魏 玲，李蘇宜，孫三元，袁保蘭，孫 麗

(1徐州市中心醫(yī)院，江蘇徐州 221009;2東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院)

Bmi-1基因廣泛表達(dá)于多種類型干細(xì)胞，參與造血干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新，高表達(dá) Bmi-1蛋白細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤中存在的腫瘤干細(xì)胞[1]。本研究通過免疫組化方法檢測 Bmi-1蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)，并探討其與食管鱗癌化療療效的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集徐州市中心醫(yī)院 2002～2008年保存的食管鱗癌石蠟標(biāo)本 30例，病例均經(jīng)病理學(xué)確診，術(shù)后均出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。給予鉑類藥物聯(lián)合方案化療，化療后完全緩解 +部分緩解 11例(CR+PR組)，穩(wěn)定 9例(SD組)，進(jìn)展 10例(PD組)。

1.2 方法 每個蠟塊取 4μm厚連續(xù)切片做免疫組化染色。先將切片置于二甲苯中脫蠟，乙醇梯度水化處理，檸檬酸緩沖液抗原煮沸修復(fù)，滴加鼠抗人Bmi-1單克隆抗體(1∶50，英國 Abcam公司)，37℃孵育1 h，滴加二步法免疫組化檢測試劑山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體(北京中杉公司)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇固定，封片、觀察。用 PBS代替一抗做陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷 Bmi-1蛋白陽性表達(dá)主要表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色或者棕褐色顆粒。高倍鏡下隨機(jī)取 4個不同的視野，計數(shù)細(xì)胞總數(shù)及核陽性細(xì)胞數(shù)，按陽性細(xì)胞所占的百分比計分。陽性細(xì)胞率≤10%為 1分，＞10% ～≤50%為 2分，＞50% ～≤75%為 3分，＞75%為 4分。同時，根據(jù)染色的強(qiáng)弱程度計分。陰性染色 1分，弱染色 2分，中等強(qiáng)度染色 3分，強(qiáng)染色 4分。根據(jù)陽性細(xì)胞率和染色強(qiáng)弱計分的乘積判斷結(jié)果:≤4為(-);＞4～≤8為(+);＞8～≤12為(++);＞12～≤16為(+++)。統(tǒng)計分析時(-)和(+)合計為陰性表達(dá)，(++)和(+++)合計為陽性表達(dá)。以上結(jié)果均至少由兩位病理科醫(yī)生以雙盲法觀察確定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 SPSS13.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)用 R×C表Fisher's Exact Test進(jìn)行分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Bmi-1蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá) Bmi-1蛋白陽性表達(dá)主要為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。Bmi-1蛋白在食管鱗癌標(biāo)本中的陽性表達(dá)率為23.3%(7/30)。

2.2 Bmi-1蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)與鉑類藥物聯(lián)合化療療效的關(guān)系 Bmi-1蛋白在 PR+CR組陽性表達(dá)率為 36.36%(4/11)，在 SD組陽性表達(dá)率為 11.11%(1/9)，在PD組陽性表達(dá)率為20.00%(2/10)。各組 Bmi-1蛋白陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，食管鱗癌 Bmi-1蛋白表達(dá)與鉑類藥物聯(lián)合化療療效無關(guān)。

3 討論

Bmi-1基因是一種致癌基因，屬于多巰基因家族成員，首次被提出是在 1991年轉(zhuǎn)基因鼠的淋巴瘤細(xì)胞傳代中，作為一種原癌基因與另一種癌基因 cmyc協(xié)同作用引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成[2]。高表達(dá)Bmi-1的細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤中存在的腫瘤干細(xì)胞。最近，Umar[3]研究認(rèn)為，腸干細(xì)胞存在于 Bmi-1陽性的腸隱窩。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞群體中具有部分干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群，其增殖能力明顯強(qiáng)于同一腫瘤組織中的其他癌細(xì)胞，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和維持中起十分重要的作用。腫瘤干細(xì)胞的概念第 1次被提出是在急性粒細(xì)胞白血病的研究中，認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是來自惡性白血病干細(xì)胞的異常造血組織。腫瘤中存在 ＜1%的腫瘤干細(xì)胞，它們通過分裂和增殖產(chǎn)生具有自身表型的子細(xì)胞及其分化細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞能夠分離出不同亞群并可顯示某一亞群具有高度的克隆能力則證實了這一假說。研究表明，腫瘤干細(xì)胞與腫瘤出現(xiàn)轉(zhuǎn)移、抗藥性的產(chǎn)生以及治療后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。Dirks[4]已經(jīng)報道，Bmi-1低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞有較低的侵襲性，因為它有較少的干細(xì)胞。目前新的研究證實，惡性腫瘤中存在腫瘤干細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞抵抗治療，導(dǎo)致治療失敗，使腫瘤復(fù)發(fā)[5]。Bmi-1在肺癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌等多種腫瘤中呈高表達(dá)，并且 Bmi-1的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的上調(diào)與腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)。覃麗在鼻咽癌的實驗中通過 Hoechst33258染色和流式細(xì)胞儀檢測顯示抑制內(nèi)源性 Bmi-1的表達(dá)能增加 5-Fu所誘導(dǎo)的凋亡效應(yīng)，Bmi-1干擾能增加鼻咽癌細(xì)胞對化療藥 5-Fu的敏感性;干擾 Bmi-1能顯著抑制 AKT的活性，上調(diào) Bax的表達(dá)并下調(diào)Bcl-2的表達(dá);Bmi-1干擾能通過 P13K/AKT途徑增加 5-Fu誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞的凋亡。在急性髓細(xì)胞性白血病研究中發(fā)現(xiàn)，Bmi-1基因的高表達(dá)不利于AML患者獲得良好的治療效果，提示 Bmi-1基因表達(dá)水平可以作為部分腫瘤患者療效預(yù)測指標(biāo)之一[6，7]。對肺癌患者的研究也證實，大量表達(dá)的Bmi-1基因產(chǎn)物不利于肺癌患者從化療中獲益[8]。Qin等[9]在鼻咽癌的研究中發(fā)現(xiàn)，低表達(dá) Bmi-1基因的腫瘤細(xì)胞對化療藥物 5-Fu敏感，該效應(yīng)與促進(jìn)5-Fu誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。上述研究提示Bmi-1干擾聯(lián)合化療藥物能提高化療敏感性，也就是說，高表達(dá) Bmi-1的腫瘤細(xì)胞易產(chǎn)生化療耐藥。

本研究結(jié)果顯示，Bmi-1蛋白表達(dá)與以鉑類藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療療效無相關(guān)性，Bmi-1蛋白不能成為預(yù)測化療敏感性的指標(biāo)，與以上有關(guān)研究結(jié)果不一致。由于本次實驗樣本例數(shù)少，Bmi-1表達(dá)與食管鱗癌化療敏感性的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

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