涂 毅,王瑋玥,張 弘,魏 凱,來晨剛,曹軍衛(wèi)
(武漢東湖學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院,湖北 武漢 430212)
由于石化塑料的難降解性,大量廢棄塑料流入自然界,造成嚴(yán)重的環(huán)境污染,而聚-β-羥丁酸(Poly-β-hydroxybutyrate,PHB)是一種在生態(tài)環(huán)境中能被完全降解為水和二氧化碳的生物材料,因此是一種可以替代石化塑料的理想的生物可降解塑料。PHB不僅可以用于輕工、化工、食品、農(nóng)業(yè)等現(xiàn)行的塑料應(yīng)用行業(yè),還可用于醫(yī)療衛(wèi)生、高新技術(shù)產(chǎn)品研制等領(lǐng)域。
自1926年首次發(fā)現(xiàn)PHB以來,各國(guó)學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了大量的研究,包括產(chǎn)生PHB的微生物,PHB的合成途徑、形成動(dòng)力學(xué)和機(jī)制,PHB的結(jié)構(gòu)、分子量及生物降解特性等多方面[1,2]。美、德、韓、奧地利等國(guó)都已廣泛開展PHB的研究[3,4]。國(guó)內(nèi)關(guān)于PHB研究的報(bào)道并不太多,上海有機(jī)所、中科院成都生物所、中科院微生物所、山東大學(xué)微生物系偶有PHB研究的信息[5~9]。能合成PHB的微生物分布極廣,包括自養(yǎng)和異養(yǎng)、光能和化能菌等,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)共計(jì)65個(gè)屬中的多個(gè)種,其中既有革蘭氏陰性菌,也有革蘭氏陽性菌[10~15]。
PHB的分子量一般為106Da,熔點(diǎn)為180 ℃,具有高結(jié)晶性、光學(xué)活性和壓電性質(zhì),是立體規(guī)整的聚合物。如果單體的碳鏈長(zhǎng)度增加,其柔韌性將會(huì)大大增強(qiáng),而熔點(diǎn)及結(jié)晶度下降。PHB作為塑料,最好具有60萬Da以上的分子量[16]。
神農(nóng)架林區(qū)是一個(gè)有著豐富微生物資源的地區(qū),本課題組從神農(nóng)架林區(qū)不同地點(diǎn)采集了多份土壤樣本,從中分離得到產(chǎn)生PHB的菌株,并探討了產(chǎn)PHB菌的最佳發(fā)酵條件,從而提高菌株的PHB積累量。
1.1.1 菌株
從神農(nóng)架林區(qū)采集的土樣中分離得到。
1.1.2 培養(yǎng)基
無氮培養(yǎng)基[17]:葡萄糖10 g,KH2PO40.2 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,NaCl 0.2 g,CaSO4·2H2O 0.2 g,CaCO35 g,蒸餾水1000 mL,pH值7.0,113 ℃滅菌30 min。
平板培養(yǎng)基[17]:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,瓊脂15~20 g,酵母膏 3 g,葡萄糖5 g,蒸餾水1000 mL,pH值7.0,121 ℃滅菌20 min。
種子培養(yǎng)基(g·L-1)[14]:酵母膏10,蛋白胨10,牛肉膏5,硫酸銨5,葡萄糖10,pH值7.0。
基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)[17]:蛋白胨5,酵母膏1,甘油5,葡萄糖5,pH值7.0,121 ℃滅菌20 min。
1.2.1 菌株的分離
將從神農(nóng)架林區(qū)采集的土樣分別標(biāo)記為1#、2#、3#、4#、5#、6#。每份土壤取少量加入50 mL的無菌生理鹽水,混勻,取10 mL上清液接入到無氮液體培養(yǎng)基中,30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)48 h。
用10倍稀釋法將上述PHB產(chǎn)生菌富集液稀釋后接種到平板上,于30 ℃培養(yǎng)1~2 d后,挑取單菌落,接種到種子培養(yǎng)基中活化,32 ℃培養(yǎng)24 h后,在235 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收值。然后接種到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中,32 ℃搖瓶培養(yǎng)144 h,不同時(shí)間取樣,測(cè)定生長(zhǎng)曲線和PHB產(chǎn)量。
1.2.2 PHB的測(cè)定
取發(fā)酵液12 000 r·min-1離心收集細(xì)胞,用氯仿水浴加熱后,離心,取上清液,真空抽干氯仿,白色顆粒即為PHB粗提物。
PHB粗提物中加入10 mL濃硫酸,100 ℃加熱10 min,冷卻后在235 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收值[17]。
1.2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化
采用L9(34)正交表,以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),設(shè)定碳源、氮源、pH值3因素3水平的9種不同配方配制培養(yǎng)基,32 ℃培養(yǎng)6 d,提取PHB后在235 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收值,確定產(chǎn)PHB菌的最適發(fā)酵條件。正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平見表1。
表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平
按照1.2.1方法,從2#、3#、4#土樣中均分離到了單菌落,挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng),重新編號(hào)為SNJD-3-Ⅰ、SNJD-3-Ⅱ、SNJD-3-Ⅲ。培養(yǎng)后分別提取PHB,在235 nm波長(zhǎng)處都有吸收值,證明分離得到的三株菌都是產(chǎn)PHB的菌株。
挑取待測(cè)菌株,接種到種子培養(yǎng)基中活化,32 ℃培養(yǎng)24 h后,按照培養(yǎng)基體積5%接種到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中,32 ℃搖瓶培養(yǎng)。從第3 d起每天取樣提取PHB,測(cè)定OD235值;同時(shí)取樣測(cè)定560 nm處培養(yǎng)基的吸光值,繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線和PHB產(chǎn)量的進(jìn)程曲線,結(jié)果見圖1。
圖1 三株菌的PHB產(chǎn)量及其生長(zhǎng)曲線
由圖1可知,SNJD-3-Ⅰ和SNJD-3-Ⅱ菌株的PHB產(chǎn)量在培養(yǎng)至第6 d時(shí)達(dá)到最大,此時(shí)菌株生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期,PHB的積累量達(dá)到最大,第7 d明顯下降。SNJD-3-Ⅲ菌株的生長(zhǎng)在第5 d之后進(jìn)入衰亡期,可能由于SNJD-3-Ⅲ菌的穩(wěn)定期很短,不到24 h。而在菌株已經(jīng)進(jìn)入衰亡期后,PHB的積累量還在不斷增加。
取生長(zhǎng)比較好的SNJD-3-Ⅰ菌株顯微鏡觀察,革蘭氏染色呈陽性,桿菌,并有芽孢產(chǎn)生,初步鑒定為芽孢桿菌屬。
取生長(zhǎng)比較好的SNJD-3-Ⅰ菌株進(jìn)一步研究。根據(jù)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基[17],碳氮比大約為2∶1,因此按比例確定氮源為0.5 g、碳源為1.0 g,定容到50 mL。
正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。
表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果
運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件分析表2數(shù)據(jù),繪制方差分析表,見表3。
表3 正交實(shí)驗(yàn)的方差分析
由表3可知,碳源、氮源、pH值3個(gè)因素中,氮源的P值<0.05,表明氮源的3個(gè)水平間有顯著差異,即氮源種類的選擇對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響。因此,根據(jù)各因素的最優(yōu)水平,確定SNJD-3-Ⅰ培養(yǎng)的最佳條件是:葡萄糖為碳源,蛋白胨為氮源,pH值為7.0。
在最佳條件下,32 ℃搖床培養(yǎng)6 d后提取PHB,測(cè)其OD235值為2.398,大于正交實(shí)驗(yàn)中9個(gè)不同培養(yǎng)條件下PHB的OD235值,說明在此最佳培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的菌株所積累的PHB的量最多,證明正交實(shí)驗(yàn)所優(yōu)化的結(jié)果確為SNJD-3-Ⅰ的最優(yōu)發(fā)酵條件。
對(duì)照PHB標(biāo)準(zhǔn)曲線來判斷PHB含量[18]。根據(jù)測(cè)得的最佳培養(yǎng)條件下的PHBOD235值(2.398), 計(jì)算得SNJD-3-Ⅰ菌株所積累的PHB量為14.72 g·L-1。
從神農(nóng)架林區(qū)采集的土樣中分離出了可以在細(xì)胞內(nèi)積累PHB的菌株,分析它們產(chǎn)生PHB的能力,并對(duì)其中3個(gè)菌株的生長(zhǎng)曲線和PHB產(chǎn)量進(jìn)行比較,其中SNJD-3-Ⅰ和SNJD-3-Ⅱ的PHB積累量都在第6 d達(dá)到最大,第7 d明顯下降,而SNJD-3-Ⅲ的PHB產(chǎn)量在生長(zhǎng)曲線出現(xiàn)明顯下降后仍呈上升趨勢(shì)。對(duì)SNJD-3-Ⅰ進(jìn)行革蘭氏染色,鏡檢觀察其為革蘭氏陽性菌,桿菌,并有芽孢產(chǎn)生,初步鑒定為芽孢桿菌屬。通過正交實(shí)驗(yàn)確定了SNJD-3-Ⅰ產(chǎn)PHB的最佳發(fā)酵條件,即以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)、葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源時(shí),控制碳氮比為2∶1,pH值7.0,32 ℃振蕩培養(yǎng)6 d,在該條件下所積累的PHB量為14.72 g·L-1。
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