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      抗生素在植物保護中的應(yīng)用及分離純化研究進展

      2011-04-12 00:22:39王苗苗郝再彬
      化學與生物工程 2011年9期
      關(guān)鍵詞:類抗生素抗生素

      王苗苗,劉 崢,袁 帥,郝再彬

      (1.桂林理工大學化學與生物工程學院,廣西 桂林 541004;2.中國農(nóng)業(yè)科學院 植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193)

      抗生素指生物在其生命活動過程中所產(chǎn)生的或/并用化學、生物或生化方法所衍生的,能在低微濃度下選擇性地抑制或殺滅其它微生物或腫瘤細胞的有機物質(zhì)。作為生物的次級代謝產(chǎn)物,除從微生物培養(yǎng)液中提取外,有些抗生素已能人工合成或半合成。

      隨著醫(yī)用抗生素的發(fā)展,用于植物保護方面的抗生素也不斷發(fā)展起來,至今已有四十多年的歷史??股剌^化學農(nóng)藥[1]具有活性高、選擇性強、高效、低毒、環(huán)境相容性好等特點,以抗生素代替化學農(nóng)藥來防治植物病蟲草害,是現(xiàn)代綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展的必然趨勢。作者在此對抗生素在植物保護[2,3]中的應(yīng)用及其分離純化方法的研究進展進行了歸納。

      1 抗生素的種類及在植物保護中的作用

      抗生素種類繁多,根據(jù)化學結(jié)構(gòu)的不同可分為β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、多烯大環(huán)類和線性氨基多元醇類等。

      1.1 β-內(nèi)酰胺類抗生素

      β-內(nèi)酰胺類抗生素包括青霉素族和頭孢菌素族。20世紀90年代以前,頭孢菌素族已由第一代發(fā)展到第三代,抗菌譜陸續(xù)擴展,對β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性明顯增強,各國使用的主要產(chǎn)品已有四十余種。進入20世紀90年代以后,發(fā)現(xiàn)了第四代頭孢菌素,其發(fā)展趨勢日漸平穩(wěn)。

      β-內(nèi)酰胺類抗生素呈酸性(pKa=2.5~2.8),其堿金屬鹽易溶于水,而有機堿鹽難溶于水、易溶于有機溶劑;青霉素族[4]和頭孢菌素族分子中含有手性碳原子和共軛系統(tǒng),均具有旋光性和紫外吸收;青霉素的水溶液在pH值6.0~6.8時較穩(wěn)定,在酸堿、青霉素酶、羥胺及某些金屬離子或氧化劑作用下均可導致β-內(nèi)酰胺環(huán)的破壞而失去抗菌活性。

      β-內(nèi)酰胺類抗生素具有對細菌的選擇性殺滅作用,對宿主毒性小。其作用機制是抑制胞壁粘肽合成酶,即青霉素結(jié)合蛋白(PBPs),從而阻礙細胞壁粘肽合成,使細菌胞壁缺損、菌體膨脹裂解。除此之外,其對細菌的致死效應(yīng)還包括觸發(fā)細菌的自溶酶活性。因而無細胞壁的或缺乏自溶酶的突變株表現(xiàn)出耐藥性,不受β-內(nèi)酰胺類藥物的影響。氨芐青霉素鈉、氨芐西林鈉和多種頭孢類鈉鹽的多晶型已相繼被研發(fā)出來,在臨床已得到應(yīng)用,且效果明顯。如果能將β-內(nèi)酰胺類抗生素的多晶型等優(yōu)點應(yīng)用于植物保護方面,相信效果也會很可觀。

      1.2 氨基糖苷類抗生素

      氨基糖苷類抗生素是分子中含有氨基糖苷結(jié)構(gòu)的一大類抗生素。1944年,Waksman發(fā)現(xiàn)了第一個氨基糖苷類抗生素鏈霉素。此后,又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了新霉素、卡那霉素、慶大霉素、西索米星等。據(jù)不完全統(tǒng)計,迄今為止發(fā)現(xiàn)的天然的氨基糖苷類抗生素超過百種,如果包括半合成的和微生物轉(zhuǎn)化的新型抗生素及其衍生物,累計不下數(shù)千種。其中最典型的是鏈霉素和慶大霉素。

      鏈霉素[5]和慶大霉素均為堿性化合物,其硫酸鹽易溶于水,不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有機溶劑;分子中含有多個手性碳原子,均具有旋光性;鏈霉素的硫酸鹽水溶液在pH值5.0~7.5時最穩(wěn)定,過酸過堿條件下易水解失效;鏈霉素在230 nm處有紫外吸收,慶大霉素在紫外區(qū)無吸收。

      氨基糖苷類抗生素對各種需氧的G-桿菌具有強大的抗菌活性,對金黃色葡萄球菌(MRSA)和表皮葡萄球菌(MRSE)也有較好的抗菌活性,鏈霉素、卡那霉素還對結(jié)核桿菌有效,但對G-球菌作用較差。氨基糖苷類抗生素的作用機制是抑制細菌蛋白質(zhì)合成,以及破壞細菌胞漿膜的完整性。氨基糖苷類抗生素的臨床應(yīng)用較為廣泛,醫(yī)用的鏈霉素和土霉素曾用于防治某些果蔬的病害,取得了一定效果,引起了廣泛的關(guān)注,但由于像臨床一樣產(chǎn)生抗藥性[6],其在植物保護方面的應(yīng)用還是受到了限制。

      1.3 四環(huán)素類抗生素

      四環(huán)素類抗生素是四并苯或萘并萘的衍生物,在基本結(jié)構(gòu)中改變?nèi)〈蜆?gòu)成了不同的抗生素,常用的四環(huán)素類抗生素有四環(huán)素[7,8]、金霉素、土霉素和多西環(huán)素等。20世紀40~50年代,金霉素、土霉素、四環(huán)素、去甲環(huán)素相繼從鏈霉菌發(fā)酵液中分離得到,它們有著相似的、廣泛的抗菌譜以及極為相似的化學結(jié)構(gòu),被認為是一類新的抗生素。

      四環(huán)素類抗生素具有酸堿兩性,遇酸或堿均能生成相應(yīng)的鹽;其結(jié)構(gòu)中含有不對稱的碳原子,具有旋光性,能進行定量和定性的分析;同時又含有共軛雙鍵系統(tǒng),在紫外光區(qū)有吸收,在紫外光的照射下,其降解產(chǎn)物能產(chǎn)生熒光。

      四環(huán)素類抗生素是由鏈霉菌產(chǎn)生的使用最廣泛、用量最大的抗生素種類之一,一般通過與核蛋白體的30S亞單位結(jié)合,阻止氨?;鵷RNA與核蛋白體結(jié)合產(chǎn)生藥理作用,起到抑菌殺菌的作用。目前,四環(huán)素類抗生素在環(huán)境中的大量殘留帶來了潛在的環(huán)境風險,其原因在于此類抗生素的溶解度較小,不能被土壤或植物充分吸收,從而對植物的保護作用不明顯。Miyazaki等用紅外光譜儀、X-射線衍射儀、熱分析法等手段研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素有兩種不同的晶型Ⅰ、Ⅱ,在同種溶劑中,晶型Ⅱ的溶解度明顯高于晶型Ⅰ[9],這是此類抗生素產(chǎn)生生物有效度差異的原因,為植物保護工作者提供了一個重要的依據(jù)。

      1.4 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素

      大環(huán)內(nèi)酯類抗生素含有一個大的內(nèi)酯環(huán),其結(jié)構(gòu)相似,均由兩部分組成:一部分為非糖部分,另一部分為糖基部分。1952年,從紅色鏈霉菌培養(yǎng)液中分離出來一種堿性抗生素紅霉素,是發(fā)現(xiàn)最早的此類抗生素,其抗菌能力強,研究和應(yīng)用較廣泛,為各國藥典所記載。后來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的羅紅霉素、阿維菌素、阿奇霉素和克拉霉素均被《中國藥典》所記載[10]。

      大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為無色堿性化合物,易溶于有機溶劑,與酸生成易溶于水的鹽;在酸性溶液中苷鍵易水解,在堿性溶液中內(nèi)酯環(huán)易被破壞;紅霉素在干燥狀態(tài)下很穩(wěn)定,結(jié)晶在室溫下可保存一年,在水溶液中穩(wěn)定,在 pH值6.0以下易被破壞;含手性碳,其比旋光度為-71°~-78°(20 mg·mL-1無水乙醇),不受溫度和濃度的影響。

      Avermectins是一族結(jié)構(gòu)相似的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,具有高效廣譜的殺蟲活性,且在光照和植物的作用下可完全分解,其作用機理是通過干擾害蟲神經(jīng)生理活性,刺激蟲體產(chǎn)生γ-氨基丁酸,從而阻斷運動神經(jīng)信息的傳遞活動。Avermectins可以同時驅(qū)殺幾乎所有的線蟲類、昆蟲類和螨蟲類寄生蟲,每次的驅(qū)凈率達80%~100%,效果顯著。Avermectins的結(jié)晶含有8種成分,田益民等對其結(jié)晶工藝進行改進,改進后得到的Avermectins結(jié)晶成品為代表性的生物農(nóng)藥,因其高效、低毒、高選擇性以及環(huán)境相容性好等特點,受到農(nóng)藥界的高度重視,是未來農(nóng)藥的發(fā)展方向[11]。

      1.5 多烯大環(huán)類抗生素

      多烯大環(huán)類抗生素又名多烯抗生素,是抗生素中一個化學類群,分子中包含由25~37個碳原子組成的大內(nèi)酯環(huán),環(huán)的一部分有共軛烯烴結(jié)構(gòu),對應(yīng)部位有羥基,并由苷鍵連接一個或多個氨基糖,由共軛雙鍵數(shù)目不同分為三、四……七烯。多烯大環(huán)類抗生素對真菌具有很好的抑制作用[12],其抗真菌譜廣,主要包括兩性霉素B、那他霉素[13]、制霉菌素、曲古霉素等。

      多烯大環(huán)類抗生素難溶于水,具有特異紫外吸收峰值,易被光、熱、氧等破壞。

      應(yīng)用最多的多烯大環(huán)類抗生素為那他霉素和兩性霉素B。那他霉素是由納塔爾鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的抑菌物質(zhì),作用于真菌細胞質(zhì)膜,與質(zhì)膜中含有的麥角甾醇作用,損傷細胞質(zhì)膜,造成細胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏,從而起到殺菌的作用(對無麥角甾醇的質(zhì)膜無影響),兩性霉素B作用機制亦如此。多烯大環(huán)類抗生素多應(yīng)用于食品防腐和抗真菌疾病,對于在植物保護中是否有應(yīng)用前景尚未見文獻報道,由于植物中感染真菌的部位存在于植物的根、葉、莖、果實、種子等具有細胞結(jié)構(gòu)的部位,若能將多烯大環(huán)類抗生素作用于這些部位,可能會有明顯的抗真菌效果。

      1.6 線性氨基多元醇類抗生素

      1994年,Siol-Suh等首次在UW85發(fā)酵液中分離出活性代謝產(chǎn)物Zwittermicin A,同年Manker報道了該物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式。Zwittermicin A是已知的唯一的氨基多元醇類抗生素,其純品呈無色粉末狀,能通過0.2 μm濾膜。

      Zwittermicin A溶于水,微溶于甲醇、吡啶,不溶于丙酮、乙腈、己烷。Zwittermicin A在純水中于210 nm處有特征吸收峰,在pH值為7.0時呈離子狀態(tài),比旋光度[α]D=+8.9。可與茚三酮縮合成藍紫色縮合物,與硝酸銀成正反應(yīng)[14]。對酸性磷酸酶、DNase、RNase和蛋白酶都不敏感。在酸性條件下能穩(wěn)定存在,在堿性條件下易水解。

      Zwittermicin A是由蘇云金芽孢桿菌(Bt)產(chǎn)生的一種新型廣譜抗生素,可抑制多種真核微生物和原核微生物,其中包括多種植物病原真菌和卵菌,并且與Bt毒素共同使用時能顯著提高蘇云金芽孢桿菌的殺蟲活性,可作為增效因子來提高蘇云金芽孢桿菌的防效,從而減少Bt毒素的用量、延緩抗性的產(chǎn)生、拓寬殺蟲譜,使蘇云金芽孢桿菌這一著名的生防菌在可持續(xù)農(nóng)業(yè)中發(fā)揮更大的作用[15~17]。國外對Zwittermicin A的研究已有十幾年的歷史,而國內(nèi)對其研究較少,特別是對其晶型的研究還未見文獻報道。

      1.7 其它

      氯霉素是早在1947年就由委內(nèi)瑞拉鏈霉菌[18]的發(fā)酵液提取到的一種具有旋光性質(zhì)的抗生素,易溶于低級醇和丙酮,微溶于水,不溶于苯和乙醚。對熱穩(wěn)定,在弱酸或中性溶液中穩(wěn)定,在堿性溶液中失效。20世紀60~70年代氯霉素曾作為防治水稻白葉病的主要藥劑之一,后因其它藥劑的開發(fā)及本身某些不足而逐漸減少應(yīng)用。20世紀90年代,氯霉素與其它藥劑混用在水稻白葉枯病的防治中取得很好的效果。2006年,Gamberini等[19]運用FTIR和DSC等分析技術(shù),發(fā)現(xiàn)了氯霉素棕櫚酸酯的三種晶型A、B、C,并闡明了不同晶型對其化學穩(wěn)定性、藥品劑型、溶解特性即對其生物利用度的影響,為氯霉素用于植物病菌防治提供了重要依據(jù)。

      林可霉素又名潔霉素,是由林可鏈霉菌林可變種產(chǎn)生的一種林可胺類堿性窄譜抗生素。能溶于甲醇、低級醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿等,微溶于水,以鹽的形式存在更穩(wěn)定。在作物改良方面,通過原生質(zhì)體融合并選擇胞質(zhì)鏈霉素抗性以轉(zhuǎn)移煙草的雄性不育性狀,或通過原生質(zhì)體融合轉(zhuǎn)移胞質(zhì)的抗林可霉素因子都取得了成功。楊梁等[20]制備并分析了鹽酸林可霉素的單晶Ⅰ、Ⅱ,發(fā)現(xiàn)晶型Ⅰ的溶出度快于晶型Ⅱ,為制定其在作物改良上的質(zhì)量標準提供了科學依據(jù)。

      2 抗生素的分離純化方法

      2.1 抗生素分離純化的意義

      抗生素是微生物的次級代謝產(chǎn)物,一般在微生物的發(fā)酵過程中產(chǎn)生。微生物在發(fā)酵時需要一定的營養(yǎng)物質(zhì),在發(fā)酵完成時會形成復雜的多相體系,因此發(fā)酵液中含有殘留的菌絲體、微生物細胞代謝產(chǎn)物、殘余的培養(yǎng)基等,雜質(zhì)含量很高,而目標抗生素含量很低,甚至是微量的。由于某些抗生素的化學結(jié)構(gòu)及理化性能非常相似,某些抗生素含有生理活性物質(zhì),極不穩(wěn)定,遇熱或遇酸堿等某些化學試劑易失活分解等原因,與一般的化學合成藥物相比,抗生素的分離純化工藝復雜、技術(shù)不成熟、生產(chǎn)成本高。因此,抗生素的分離純化工藝已成為抗生素產(chǎn)品能否符合質(zhì)量標準并且產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。

      2.2 抗生素的分離純化方法

      常用的抗生素分離純化方法有溶劑萃取法、沉淀法、結(jié)晶法、吸附法、離子交換法、色譜法、膜分離法、電泳分離法等。在分離純化抗生素時,可根據(jù)雜質(zhì)含量的多少和分離的難易程度,單獨或同時選用上述方法,以達到更好的效果。

      2.2.1 溶劑萃取法

      溶劑萃取法是利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配系數(shù)的不同,使溶質(zhì)選擇性地從一種溶劑轉(zhuǎn)移到另一種溶劑中而得到分離純化或濃縮的方法,是生物工業(yè)中一種重要的傳統(tǒng)分離提取方法,廣泛應(yīng)用于抗生素工業(yè)中。王印[21]將螺旋霉素的發(fā)酵液除去蛋白質(zhì),過濾,濾液于醋酸丁酯-水相中萃取,除去水相,醋酸丁酯提取液經(jīng)40 ℃、50%的無鹽水洗滌,靜置分層,放水至乳化層為白色為止,再經(jīng)水提2次,合并水提液并通過真空泵緩緩輸入托丁酯罐,過濾,結(jié)晶,真空干燥后得到螺旋霉素純品。

      近年來溶劑萃取法的萃取機制和方法不斷完善,相繼出現(xiàn)了許多新的萃取技術(shù)。其中超臨界CO2萃取技術(shù)在天然產(chǎn)物分離方面的應(yīng)用已經(jīng)在許多領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了工業(yè)化,雙水相萃取法和離子液體萃取法已在抗生素分離提純中得到了應(yīng)用。張詠梅等[22]用14%PEG4000-20%Na2HPO4對泰樂菌素的發(fā)酵液進行萃取,收率達到52.4%,省去了過濾的操作,減少了泰樂菌素的失活,純度明顯提高。茹靜[23]研究了疏水性離子液體[Bmim]PF6、[Omim]BF4作為萃取劑萃取紅霉素,提高了選擇性,使痕量的紅霉素得到了分離和富集。

      2.2.2 沉淀法

      沉淀法是指在抗生素試液中加入適宜的沉淀劑(如高濃度的鹽、有機溶劑、聚電解質(zhì)),使被測組分沉淀,或?qū)⒐泊娼M分沉淀,過濾后再改變條件使沉淀物重新溶解,從而達到分離純化的目的。酸性抗生素可以和有機堿反應(yīng)形成鹽而沉淀;堿性和兩性抗生素可以以不同種類的酸作為沉淀劑而沉淀;多肽類抗生素可用鹽析法使溶解度降低而沉淀。沉淀后的抗生素用水或稀酸溶液溶解,再用有機溶劑提取,最后經(jīng)過濃縮即可得所需抗生素。

      沉淀法用于抗生素的提純主要起濃縮的作用,純化效果較差,通常用于抗生素的初步提純,結(jié)合吸附法、色譜法等效果更佳。王國聯(lián)等[24]采用反應(yīng)沉淀法制備阿奇霉素藥物超微粉體,其方法是準確稱取阿奇霉素的原料藥溶于稀鹽酸中,用0.45 μm的濾膜過濾,在20 ℃、磁力攪拌條件下快速加入盛有0.08 mol·L-1NaOH溶液的燒杯中,反應(yīng)沉淀2 min,過濾,在60 ℃烘箱中干燥即得到阿奇霉素的超微粉體,純化效果較好。

      2.2.3 結(jié)晶法

      結(jié)晶法是先形成過飽和溶液(結(jié)晶的動力),然后加入晶種或攪拌使形成晶核,晶體生長后完成結(jié)晶,這些過程在時間上的順序可能不同,可以連續(xù)或兼顧進行。根據(jù)形成過飽和溶液的方式的不同,工業(yè)提純分離抗生素常用的結(jié)晶方法有蒸發(fā)結(jié)晶、化學反應(yīng)結(jié)晶、過飽和冷卻結(jié)晶和鹽(溶)析結(jié)晶等。

      蒸發(fā)結(jié)晶是使溶液在加壓、常壓或減壓條件下加熱蒸發(fā)除去一部分溶劑,從而形成過飽和溶液,以達到或維持溶液過飽和度,使晶核形成,晶體長大。此法適用于溶解度隨溫度變化不顯著的抗生素的結(jié)晶。化學反應(yīng)結(jié)晶法是通過調(diào)節(jié)溶液pH值或加入反應(yīng)劑使其發(fā)生化學反應(yīng)產(chǎn)生新的物質(zhì),其濃度超過溶解度而結(jié)晶。過飽和冷卻結(jié)晶法是使溶液冷卻降溫以維持一定的過飽和度,無需除去溶劑。此法適用于溶解度隨溫度降低而顯著減小的抗生素的分離純化。鹽(溶)析結(jié)晶法是通過向某物質(zhì)的飽和或不飽和體系中加入其它物質(zhì),使溶質(zhì)的溶解度降低形成過飽和溶液而結(jié)晶。Gamberini等[19]以氯仿作溶劑,蒸發(fā)結(jié)晶得氯霉素棕櫚酸酯晶型A;以乙醇和甲醇作溶劑,冷卻結(jié)晶得氯霉素棕櫚酸酯晶型B和C。

      2.2.4 吸附法

      吸附法是利用吸附劑與抗生素之間的分子力作用而將抗生素吸附在吸附劑上,達到分離除雜的目的。常用的吸附劑有活性炭、硅膠、大孔吸附樹脂等比表面積較大的物質(zhì)。與經(jīng)典的活性炭等吸附劑相比,大孔吸附樹脂具有選擇性好、機械強度大、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、可反復使用等優(yōu)點,近年來在微生物天然產(chǎn)物的分離提純中得到了普遍的應(yīng)用。

      大孔吸附樹脂適合于吸附水溶性或脂溶性的各種抗生素,其分離、提取、濃縮、純化等應(yīng)用基本涵蓋了抗生素的所有類型。王海燕等[25]用大孔樹脂HZ816分離純化那他霉素,調(diào)節(jié)那他霉素浸提液的pH值為7.0,采用中速1.5~2.5 BV·h-1(樹脂床體積)作為吸附的流速,然后用120 mL水、40%乙醇凈化后,用pH值為11的氫氧化鈉和80%乙醇的混合溶液進行洗脫(流速0.5 BV·h-1),再用1 mol·L-1HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至5.0~6.5,使那他霉素沉淀析出,冷卻靜置12 h,離心分離,用去離子水洗至中性,干燥,得那他霉素白色粉末,HPLC測得其含量為98.3%。

      2.2.5 離子交換法

      離子交換法[26]是利用離子交換劑與溶液中的離子之間發(fā)生交換反應(yīng),選擇性地將目的物質(zhì)吸附上去,再用適當?shù)南疵搫┫疵撓聛恚闺s質(zhì)與目的物質(zhì)分離的方法。某些天然物質(zhì)如泡沸石和煤經(jīng)過硫化制得的硫化煤可作為離子交換劑,目前應(yīng)用最多的是有機離子交換劑,即離子交換樹脂,是一類立體結(jié)構(gòu)的多孔高分子聚合物。

      抗生素含有多種化學基團,在強酸強堿條件下易失活,因此分離純化抗生素所用的離子交換樹脂主要為弱酸性陽離子交換樹脂和弱堿性陰離子交換樹脂。大孔離子交換樹脂以苯乙烯和丙烯酸為單體,加入二乙烯苯交聯(lián)劑,相互之間交聯(lián)聚合形成多孔骨架結(jié)構(gòu),在骨架上導入不同的化學活性基團而制成[27],是吸附性和篩選性相結(jié)合的分離材料。其本身的吸附特性和離子交換同時作用,再根據(jù)分子量的大小和離子的性質(zhì)選擇一定的溶劑洗脫,從而達到分離、純化、濃縮抗生素的目的。

      2.2.6 色譜法

      色譜法是基于被分離物質(zhì)分子在兩相(固定相和流動相)之間分配系數(shù)的微小差別所產(chǎn)生的不均勻分配進行分離的方法,是一種多級分離技術(shù)。當兩相進行相對移動時,被測物質(zhì)各個單一組分對兩相不同的親和力和兩相不均勻擴散的可能性導致其在固定相和移動相之間的不均勻分配,使原來微小的分配差異進一步擴大,各組分得到分離。常用于抗生素分離的色譜法有薄層色譜法、硅膠吸附柱色譜法和高效液相色譜法等。姚圓等[28]利用固相萃取-高效液相色譜-熒光檢測法分析了蔬菜中四環(huán)素類抗生素的含量,先對蔬菜樣品進行溶液超聲提取,再用高效液相色譜法對其進行了富集。

      2.2.7 膜分離法

      膜分離法是依據(jù)物質(zhì)分子尺度的大小,利用天然或人工合成的具有選擇透過性的薄膜,在外界能量或化學位差的推動作用下,對雙組分或多組分體系進行分離、分級、提純或富集,從而達到分離、提純和濃縮的目的。依據(jù)膜孔徑的不同,膜分離技術(shù)分為微濾、超濾[29]、納濾、反滲透和液膜等。

      不同膜分離技術(shù)具有不同的分離機理,在抗生素分離純化中體現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。如超濾法可在不使用破乳劑的情況下有效除去抗生素發(fā)酵液中起乳化作用的蛋白質(zhì)及其它大分子物質(zhì),消除乳化現(xiàn)象;反滲透法在室溫下就能分離、濃縮熱敏性的抗生素。與傳統(tǒng)工藝相比,膜分離法具有操作簡單、高效節(jié)能、可持續(xù)生產(chǎn)、無二次污染、常溫常壓下可操作等優(yōu)點。

      近年來液膜分離抗生素[30,31]的報道很多,膜分離技術(shù)作為新型的分離方法,在抗生素的分離純化中得到了廣泛的研究和應(yīng)用。Sahoo等[31]采用液膜技術(shù)從發(fā)酵液中分離頭孢菌素C,建立了兩相的界面處和膜相中的數(shù)學模型,并對其反應(yīng)時間、攪拌速度、載體濃度進行研究,實際測得的數(shù)據(jù)與數(shù)學模型一致。

      2.2.8 電泳分離法

      電泳分離法是利用物質(zhì)在電場的作用下,以不同的速度向電荷相反的方向移動的這一電化學差異分離純化抗生素的方法。帶電粒子的遷移率影響著電泳分離的效果,遷移率與物質(zhì)的電荷成正比,與質(zhì)量成反比,電荷越大,質(zhì)量越小,遷移率越大,正負離子的遷移方向相反最容易分離;由于電泳是在一定的電解質(zhì)溶液中進行的,所以電解質(zhì)的組成、溶液的粘度也會影響帶電粒子的遷移率。依據(jù)電泳分離的原理及其影響因素,通過改變電解質(zhì)的組成,可讓帶電粒子形成配合物或不帶電荷,便于分離。

      毛細管電泳法是近年來發(fā)展迅速的精制分離技術(shù)。毛細管電泳法以高壓電場為驅(qū)動力、以毛細管為分離通道,依據(jù)各組分間淌度和分配行為的差異而實現(xiàn)液相分離,具有簡單、高效、快速、環(huán)境污染少和易于自動化等顯著優(yōu)點[32],可用于分離純化微量物質(zhì)并一機多用,已成為與高效液相色譜法相媲美的分析科學的前沿技術(shù)。李志偉等[33]利用高效毛細管電泳方法測定頭孢地尼原料藥的含量,采用的分離電壓為20 kV、檢測波長為254 nm。

      3 結(jié)語

      植物用抗生素是微生物代謝的產(chǎn)物,毒性明顯低于化學農(nóng)藥,在植物體內(nèi)的半衰期短、效果好,對環(huán)境的污染小。我國植物用抗生素的研究始于20世紀50年代初期,近幾年來,這個領(lǐng)域的研究顯現(xiàn)出了誘人的前景,目前世界各國都已將植物用抗生素研究列入了國家重點規(guī)劃。但抗生素在植物保護中的研究與應(yīng)用要注意以下問題:

      (1)抗生素多晶現(xiàn)象的研究還處于初級階段,抗生素晶型對其在植物中的穩(wěn)定性、毒性和生物利用度的影響有必要深入研究。

      (2)在生產(chǎn)或貯存過程中,甚至因使用不當,抗生素可產(chǎn)生內(nèi)源性的雜質(zhì)而對植物產(chǎn)生藥害。

      (3)在醫(yī)用方面廣泛應(yīng)用的鏈霉素、氯霉素和土霉素等,曾被應(yīng)用于農(nóng)業(yè)上防治相關(guān)的作物病害,但直接使用會對作物產(chǎn)生病害,并存在穩(wěn)定性及抗藥性等問題,在植物保護中的研究越來越少。此外,某些抗生素對作物有藥害且使用量較大,已很少被研究使用。未來的研究需致力于找尋活性更高、毒性更低、對環(huán)境污染更小的新型植物用抗生素。

      (4)通常抗生素在極高的稀釋度下仍能選擇性地抑制或殺死微生物,因此,在尋找新的植物用抗生素的同時,必須合理適度地使用抗生素,避免濫用。

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