鐘 成，李文杰，賈士儒* ，范寶慶，王國良，鄭竹琳

(1.教育部工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津科技大學(xué))，天津300457;2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457)

ε－聚－L－賴氨酸(ε－poly－L－lysine，簡寫 ε－PL)是由25～35個(gè)單體 L－賴氨酸通過 α－羧基和 ε－氨基通過酰胺鍵依次連接而成的陽離子型的天然氨基酸聚合物。最早由 Shima和 Sakai在篩選與Dragendorff試劑呈陽性反應(yīng)的物質(zhì)時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)，是由白色鏈霉菌346分泌的一種胞外物質(zhì)［1－2］。在酸性和微酸性環(huán)境中 ε－聚賴氨酸對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌和霉菌均具有一定的抑制作用，而且其水溶性好、熱穩(wěn)定性高、可降解、可食用，對人體和環(huán)境無毒。因此它和它的衍生物由于其廣泛的工業(yè)應(yīng)用(如食品，醫(yī)藥，環(huán)境和電子技術(shù))，在過去幾年里已引起了人們廣泛的興趣。ε－PL和它的衍生物有多種不同的應(yīng)用，如作為食品防腐劑、乳化劑、食療劑、可降解纖維、可高度吸水的凝膠、藥物載體、抗癌劑增強(qiáng)因子和生物芯片。1989年日本批準(zhǔn)其用于食品加工中，此后，韓國和美國也陸續(xù)批準(zhǔn)其作用食品添加劑［3］。

自發(fā)現(xiàn)白色鏈霉菌Lysinopolymerus strain 346以來，人們針對ε－PL生產(chǎn)菌株的發(fā)酵過程與發(fā)酵條件進(jìn)行了大量的優(yōu)化，以提高ε－PL的最終產(chǎn)量。如Shima等［1，4］采用了 2 步培養(yǎng)的方法，先將菌體 S.albulus接種于20 g/L甘油，5 g/L酵母浸膏的種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，溫度30℃;然后通過過濾收集菌體，將富集菌體移入含20 g/L葡萄糖、20 g/L檸檬酸和10 g/L(NH4)2SO4的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過2步培養(yǎng)的方法，8～9 d后ε－PL的發(fā)酵產(chǎn)量可達(dá)4～5 g/L。Kahar等［5］通過 pH值的調(diào)控來調(diào)節(jié)菌體的生長和 ε－聚賴氨酸的產(chǎn)量，采用菌株 S.albulus 410在5 L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐發(fā)酵，培養(yǎng)基為M3G，通過半連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，在消耗大量能量的前提下采用pH值來控制。試驗(yàn)過程分為2個(gè)階段，在前期菌體生長階段控制發(fā)酵液的pH值大于5.0，在后期ε－聚賴氨酸合成階段發(fā)酵液 pH值控制在4.0左右。通過這一半連續(xù)培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，ε－PL產(chǎn)量由原先5.2 g/L上升到48.3 g/L。

在微生物發(fā)酵過程的研究中，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程優(yōu)化與控制是發(fā)酵過程的重要目標(biāo)和研究熱點(diǎn)。通過菌株選育得到高產(chǎn)菌株，并通過發(fā)酵過程的優(yōu)化控制，可以最大限度地發(fā)揮菌株的生產(chǎn)潛力。本研究考察了白色鏈霉菌分批發(fā)酵生產(chǎn)ε－聚賴氨酸過程的生長動(dòng)力學(xué)，并建立了菌株生長動(dòng)力學(xué)模型，對模型的動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了求解，為發(fā)酵過程的優(yōu)化與控制提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)方法

白色鏈霉菌UV80(Streptomyces UV80)由天津科技大學(xué)生化工程研究室保藏［6］。斜面培養(yǎng):取4℃冰箱中保存的菌種，接種至斜面培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)5～7 d至長滿灰色孢子。一級搖瓶種子培養(yǎng):取一環(huán)斜面菌體接入裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30℃，220 r/min，旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)一定的時(shí)間。二級搖瓶種子培養(yǎng):以體積分?jǐn)?shù)為10%的接種量將一級種子培養(yǎng)液接入裝有90 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30℃，220 r/min，旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)一定的時(shí)間。發(fā)酵罐培養(yǎng):貝朗5 L發(fā)酵罐。初始pH值為6.8，初始糖質(zhì)量濃度50 g/L，溫度30℃，通風(fēng)量1～2 vvm(vvm即通氣比，每分鐘通氣量與罐體實(shí)際料液體積的比值)，控制DO 30%(攪拌轉(zhuǎn)速為300～1 000 r/min)。

1.2 分析方法

菌體干重采用烘干法測量。濾紙預(yù)先于烘箱95℃烘至恒重，取10 mL發(fā)酵液，在4 000 r/min條件下離心8 min，沉淀用無菌水洗滌2～3次，濾紙過濾，將濾紙和菌體在烘箱中95℃干燥至恒重，計(jì)算菌體干重。殘?zhí)欠治霾捎萌?0 mL發(fā)酵液，4 000 r/min，離心 8 min，取上清液，使用 SBA－40C生物傳感分析儀(山東省科學(xué)院微生物研究所)測定發(fā)酵液中的葡萄糖濃度。

發(fā)酵液經(jīng)初步預(yù)處理、離心分離、D392大孔徑弱堿性陰離子交換樹脂、D152大孔徑弱酸性陽離子交換樹脂以及乙醇沉淀和噴霧干燥，得到ε－聚賴氨酸。ε－聚賴氨酸的含量采用高效液相色譜法測量［7］。其色譜條件為:色譜柱為 TSKgel ODS－120T，φ4.6 mm×25 cm。采用紫外分光檢測器，檢測波長為215 nm。柱溫40℃。將磷酸氫二鉀1.70 g和硫酸鈉1.42 g溶于800 mL水中，用磷酸調(diào) pH值至3.4后用水定容至1 000 mL，之后取此溶液920 mL加入80 mL乙腈作為流動(dòng)相。采用 L－苯丙氨酸作為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)樣量為 20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 白色鏈霉菌分批發(fā)酵生產(chǎn) ε-聚賴氨酸的生長動(dòng)力學(xué)分析

圖1～圖3為5 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵生產(chǎn) ε－聚賴氨酸過程的底物消耗、菌體生長以及產(chǎn)物生成的變化曲線。圖 1～圖 3中，矩形為實(shí)測值，實(shí)線為Sigmoid模型擬合的曲線。

圖1 底物濃度隨時(shí)間的變化情況Fig.1 Changes of substrate concentration over time

由圖1可以看出，菌體在8～32 h耗糖速度迅速加快，之后耗糖速度緩慢下降，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液殘留葡萄糖濃度為38 g/L。圖2表明菌體在8～24 h內(nèi)長較快，于32 h時(shí)到最大值，此時(shí)細(xì)胞干重(DCW)為5.75 g/L，隨著發(fā)酵的繼續(xù)進(jìn)行，菌體量緩慢下降。由圖3可見，當(dāng)白色鏈霉菌生長到一定階段，ε－聚賴氨酸才開始在發(fā)酵液中積累，可能是細(xì)胞生長與產(chǎn)物形成存在部分偶聯(lián)關(guān)系，ε－聚賴氨酸在8～48 h大量合成并于48 h達(dá)到最大值，即0.9 g/L。

圖2 菌體量隨時(shí)間的變化情況Fig.2 Changes of biomass growth over time

圖3 ε-聚賴氨酸隨時(shí)間的變化的情況Fig.3 Changes of ε-pL production over time

2.2 ε-聚賴氨酸分批發(fā)酵生產(chǎn) ε-聚賴氨酸的Sigmoid模型

由于微生物本身代謝生長的復(fù)雜性，要建立它們的結(jié)構(gòu)生長模型非常的復(fù)雜。因此實(shí)際過程當(dāng)中，經(jīng)常用到經(jīng)驗(yàn)和半經(jīng)驗(yàn)但沒有明確生物學(xué)意義的數(shù)學(xué)方程來描繪其生長規(guī)律，其中常用的方程如Monod以及 Logistic模型等［8］。Sigmoid模型在工程領(lǐng)域中常用來擬合“S”形曲線，其對應(yīng)的函數(shù)(Boltzmann函數(shù))如方程(1)所示。

運(yùn)用Sigmoid模型對ε－聚賴氨酸發(fā)酵過程的生物量、殘?zhí)?、產(chǎn)物濃度進(jìn)行擬合，如圖1，圖2和圖3中實(shí)線所示。

由圖1可知，模型預(yù)測值(實(shí)線)基本上能夠較好地吻合試驗(yàn)所測值(矩形)，表明 Sigmoid模型在白色鏈霉菌生長規(guī)律方面有較好的適應(yīng)性。生物量、殘?zhí)?、ε－聚賴氨酸?jīng) Sigmoid模型擬合后的數(shù)學(xué)方程見式(2)～式(4)。

Sigmoid模型擬合菌體生長動(dòng)力學(xué)方程為

Sigmoid模型擬合產(chǎn)物形成動(dòng)力學(xué)方程為

Sigmoid模型擬合底物消耗動(dòng)力學(xué)方程為

2.3 動(dòng)力學(xué)參數(shù)求解

細(xì)胞比生長速率(μ)、葡萄糖比消耗速率(qs)和ε－聚賴氨酸比合成速率(qε－pl)定義式分別為:

當(dāng)時(shí)間間隔很小時(shí)，可以近似用式(6)直接計(jì)算得到 μ，qs，qε－pl。

利用Origin繪圖軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行插值計(jì)算(時(shí)間間隔0.1 h)，再用Excel軟件求解得到發(fā)酵不同時(shí)刻的 μ、qs和 qε－pl，經(jīng) Origin 軟件繪圖后平滑處理得到不同時(shí)刻白色鏈霉菌生產(chǎn) ε－聚賴氨酸過程動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化曲線［9－10］，見圖 4。

圖4表明細(xì)胞比生長速率在5.8 h達(dá)到最大值，為0.263 55 h－1;葡萄糖比消耗速率在12 h達(dá)到一個(gè)最大值，為0.004 326 h－1，之后到 30 h以后，它的值隨著時(shí)間的延長，不斷地增加;此時(shí)可以看出底物的消耗主要用于ε－聚賴氨酸的合成，ε－聚賴氨酸比合成速率在 36 h達(dá)到最大值，為0.008 88 h－1。另外，由圖4可知，ε－聚賴氨酸的合成與細(xì)胞的生長呈現(xiàn)復(fù)雜的部分偶聯(lián)關(guān)系，符合 Luedeking－Piret方程，通過回歸分析可得ε－聚賴氨酸的合成與細(xì)胞生長的偶聯(lián)系數(shù)關(guān)系式。

圖4 ε-聚賴氨酸發(fā)酵過程細(xì)胞比生長速率(μ)、葡萄糖比消耗速率(qs)、ε-PL的比合成速率(qε-pL)隨時(shí)間的變化曲線Fig.4 Changes of specific growth rate(μ)，specific glucose consumption rate(qs)，specific ε-pL production rate(qε|pL)over time during ε-pL fermentation process

2.4 ε-聚賴氨酸發(fā)酵過程中得率的變化

相應(yīng)的，根據(jù)式(8)可計(jì)算得到發(fā)酵過程中細(xì)胞對葡萄糖的得率(Yx/s)，ε－聚賴氨酸對葡萄糖的得率 Yε－pl/s隨時(shí)間的變化曲線。

圖5 ε-聚賴氨酸發(fā)酵過程中細(xì)胞對葡萄糖的得率(Yx/s)、ε-聚賴氨酸對葡萄糖的得率 Yε-pl/s隨時(shí)間的變化曲線Fig.5 Changes of Yx/s，Yε-pL/sover time during ε-pL fermentation process

對底物的得率系數(shù)表征菌體攝取底物用于自身生長或代謝產(chǎn)物合成的能力［11］。圖5中菌體對葡萄糖的得率系數(shù)隨發(fā)酵時(shí)間的延長先升高后逐漸降低，表明前期細(xì)胞代謝底物主要用于菌體自身的生長，而ε－聚賴氨酸的得率系數(shù)隨著時(shí)間的延長逐漸的升高，在發(fā)酵停止時(shí)仍有升高的趨向，即為0.5 g/g，表明在發(fā)酵后期菌體利用葡萄糖合成 ε－聚賴氨酸的能力在增強(qiáng)，并且逐漸增加。

3 結(jié)論

通過對ε－聚賴氨酸分批發(fā)酵過程進(jìn)行分析，運(yùn)用Sigmoid模型擬合得出底物消耗、菌體生長和產(chǎn)物形成的動(dòng)力學(xué)方程，并對發(fā)酵過程當(dāng)中的一些參數(shù)進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)分析，模擬結(jié)果與試驗(yàn)數(shù)據(jù)具有很好的相關(guān)性，研究為ε－聚賴氨酸生產(chǎn)的分批發(fā)酵法和補(bǔ)料分批發(fā)酵法提供了重要的理論依據(jù)。

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