪一般為每隔一段時間進行膀胱鏡檢查及尿液中脫落細胞的細胞學(xué)分析。膀胱鏡檢查是一種有創(chuàng)檢查方式，且費用昂貴［2，7］。而尿液脫落細胞學(xué)檢查特異性約為96%至100%，但對G1、G2、G3腫瘤細胞的敏感性約20%、50%和80%。因此，尿液細胞學(xué)檢測作為檢查方法并不可靠。近年來，微衛(wèi)星技術(shù)已被用來檢測基因組雜合性損失的和不穩(wěn)定病變。測試篩選膀胱癌患者敏感性為100%，特異性為96%［8-10］。然而，這種技術(shù)還需要大量的病例試驗［11］。熒光原位雜交技術(shù)近年來的發(fā)明和應(yīng)用為膀胱癌的早期診斷提供了有效的途徑。熒光原位雜交技術(shù)基本原理是通過標記的DNA探針與細胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交，獲得細胞內(nèi)多條染色體(或染色體片段)或多種基因狀態(tài)的信息。與傳統(tǒng)的放射性標記原位雜交相比，熒光原位雜交技術(shù)具有安全、快速、靈敏度高、檢測信號強、雜交特異性高以及能同時顯示多種顏色等優(yōu)點。

腫瘤生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，實體腫瘤在其生長的初期大量染色體復(fù)制過程中，產(chǎn)生隨機的基因獲得或缺失，這種現(xiàn)象被稱為染色體不穩(wěn)定現(xiàn)象。膀胱癌細胞中常發(fā)生染色體變化，比如常見的染色體拷貝數(shù)的變化、抑癌基因的缺失等，都可能在腫瘤發(fā)生、進展過程中發(fā)揮非常重要的作用。最初，腫瘤細胞的染色體非整倍體研究由流式細胞儀檢測，但限制過多，難應(yīng)用于了臨床。近年來，熒光原位雜交法已被證明是有效檢測細胞間期的細胞染色體非整倍體的工具［12］。最新發(fā)展多色DNA探針大大提高檢測單個細胞中異常染色體對的能力。

研究中發(fā)現(xiàn)，UroVysion熒光原位雜交法檢測膀胱癌的敏感度明顯高于細胞學(xué)檢測的敏感度，這與其他一些國外學(xué)者的研究結(jié)果一致［13］。一些G1和G2級腫瘤尿脫落細胞學(xué)檢查為陰性，但UroVysion熒光原位雜交法結(jié)果則發(fā)現(xiàn)了異常的染色體改變。一些國外學(xué)者還報道，UroVysion熒光原位雜交法對pTis檢測比細胞學(xué)檢測更有優(yōu)勢［14］。因此，UroVysion熒光原位雜交法檢查更適合腫瘤分級較低的患者。但我們的研究中有1例膀胱憩室內(nèi)癌復(fù)發(fā)患者，但細胞學(xué)和UroVysion熒光原位雜交法實驗結(jié)果均為陰性。該患者腫瘤分期G3pT1，因此推測腫瘤負荷低不是導(dǎo)致尿液中的異常細胞缺乏的原因，位于膀胱憩室腫瘤可能阻止腫瘤細胞擴散到尿液。

這項實驗的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，在特異性相同的情況下，UroVysion熒光原位雜交檢測比尿液細胞學(xué)檢查在檢測膀胱癌復(fù)發(fā)時具有更高的靈敏度。因此，UroVysion熒光原位雜交雜交法可成為篩選膀胱癌復(fù)發(fā)的工具之一。

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