谷 蕾，呂喜英

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067000)

厄洛替尼是一種選擇性表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)，用于化療方案失敗的局部晚期或轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的二線治療。由于其不良反應(yīng)少、耐受性好，在肺癌的治療中日益受到關(guān)注。但由于最終幾乎所有患者都會(huì)產(chǎn)生耐藥，限制了其長(zhǎng)期療效［1］。厄洛替尼聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)含鉑一線化療方案不能額外改善生存率［2］，因此，需要找尋能提高腫瘤細(xì)胞對(duì)厄洛替尼敏感性、增強(qiáng)厄洛替尼抗腫瘤作用的方法。survivin蛋白是至今發(fā)現(xiàn)作用最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白(IAPs)。研究發(fā)現(xiàn)，survivin除能夠抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖外，還參與腫瘤細(xì)胞的耐藥［3］。2009年9月～2011年3月進(jìn)行本研究，旨在探討厄洛替尼聯(lián)合survivin siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的影響及對(duì)survivin基因的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 p53野生型肺癌細(xì)胞株A549由河北醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院提供;survivin siRNA、control siRNA-A、siRNA轉(zhuǎn)染試劑、siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基、鼠抗人survivin蛋白單克隆抗體、鼠抗人β-actin一抗均為Santa Cruz公司產(chǎn)品;羊抗鼠二抗購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白定量試劑盒為北京普利萊公司產(chǎn)品;Annexin V-EGFP購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;厄洛替尼購(gòu)于上海羅氏制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 將A549細(xì)胞接種在50 ml培養(yǎng)瓶中，用含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為5組:空白對(duì)照組:不進(jìn)行任何處理;control siRNA轉(zhuǎn)染組:轉(zhuǎn)染control siRNA-A(一種不針對(duì)20～25 nt siRNA設(shè)計(jì)的siRNA序列，作為特異基因轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照);survivin siRNA轉(zhuǎn)染組:轉(zhuǎn)染survivin siRNA;厄洛替尼處理組:加入厄洛替尼(12.5 μmol/L);survivin siRNA轉(zhuǎn)染+厄洛替尼處理組:轉(zhuǎn)染survivin siRNA并加入厄洛替尼。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及藥物處理 細(xì)胞以2×105/孔接種于6孔板中，至細(xì)胞融合約60% ～80%時(shí)，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別用survivin siRNA及陰性對(duì)照siRNA(即control siRNA-A)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立未轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞為空白對(duì)照組和厄洛替尼處理組。轉(zhuǎn)染后6 h換液，各組分別加入含或不含厄洛替尼(12.5 μmol/L)的10%新生牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，1 500 r/min離心10 min，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml，取2×105個(gè)細(xì)胞，分別加入Annexin V-EGFP 3 μl、PI 5 μl、Buffer 400 μl，室溫避光反應(yīng)15 min后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)各組細(xì)胞存活率。

1.2.4 Western blot法檢測(cè) survivin 蛋白的表達(dá)用含有PMSF的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。取等量蛋白上樣，12%SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，加入一抗(鼠抗人survivin一抗1∶100，鼠抗人 β-actin一抗1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜，加二抗(羊抗鼠二抗1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜，化學(xué)熒光法顯色，暗室曝光顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。圖像用灰度掃描軟件BandScan 4.5進(jìn)行灰度分析，用survivin蛋白灰度值與β-actin灰度值比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，進(jìn)行單因素方差分析及2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析，組間比較采用q檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 空白對(duì)照組、control siRNA轉(zhuǎn)染組、厄洛替尼處理組、survivin siRNA轉(zhuǎn)染組、survivin siRNA轉(zhuǎn)染+厄洛替尼處理組細(xì)胞凋亡率分別為(0.860 ±0.606)%、(3.763 ±1.172)%、(48.913 ±1.221)%、(22.513 ±0.975)%、(54.618±1.644)%。與空白對(duì)照組及control siRNA轉(zhuǎn)染組相比，survivin siRNA轉(zhuǎn)染組、厄洛替尼處理組及survivin siRNA+厄洛替尼處理組細(xì)胞凋亡均明顯增加(P均＜0.05)，survivin siRNA轉(zhuǎn)染與厄洛替尼聯(lián)合作用較二者單獨(dú)作用細(xì)胞凋亡更加明顯(P均＜0.05)。

2.2 survivin蛋白表達(dá)結(jié)果 空白對(duì)照組、control siRNA轉(zhuǎn)染組、survivin siRNA轉(zhuǎn)染組、厄洛替尼處理組、survivin siRNA+厄洛替尼處理組的survivin蛋白灰度值/β-actin灰度值分別為0.988±0.016、0.953 ±0.025、0.687 ±0.049、0.559 ±0.054、0.405±0.029。與空白對(duì)照組及control siRNA轉(zhuǎn)染組相比，survivin siRNA轉(zhuǎn)染組、厄洛替尼處理組及survivin siRNA+厄洛替尼處理組survivin蛋白的表達(dá)均受到抑制(P均＜0.05)，survivin siRNA轉(zhuǎn)染與厄洛替尼聯(lián)合作用較二者單獨(dú)作用對(duì)survivin蛋白表達(dá)的抑制作用更明顯(P均＜0.05)，空白對(duì)照組與control siRNA轉(zhuǎn)染組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

survivin蛋白是IAPs家族中分子量最小的成員，研究表明survivin蛋白在包括肺癌在內(nèi)的多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而在相應(yīng)正常組織中不表達(dá)。在肺癌組織中survivin高水平表達(dá)與腫瘤分級(jí)分期高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯密切相關(guān)［4，5］。由于其表達(dá)的特異性及對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的雙重作用，使其成為肺癌基因診斷、治療和預(yù)后研究的理想靶目標(biāo)。并且，大量研究顯示survivin參與腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制［6，7］。厄洛替尼是屬于口服的酪氨酸激酶拮抗劑，通過(guò)阻斷NSCLC細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖過(guò)程中的某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮其抗腫瘤作用。但是近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，EGFR突變與NSCLC對(duì)此類EGFRTKI的敏感性有關(guān)，限制了其臨床應(yīng)用，耐藥的產(chǎn)生也限制了其長(zhǎng)期療效。

研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的抗凋亡作用主要是通過(guò)誘導(dǎo)survivin在內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的［2］。VEGF是調(diào)節(jié)血管生成最主要的生長(zhǎng)因子之一，并且受EGFR調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用厄洛替尼處理后的A549細(xì)胞較未經(jīng)處理的正常A549細(xì)胞凋亡增加，survivin蛋白的表達(dá)水平明顯降低，其機(jī)制可能是厄洛替尼競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合EGFR使EGFR對(duì)VEGF的調(diào)控能力降低，從而降低了VEGF導(dǎo)致的survivin高表達(dá);survivin在細(xì)胞G2/M期呈高表達(dá)，應(yīng)用厄洛替尼后可使癌細(xì)胞阻滯于 G1期［8］，不能進(jìn)入survivin高表達(dá)的 G2/M期，從而降低survivin蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。survivin siRNA轉(zhuǎn)染和厄洛替尼聯(lián)合作用時(shí)較厄洛替尼單獨(dú)作用對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用更明顯，證明通過(guò)轉(zhuǎn)染survivin siRNA沉默survivin的表達(dá)可增加細(xì)胞對(duì)厄洛替尼的敏感性，可能是上述作用與survivin siRNA特異性抑制survivin表達(dá)共同作用的結(jié)果。本研究還發(fā)現(xiàn)，survivin siRNA轉(zhuǎn)染和厄洛替尼處理兩種因素存在交互作用，并且表現(xiàn)為拮抗作用，二者的相互作用有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為提高厄洛替尼對(duì)NSCLC的治療效果帶來(lái)了新希望，為臨床提供了新的治療NSCLC的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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