酶的固載技術(shù)及納米電化學(xué)酶生物傳感器的研究進展

李文娟，袁 若，柴雅琴

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715）

0 引言

生物傳感器是在化學(xué)傳感器的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，是電化學(xué)分析和生物技術(shù)研究最為活躍的領(lǐng)域之一。其中，納米電化學(xué)酶生物傳感器因其具有靈敏度高、準確度高、選擇性好、檢測限低、價格低廉、穩(wěn)定性好、能在復(fù)雜的體系中進行快速、在線連續(xù)監(jiān)測等優(yōu)點，在生物傳感器領(lǐng)域研究中占有重要的地位[1]。

在酶生物傳感器的研制過程中，酶的固定化方法是一項關(guān)鍵性的步驟。所選用的固定技術(shù)和固載材料的性質(zhì)將直接影響固定化酶的性能，進而影響到傳感器的靈敏度、穩(wěn)定性和選擇性等一系列性能指標。該文旨在介紹近幾年來酶生物傳感器的固定化方法和固載材料的研究現(xiàn)狀，并展望其發(fā)展前景。

1 酶的固定化方法

酶蛋白在固定化的進程中，容易引起酶本身性質(zhì)的改變，從而影響其催化活性和生物性能。究其原因一般有兩種可能：一種是酶本身性質(zhì)的變化，主要是酶活性中心的氨基酸殘基、高級結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)等發(fā)生了變化；另一種是受固定化載體的物理或化學(xué)性質(zhì)的影響，主要體現(xiàn)在固定化酶的周圍，形成了能對底物產(chǎn)生影響的擴散層，以及靜電的相互作用等引起的。所以，要研制出價格低廉、靈敏度高、選擇性好和壽命長的酶電極，選擇合適的固酶方法和載體材料是至關(guān)重要的。目前，較成熟的酶的固定化方法一般有：吸附法、交聯(lián)法、共價鍵合法以及包埋法等。下面，具體來介紹一下每種固定方法。

1.1 吸附法

是將酶、氧化還原蛋白質(zhì)經(jīng)非水溶性載體物理吸附或離子結(jié)合作用使生物組分固定的方法。這些結(jié)合力可能是氫鍵、范德華力或離子鍵等，也可能是多種鍵合形式共同發(fā)揮作用。該固定方法操作簡單、無需化學(xué)試劑、活化和清洗步驟少、對生物活性影響小、酶可以保持較高的生物活性等優(yōu)點；同時還具有工藝簡便及條件溫和，其載體選擇范圍很大，酶失活后可重新活化，載體可以再生[2]。缺點是酶在電極表面吸附的牢固程度與溶液的pH、離子強度、溫度、溶劑性質(zhì)和種類以及酶的濃度有關(guān)。當酶與載體之間吸附作用較弱時，酶易從載體上脫落，影響傳感器的穩(wěn)定性和壽命。同時酶與載體之間的吸附是可逆過程，隨著時間的流逝，解吸附作用會降低傳感器的靈敏度?，F(xiàn)如今，各種各樣的固載材料被用于對酶蛋白分子的吸附，比如碳納米管、水滑石、羥基石灰石、粘土、高嶺土等載體，例如：Rahman等[3]報道了通過吸附作用，將葡萄糖氧化酶（GOD）其捕獲到多壁碳納米管 （MWCNT）修飾的金電極表面，實現(xiàn)了GOD蛋白分子的直接電子傳遞。并且在較低的電位條件下，對葡萄糖顯示出良好的電催化作用。Dmitri Ivnitsk等[4]考察了將膽紅素氧化酶（BOD）吸附固定在碳納米管（CNT）表面的電化學(xué)行為。經(jīng)研究，BOD在碳納米管表面的直接電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)可達1.5 s-1。

1.2 包埋法

是將生物蛋白分子包裹在溶膠-凝膠、聚合物材料以及高分子載體分子中形成三維的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，以實現(xiàn)對生物分子的固載。在這個過程中，蛋白分子只是被包埋，并不參與化學(xué)反應(yīng)。所以固定條件較溫和、生物活性保留較高及聚合膜的孔徑和幾何形狀可以調(diào)控，并且可以固定較高濃度的生物大分子，如酶、抗體等。但是，這種方法將酶包裹在載體內(nèi)部，使得底物在網(wǎng)絡(luò)中的擴散阻力增加，電極的響應(yīng)時間延長，不利于電極的在線檢測和微型化。目前，最常用包埋酶的載體是溶膠-凝膠法，因其具有優(yōu)良的生物兼容性、熱穩(wěn)定性、化學(xué)惰性以及在水中幾乎不溶脹等性質(zhì)，從而吸引了科研界和工業(yè)界的廣泛興趣。例如：Yuan Ruo課題組[5]采用溶膠-凝膠法將葡萄糖氧化酶（GOD）包埋在二維的網(wǎng)狀硅凝膠（MPS）中，由于硅凝膠具有較好的生物相容性，固定后酶的活性高。PengYong等[6]提出了包埋HRP的一種傳感器。首先將二茂鐵硫醇（FcC11SH）和巰基丙酸（MPA）混合，一起自組裝在金電極表面。然后在EDC/NHS化學(xué)的作用下，將HRP交聯(lián)在MPA的殘基上，最后，通過聚合丙烯酰胺單體來包埋HRP分子。該傳感器對過氧化氫有很好的催化作用，并且能夠?qū)崿F(xiàn)對過氧化氫的超低量檢測，可達 0.62 nmol·L-1。

1.3 共價鍵合法

是酶蛋白分子上的官能團和固相支持物表面上的反應(yīng)基團之間形成化學(xué)共價鍵連接，從而使酶固定的方法。到目前為止，通常有兩類情況：一是將基底電極表面活化，再將酶等生物活性分子直接反應(yīng)連接到電極表面；二是將載體有關(guān)基團活化，然后與酶共價反應(yīng)。根據(jù)酶與載體之間的共價結(jié)合形式可以有重氮法、肽鍵法、烷化法等。使用共價鍵合法通常需要使用含有雙功能基團或多功能基團的試劑，如巰基乙胺、半胱胺酸和戊二醛等，將酶蛋白和電極固載基質(zhì)之間形成共價鍵連接，此時該方法也稱交聯(lián)法。例如：Polsky Ronen等[7]將羧基化的疊氮化合物在EDC/NHS的作用下和抗體分子進行偶聯(lián)，然后將復(fù)合物電沉積在電極表面，并通過不同的方法標記的抗原進行反應(yīng)，制備了免疫傳感器。Solanki等[8]首先將碳納米管、硅溶膠和殼聚糖的混合物滴涂在銦錫氧化玻璃電極表面，在戊二醛的交聯(lián)作用下，借助醛基和酶氨基的作用下，實現(xiàn)對膽固醇氧化酶和膽固醇酯酶的成功固載。所研制的傳感器對膽固醇的相應(yīng)時間小于10 s，靈敏度達3.8 A·L·mmol-1，米氏常數(shù)為 0.052 mmol·L-1，可在冰箱中存放10周之久。Li Jinghong等[9]利用聚賴氨酸使碳納米管功能化，然后在EDC活化偶聯(lián)試劑的作用下，將HRP成功固載在電極表面，用于檢測過氧化氫。Marrakchi等[10]采用了先將牛血清白蛋白（BSA）和葡萄糖氧化酶（GOD）混合，然后在戊二醛蒸氣的氛圍中靜置一段時間，在戊二醛的作用下，交聯(lián)和BSA混合的乳糖氧化酶（β-Gal），成功的制備了 GOD-β-Gal的雙酶型生物傳感器。該傳感器可以實現(xiàn)對牛奶中乳糖的定量測定。

由于酶與載體間連接牢固，不易發(fā)生酶脫落，有良好的穩(wěn)定性及重復(fù)使用性。但是，共價鍵合和交聯(lián)過程可能引起免疫分子高級結(jié)構(gòu)變化，破壞部分活性位點，所發(fā)生的劇烈化學(xué)反應(yīng)對酶的存活十分不利。

1.4 層層自組裝法

是一種較年輕的固定方法，通過自發(fā)的化學(xué)吸附（通常是靜電作用）或鍵合作用，在傳感器界面形成二維有序單層膜。若自組裝分子具有兩個或者以上的活性基團，則又可與別的物質(zhì)反應(yīng)，如此反復(fù)，構(gòu)筑同質(zhì)或異質(zhì)多層膜。由于自組裝分子層的有序性、穩(wěn)定性、絕緣性和可調(diào)控性，使通過這種方法所構(gòu)建的傳感器在生物技術(shù)領(lǐng)域中大放異彩。目前，發(fā)展起來的層層自組裝（LBL）技術(shù)主要有以下幾種類型：

1.4.1 通過正負電荷間靜電作用

利用靜電作用對帶電荷的生物大分子，以靜電相互作用力作為推動力進行分子間的交替沉積。 制備多層膜的方法。例如：Liu Baohong課題組[11]將帶正電荷的殼聚糖（chitosan）和帶負電荷的透明質(zhì)酸（HA）交替吸附到聚對苯二甲酸乙二酯（PEI）修飾的芯片表面，利用可控有序的多層膜對胰島素（trypsin）成功的固載。Chen Hongyuan課題組[12]先將普魯士藍（PB）用聚陽離子鄰苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯（PDDA）進行反應(yīng)，形成PDDA保護的PB復(fù)合物 （P-PB），然后利用LBL的方法，和表面帶負電荷葡萄糖氧化酶（GOD）層層交替吸附在聚苯乙烯磺酸鈉（PSS）和PDDA的雙層膜上，所研制的傳感器擁有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

1.4.2 通過化學(xué)鍵合作用

利用生物分子中所含的-SH、-NH2、-COOH、-OH等活性官能團通過相應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)連接在電極表面，來進行對生物大分子多層自組裝膜的方法。例如：Kim Hak-Sung等[13]利用席夫堿反應(yīng)構(gòu)筑了層層組裝的葡萄糖生物傳感器。首先，將胱胺二鹽酸鹽（cystamine dihydrochloride）自組裝到金電極表面，然后，將高碘酸鹽（IO4-）氧化表面帶有醛基官能團的GOD接枝到半胱氨酸的氨基上，再接著在氰基硼酸鈉（NaBH3CN）的催化作用下，利用GOD表面未反應(yīng)的醛基端基與樹枝狀的氨基二茂鐵（Fc-D）高分子聚合物發(fā)生席夫堿反應(yīng)，結(jié)合在電極表面。交替反復(fù)地重復(fù)以上步驟，使Fc-D和GOD層層組裝，得到多層酶膜。該方法結(jié)合的酶牢固，不易脫落，具有潛在的應(yīng)用價值。

1.4.3 借助納米粒子的作用

利用納米粒子和酶蛋白之間或納米離子與媒介體直接的結(jié)合作用，來實現(xiàn)對生物分子的固載。例如Xu Jingjuan等[14]將金納米粒子引入層層組裝復(fù)合膜，構(gòu)建葡萄糖生物傳感器。在多層膜中，金納米粒子連接于GOD與電極之間，起到了電子導(dǎo)線的作用，并大大加快了電子在膜內(nèi)的傳遞速率。Yuan Ruo課題組[15]報道了在多壁碳納米管上層層自組裝血紅蛋白和納米金，實現(xiàn)了多層酶膜的固載。該課題組[16]還構(gòu)建了將納米金和電子媒介體甲苯胺藍進行交替組裝，然后固載辣根過氧化物酶，對過氧化氫定量檢測。這種方法構(gòu)建的傳感器具有負載酶量多，靈敏度高，穩(wěn)定性好等優(yōu)點。

1.4.4 生物蛋白間的特異性識別

利用某些生物大分子和特定的生物分子之間的特異識別進行生物大分子的LBL自組裝的方法。目前，屬于生物分子之間特異性識別的類型有：酶-底物、抗原-抗體、適配體-凝血酶、抗生素蛋白(親和素)-生物素、伴刀豆凝集素(Con A)-糖蛋白等。能夠用在LBL技術(shù)上的主要有抗生素蛋白(親和素)-生物素和伴刀豆凝集素(Con A)-糖蛋白兩種。例如：Lin Xianfu實驗組[17]制備運用Con A和天然HRP的相互識別作用，在聚電解質(zhì)修飾的金電極表面進行交替沉積，形成了HRP的多層薄膜。一個Con A分子可結(jié)合四個HRP分子，通過抑制性酶的作用，用于檢測硫醇。該生物傳感器具有良好的選擇性和穩(wěn)定性。Anzai Junichi等[18]進一步通過Con A和糖蛋白的識別作用，研制出HRP/GOD的雙酶型生物傳感器，拓展了這種固定方法的應(yīng)用。Dai Zhifei等[19]利用LBL技術(shù)，結(jié)合抗生素蛋白(親和素)-生物素的作用構(gòu)建了多層復(fù)合膜。

上述固定方法各有自己的優(yōu)缺點，實驗發(fā)現(xiàn)，單獨使用很難達到較理想的效果。所以近年來，研究者經(jīng)常將兩種或兩種以上的方法結(jié)合使用固定酶。例如：Willner Itamar研究小組[20]結(jié)合了吸附和交聯(lián)的方法制備了葡萄糖生物傳感器。首先將PEI功能化的單壁碳納米管 （SWCNT）沉積在玻碳電極表面，在EDC的作用下，利用PEI分子中的氨基和二茂鐵甲酸中的羧基發(fā)生酰胺反應(yīng)，將電子媒介體固定在電極上，然后吸附GOD，最后再用戊二醛交聯(lián)固定酶。這個試驗體系增大了電極的比表面積，促進了酶與電極間的電子傳輸，并且，傳感器性能穩(wěn)定，10 d后，未發(fā)現(xiàn)明顯的相應(yīng)電流衰減。

1.5 較新的固定方法

另外，要保持酶傳感器的長足發(fā)展，尋求一種既能有效防止酶的泄漏又能長時間保持酶的活性的固載方法是傳感器領(lǐng)域不斷追求的目標。要能在這些方面有新的突破，開發(fā)新的固定方法勢在必然。科研工作者不斷提出了新的方法：

1.5.1 一鍋法（One-Pot）

Xie Qingji研究小組[21]提出了“一鍋法”（One-Pot）的固酶策略。首先將1,4-苯二硫醇（BDT）和GOD分散混合在一起，然后慢慢向混合溶液中加入K3Fe(CN)6，進行化學(xué)預(yù)氧化，產(chǎn)生許多不溶性的BDT低聚體包裹的高活性GOD蛋白分子。最后，將形成的復(fù)合物｛BDTO-GOx-K3Fe(CN)6｝通過BDTO的作用聚合在金電極表面，得到了葡萄糖生物傳感器。這種方法固定的酶擁有高的生物活性和高的負載量。與傳統(tǒng)的電聚合方法相比，靈敏度提高了32倍。在前一個研究工作的基礎(chǔ)上，繼續(xù)擴展了“一鍋法”的應(yīng)用。采用了一鍋預(yù)合成電聚合的固酶方法，并將納米粒子引入這一構(gòu)想中[22]。首先，將多巴胺（DA）和GOD溶液混合均勻后，慢慢向其加入 H2PtCl6溶液，產(chǎn)生了鉑納米離子 （Pt NPs）和DA的低聚體（PDA）。在這里，DA扮演還原劑和單體的角色；H2PtCl6作為氧化劑無觸發(fā)DA的聚合。然后依靠DA單體的作用將生物納米復(fù)合物電聚合在金電極表面。納米離子的介入大大提高了傳感器的靈敏度，是沒有納米離子時的5.8倍，且同樣保持了酶的活性和高負載量，傳感器擁有高靈敏度和寬的線性范圍。

1.5.2 鏈接化學(xué)（Click Chemistry）

“Click”化學(xué)是2001年美國著名的Scripps研究院（The Scripps Research Institute）的諾貝爾化學(xué)獎得主sharpless(sharpless K.Barry)小組提出的一種模塊化方法[23]。其所具有的高效和高控制性，在化學(xué)合成領(lǐng)域掀起了一場風(fēng)暴，成為目前國際醫(yī)藥領(lǐng)域最吸引人的發(fā)展方向，被業(yè)界認為是未來加快新藥研發(fā)最有效的技術(shù)之一。一價銅催化的疊氮化物和端基炔的1，3-偶極環(huán)加成反應(yīng)是所有“click”化學(xué)反應(yīng)中最具代表性的一個。該方法主要通過Cu(Ⅰ)催化疊氮化合物和末端炔反應(yīng)生成單一的反式三氮唑分子。此反應(yīng)不僅具有高度的獨立性、完整性和專一化程度，而且還有很好的生物兼容性[24]。此外，反應(yīng)產(chǎn)物在生理條件下極其穩(wěn)定。由于這些引人注目的優(yōu)點，“click”化學(xué)在眾多研究領(lǐng)域得到了迅速發(fā)展[25～27]。 但到目前為止，將“click”化學(xué)應(yīng)用于生物傳感器領(lǐng)域還鮮有報道。

Brennan等[28]利 用 “click”化 學(xué) 將 脂 肪 酶（Lipases）和納米金進行生物耦合。首先將納米金疊氮化，同時脂肪酶炔基化，兩者在Cu(Ⅰ)的催化作用下，發(fā)生“click”反應(yīng)。反應(yīng)生成的產(chǎn)物用毛細管電泳法和熒光法進行了詳細的研究，結(jié)果表明：一個納米顆粒上鏈接七個充滿活性的脂肪酶蛋白分子。Gole科研組[29]也雇傭了“Click”化學(xué)將金納米棒和胰島素進行交聯(lián)耦合。首先用11-疊氮-3,6,9-三氧雜十一烷-1-氨基 （NH2-PEGN3）將金納米棒疊氮化，用戊炔酸將胰島素炔基化，然后在 Cu(Ⅰ)的催化作用下，發(fā)生“click”耦合。并且該工作中同時還采用了EDC交聯(lián)法和直接吸附法對其進行了比較研究，結(jié)果顯示：“Click”耦合酶的生物活性遠遠超過了兩種常用的方法。Jin Litong實驗小組[30]對“click”反應(yīng)的方法進行了延伸的研究，就這種方法用在生物傳感器的研制當中。先將咪唑-1-磺酰疊鹽酸自組裝在金電極表面，得到了炔基端基的修飾層，然后，再在Cu(Ⅰ)的催化作用下，和疊氮化的HRP發(fā)生“click”反應(yīng)。電極的組裝過程運用紅外光譜法和表面增強拉曼散射光譜進行了詳細的研究。所用的試驗結(jié)果說明固定在電極表面的HRP分子維持了較高的生物活性，沒有發(fā)生酶自身結(jié)構(gòu)的變性。酶與電極之間的異質(zhì)電子傳輸常數(shù)為1.11 s-1，表觀米氏常數(shù)為 0.196 mmol·L-1。 暗示了酶與底物間具有較高的親和作用。

大量的試驗結(jié)果表明，這些技術(shù)都存在著各自的優(yōu)缺點，因此，通常會將這些方法進行聯(lián)用，互相協(xié)同改進，以獲取傳感器最佳的性能。但是無論使用何種方法，都必須兼顧酶蛋白生物活性的保持與固載后的穩(wěn)定性和耐用性。

2 納米材料在電化學(xué)酶生物傳感器中的應(yīng)用

納米技術(shù)的興起已經(jīng)為電化學(xué)生物傳感器的研究開辟了一片新的天地。利用納米材料特異的電學(xué)、光學(xué)和化學(xué)性質(zhì)，主要起到以下幾種作用：a.加快電子轉(zhuǎn)移速率，增加氧化還原物質(zhì)在電極表面反應(yīng)的可逆性；b.催化反應(yīng)；c.固定生物分子；d.標記生物分子；e.反應(yīng)控制開關(guān)；f.作為反應(yīng)物。它的引入不僅可以增加酶的吸附量和穩(wěn)定性，而且還可以提高酶的催化活性，使酶電極的電流響應(yīng)靈敏度得到顯著提高。目前，隨著納米技術(shù)的不斷提高，各種形狀和結(jié)構(gòu)的納米材料已經(jīng)被成功制備。下面將主要介紹幾種常見的納米材料作為電極界面修飾材料方面的研究應(yīng)用。

2.1 碳納米材料在生物傳感器中的應(yīng)用

碳納米材料是指分散相尺度至少有一維小于100 nm的碳材料。近年來，碳納米技術(shù)的研究相當活躍，多種多樣的納米碳結(jié)晶、針狀、棒狀、桶裝等形貌層出不窮。它具有環(huán)境友好、比表面積大以及優(yōu)良的物理和化學(xué)性質(zhì)而備受人們的青睞[31]。目前，碳納米管、碳納米纖維、石墨烯等形貌新穎、功能優(yōu)異的碳材料已相繼問世，并在生物傳感領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[32～33]。

2.1.1 碳納米管修飾的生物傳感器

碳納米管(Carbon nanotubes，CNTs)，屬富勒碳系，是伴隨著C60的研究不斷深入才發(fā)現(xiàn)的。是繼石墨、金剛石和C60之后的又一種碳的同素異形體。CNTs是由碳六元環(huán)構(gòu)成的類石墨平面卷曲而成的納米級中空管，以碳原子sp2雜化為主，混sp3雜化所構(gòu)筑成的理想結(jié)構(gòu)，具有納米尺度形成的細微結(jié)構(gòu)。CNTs具有特殊的電學(xué)性質(zhì)，其導(dǎo)電性既具有半導(dǎo)體性質(zhì)又具有金屬性質(zhì)，因此修飾在CNTs表面的酶蛋白分子可表現(xiàn)出更快的電子傳遞速率[34]，因此是固酶的理想材料。再一，CNTs特殊的中空管狀結(jié)構(gòu)具有較大的比表面積，經(jīng)酸處理后的CNTs具有更多的活性位點，其上的羧基容易與蛋白質(zhì)上的氨基結(jié)合，因而利用CNTs固載蛋白分子可以增加其固定量，從而增強反應(yīng)信號。另外，由于碳納米管具有巨大的分子量，直接導(dǎo)致碳納米管的不可溶解性。在用于制備修飾電極時，通常將其和某種溶劑超聲分散得到相對穩(wěn)定的膠狀懸浮液。最常用的分散劑有殼聚糖、Nafion、離子液體以及聚電解質(zhì)等等。隨著研究的不斷深入，現(xiàn)在趨向于將兩種或兩種以上的分散劑一起和CNTs混合，來增加其生物兼容、不溶脹等性質(zhì)。

Lee Kwangpill等[35]用殼聚糖和離子液體一起來分散碳納米管，利用殼聚糖和離子液體的成膜作用，在其氨基的界面上組裝納米金，然后利用納米顆粒和葡萄糖氧化酶之間的作用將酶固定在電極表面?；趲追N物質(zhì)的協(xié)同作用，所研制的傳感器具有高的靈敏度和較快的響應(yīng)時間。Cai Chenxin 等[36]將碳納米管（CNTs）與聚苯乙烯磺酸鈉（PSS）、離子液體（ILs）和鄰苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯（PDDA）相混合，制備了新穎的葡萄糖生物傳感器。

2.1.2 石墨烯修飾的生物傳感器

石墨烯是由碳原子構(gòu)成的二維晶體，碳原子排列與石墨的單原子層一樣。石墨烯的理論研究已有60多年的歷史，被廣泛用來描述不同結(jié)構(gòu)碳質(zhì)材料的性能[37]。石墨烯是目前已知的導(dǎo)電性能最出色的材料，其良好的導(dǎo)電性能和宏觀隧道效應(yīng)能使其成為固定化酶和電極之間有效的電子傳導(dǎo)體，因而可以提高傳感器的靈敏度和響應(yīng)電流，縮短響應(yīng)時間，提高檢出限。并且石墨烯還具有良好的生物相容性，有利于生物蛋白活性的保持，非常有利于生物敏感膜的固定，因此石墨烯在生物傳感領(lǐng)域有很廣闊的應(yīng)用前景。近來，石墨烯在生物傳感器中應(yīng)用研究正日新月異的進行著[38～39]。

Qu Xiaogang研究組[40]利用比色法檢測了吸附在羧基化的氧化石墨烯 （GO-COOH）表面的GOD對葡萄糖的催化性能。GO-COOH擁有高的比表面積和對底物有較好的親和性。試驗還發(fā)現(xiàn)GO-COOH有類過氧化物酶的性質(zhì)，能對過氧化氫進行催化。

2.2 金屬納米粒子在生物傳感器中的應(yīng)用

金屬納米材料由于具有較高的比表面積、穩(wěn)定性、較好的生物相容性等特點，己被廣泛應(yīng)用于生物成像、催化劑、燃料電池以及生物傳感器等領(lǐng)域[41～44]。

具體來講，金屬納米離子可分為貴金屬納米離子和半導(dǎo)體納米顆粒。在諸多的納米粒子中，貴金屬納米離子（Au、Ag、Pt）在生物傳感器中的應(yīng)用得到了非常廣泛和深入的研究。尤其是對納米金的應(yīng)用研究。主要集中在利用金納米粒子做探針載體和信號分子。主要原因為：a.納米金顆?？捎陕冉鹚岷蜋幟仕徕c這兩種普通試劑合成，在反應(yīng)過程中，可以通過調(diào)節(jié)反應(yīng)物比例來控制納米粒子的直徑。即金納米粒子的尺度可控性強；b.由于其直徑在1～100 nm之間，而大多數(shù)重要的生物分子（如蛋白質(zhì)、核酸等）的尺寸都在這個范圍內(nèi)，因此可以利用納米金作為探針進入生物分子內(nèi)部，扮演“分子導(dǎo)線”的角色，縮短酶分子活性中心與電極表面的距離，起到了加快異相界面電子傳遞速率的作用，增加了氧化還原物質(zhì)在電極表面反應(yīng)的可逆性。所以能夠更好的探測生物分子的生理功能，進而在分子水平上揭示生命過程。此外，金納米粒子與巰基、氨基、氰基等基團之間能發(fā)生強的共價鍵合作用，這使得金納米粒子與生物活性分子可結(jié)合形成生物分子探針[45]。蛋白質(zhì)分子也可以通過靜電作用和疏水作用結(jié)合到納米金的表面，形成的復(fù)合物能夠長久的保持蛋白質(zhì)的生物活性[46]。例如：Willner Itamar研究組[47]研究了將1.4 nm小粒徑的納米金粒子（nano-Au）與葡萄糖氧化酶（GOD）的輔因子-黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）相連，通過雙巰基分子將nano-Au-FAD組裝到金電極表面。然后與除去輔因子的GOD重組為新的GOD相結(jié)合。該電極成功地實現(xiàn)了酶的直接電子傳輸。在測定葡萄糖時，酶與電極之間通過金納米粒子傳遞電子，電子傳輸速率常數(shù)（ks）為5×10-3s-1。 其電子傳遞速率是天然酶與其天然底物氧之間電子傳遞速率的7倍。由于金納米粒子傳遞電子的速率遠快于氧，并且該傳感器在測定葡萄糖時不受溶解氧濃度的影響，還具有很好的抗干擾能力。通常用檸檬酸根還原法制備的納米金是帶負電荷的，很少研究者注意到帶正電荷的納米金。實際上，正電荷的納米金對蛋白質(zhì)具有更強的吸附作用力和更好的催化性能。Yuan Ruo課題組[48]在有機相中合成了正電荷的納米金，并將其和血紅蛋白進行層層組裝研制了過氧化氫生物傳感器。另外，也將正電荷的納米金和葡萄糖氧化酶進行結(jié)合，對葡萄糖進行定量檢測[49]。該納米離子研制的傳感器具有線性范圍寬、檢測限低，以及靈敏度高等優(yōu)點。

隨著對納米離子研究的不斷深入，各種各樣形狀和形態(tài)的貴金屬納米離子已經(jīng)被成功制備，并用于對生物傳感器的研制過程中。Yuan Ruo課題組[50～51]合成了空心的鉑納米鏈、空心的鉑鈷納米鏈，結(jié)合多孔狀的納米金和碳納米管，實現(xiàn)了對葡萄糖的定量測定。

2.3 SiO2納米粒子在生物傳感器中的應(yīng)用

除了貴金屬納米粒子之外，二氧化硅溶膠也較早地被引入到固定化酶的研究。通常情況下，納米SiO2的粒徑小于100 nm，通常為20～60 nm。像其它納米材料一樣，納米SiO2表面都存在不飽和的殘鍵以及不同鍵合狀態(tài)的羥基，表面因缺氧而偏離了穩(wěn)態(tài)的硅氧結(jié)構(gòu)[52]。所以，納米SiO2才具有很高的活性，較強的吸附性能，以及對酶的穩(wěn)定保護作用，為固定化酶提供了優(yōu)良的反應(yīng)場所，增加了固定化酶的穩(wěn)定性和活性，而具有很廣泛的用途。比如：Sun Changqing研究小組[53]制備了氨基修飾的納米SiO2粒子，再以戊二醛為偶聯(lián)試劑，通過層層自組裝技術(shù)將氨基化的納米SiO2粒子與GOD多層膜修飾到電極表面。實驗結(jié)果表明，通過組裝四層納米SiO2/GOD后，制成葡萄糖生物傳感器具有最優(yōu)的響應(yīng)性能，其靈敏度為 5.11 μA·L·mmol-1·cm-2， 檢測限為 9×10-6mol·L-1。近年來，SiO2納米粒子被制備成核殼型的納米球，以及將SiO2納米粒子功能化，形成具有氧化還原電活性的復(fù)合納米離子已成為發(fā)展趨勢。例如：Yuan Ruo課題組[54]合成了有機硅納米球，用于對HRP的直接固定。還將此硅納米球和普魯士藍（PB）反應(yīng)，制備了普魯士藍修飾的硅納米球[49]，該納米復(fù)合材料除作為酶的固載基質(zhì)之外，還具有很好的氧化還原活性，并且可以有效的防止PB的滲漏。

2.4 磁性納米材料在生物傳感器中的應(yīng)用

磁性納米顆粒是近年來剛剛發(fā)展起來的一種新型材料，一般是指顆粒尺寸在1～100 nm范圍內(nèi)的超微磁性粒子。磁性納米粒子不但具有普通納米粒子所具有的四個基本效應(yīng)，還具有異常的磁學(xué)性質(zhì)，如超順磁性、高矯頑力、低居里溫度與高磁化率等特性，引起了人們廣泛的關(guān)注。而以Fe，Co，Ni等金屬元素為基體元素形成的納米尺寸微粒還具有奇異的超順磁性等特性，如納米Fe，F(xiàn)e2O3，F(xiàn)e3O4，F(xiàn)e/Pt等。 其中 Fe3O4是應(yīng)用最多的磁性納米顆粒，它很容易在水溶液中通過共沉淀或氧化共沉淀制備，其粒度、形狀和組成可以通過調(diào)節(jié)反應(yīng)條件得到控制。磁性納米顆粒除了具有納米磁學(xué)的特性之外，還具有生物相容性、表面活性等優(yōu)異性能。使其在核酸分析、臨床診斷、靶向藥物、細胞分離和酶的固定化等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用研究[55～56]。在生物傳感器領(lǐng)域,磁性納米顆粒的應(yīng)用為生物傳感器開辟了廣闊的前景，磁性納米顆粒能顯著提高生物傳感器檢測的靈敏度，實現(xiàn)生物分子的分離，提高了檢測的通量。

磁性納米顆粒固酶技術(shù)是上世紀60年代開始發(fā)展起來的一項新技術(shù)。具有三大優(yōu)勢：a.作為酶的固定化載體，磁性納米粒子有利于固定化酶從反應(yīng)體系中分離和回收，還可以利用外部磁場控制磁性材料固定化酶的運動和方向，提高固定化酶的催化效率;b.固定化酶可重復(fù)使用，降低成本，可以提高酶的穩(wěn)定性，改善酶的生物相容性、免疫活性、親疏水性；c.分離及回收酶的操作簡單，適合大規(guī)模連續(xù)化操作[57]。Rossi等[58]合成了20 nm的Fe3O4納米粒子，并對Fe3O4進行氨基化，然后通過戊二醛將葡萄糖氧化酶共價交聯(lián)在納米粒子表面。結(jié)果表明，F(xiàn)e3O4增加了固定化酶的穩(wěn)定性和保持了酶的生物活性，于4℃下保存，3個月內(nèi)其生物活性未見明顯變化。檢測葡萄糖的結(jié)果令人滿意。

另外，磁性納米材料由于其特殊的磁性和良好的物理化學(xué)性質(zhì)，可以選擇性測定待測物質(zhì)及控制電催化過程，因此常用作電極表面的反應(yīng)控制開關(guān)。Wang Joseph等[59]通過改變外部磁鐵的位置來轉(zhuǎn)化和控制電催化過程，他們將二茂鐵、葡萄糖氧化酶電活性物質(zhì)固定在修飾金/鎳納米線的表面，以二茂鐵為電化學(xué)探針，通過改變外加磁鐵的位置來控制磁性粒子的電化學(xué)活性。

2.5 納米材料應(yīng)用在生物傳感器中的發(fā)展趨勢

隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展，各種納米材料已廣泛用于生物傳感器的研發(fā)。現(xiàn)如今，納米復(fù)合材料已成為當今發(fā)展的趨勢。簡言之，納米復(fù)合材料是將各種納米粒子以及其它組分通過物理或化學(xué)的方法，有機結(jié)合形成的新型的復(fù)合納米材料，它除具備各組分本身的性質(zhì)外還可能具備特有的性質(zhì)。

Yuan Ruo課題組[60]將鉑納米離子負載在碳納米管表面，形成鉑功能化的碳納米管復(fù)合材料，利用其良好的電催化性質(zhì)和增強電子傳輸?shù)哪芰?，作為固酶基質(zhì)，實現(xiàn)葡萄糖氧化酶的直接電催化。Mirkin等[61]采用新的方法合成了金殼、硅核和Fe3O4為夾層的三層磁性復(fù)合納米顆粒。并對DNA進行功能化，研究結(jié)果表明：這種結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合物顯示了彼此間很強的協(xié)同作用，并且有望用于高選擇性的生物診斷體系。

最近，納米金屬與CNTs相結(jié)合成為研究的熱點。這主要是由于CNTs具有較高的比表面和催化活性，使得納米金屬具有較高的分散性，導(dǎo)致這種復(fù)合納米材料具有很好的催化活性和穩(wěn)定性。將這種復(fù)合材料用于生物傳感器的研制中，能夠發(fā)揮其良好的協(xié)同作用，使得傳感器的活性面積進一步增加，更加穩(wěn)定，而且靈敏度更高、選擇性更好并具有良好的重現(xiàn)性等。例如：Yuan Ruo課題組[62]制備了金鉑合金功能化的硅納米纖維復(fù)合材料。通過對硅納米纖維表面的氨基吸附納米金，再利用吸附的納米金為晶核，利用抗壞血酸（AA）將H2PtCl6還原，得到Pt-Au核殼型合金功能化的硅納米纖維復(fù)合納米顆粒。利用多種納米材料的協(xié)同作用制備的修飾電極，具有高的比表面積和促進電子的傳輸，可以實現(xiàn)對葡萄糖靈敏、快速的測定。Qian Weiping實驗組[63]合成了以SiO2為核，金為殼的復(fù)合納米離子（GNSs），并將其自組裝在氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）修飾的ITO電極表面，再去吸附血紅蛋白（Hb）。制備的傳感器擁有較寬的線性范圍，低的檢測限以及對底物有較強的親和力。而且，GNSs增強了酶與電極之間的直接電子傳輸。

總之，納米顆粒大大豐富了生物傳感器的研究內(nèi)容，納米顆粒-酶組裝的體系是最有發(fā)展前景的傳感器之一?；诩{米顆粒的種類繁多，制備和形貌控制方法較為完善，生物兼容性好等優(yōu)點，納米顆粒在生物傳感器領(lǐng)域必將發(fā)揮越來越大的作用。另外，納米顆粒也可作為多組分酶中繼體的體系，具有潛在的發(fā)展前景。

3 展望

納米技術(shù)的介入為生物傳感器帶來了無限的發(fā)展空間，由于納米技術(shù)和表征手段的日趨成熟，納米電化學(xué)生物傳感器正呈現(xiàn)日新月異的變化。但是，生物傳感器在實用性和耐用性方面仍存在著嚴峻的挑戰(zhàn)。今后，探索和開發(fā)更易于固定酶和促進電子轉(zhuǎn)移的新納米材料，以及尋找方便、高效的酶固定化方法、研制開發(fā)性能優(yōu)異、可靠、實用高效的生物傳感器,將是科研工作者繼續(xù)努力的方向。

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