熊 雁，龔 濱，王子明，杜全印，王愛民

隨著社會(huì)的現(xiàn)代化進(jìn)程和人口的老齡化，由于退變引起的骨性關(guān)節(jié)炎中軟骨缺損的患者顯著增多，因此如何解決關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的問題日益顯得重要。關(guān)節(jié)軟骨屬于透明軟骨，軟骨細(xì)胞是高度分化的組織細(xì)胞，成熟的關(guān)節(jié)軟骨中軟骨細(xì)胞的分裂能力非常有限，因此軟骨損傷后修復(fù)能力差［1］。

最近多個(gè)研究表明:在骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨中，做為轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)調(diào)節(jié)因子的核心蛋白聚糖(decorin，DCN)的mRNA含量增加，DCN的蛋白含量減少，而且DCN的分解片段隨年齡增加而增加［2－4］。這些結(jié)果提示，在骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨修復(fù)過程中，DCN可能起到重要的修復(fù)作用。因此，我們建立了大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨缺損的模型，觀察DCN對(duì)軟骨缺損修復(fù)的作用。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

清潔級(jí)SD(Sparague－Dawley)大鼠30只，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄不限，體重(150±10)g，常規(guī)飼養(yǎng)1周后，用于實(shí)驗(yàn)。木瓜蛋白酶(papain)、DCN、TGF均購于Sigma公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型的建立 取10只SD大鼠，用4%的木瓜蛋白酶20U分別于第1、4、7天注射進(jìn)SD大鼠膝關(guān)節(jié);建立骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型。右手抓住大鼠頸部皮膚和尾部，行1%氯胺酮(l00mg/kg)腹腔麻醉后，將實(shí)驗(yàn)鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，用刀片將手術(shù)區(qū)域及周圍皮毛剃凈，濕紗布洗凈，然后分別用碘酒、乙醇消毒右后膝關(guān)節(jié)，術(shù)者戴手套，鋪無菌洞巾，右膝關(guān)節(jié)微屈，50μl微量注射器在髕骨下方進(jìn)針，針尖向中、向上傾斜穿刺進(jìn)入關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物。左膝關(guān)節(jié)腔注射生理鹽水20μl作為對(duì)照。

注射后第2、4周各隨機(jī)挑選5只大鼠斷頭法處死，處死后在膝關(guān)節(jié)外約0.5cm處用銳利器械切斷，小心取出關(guān)節(jié)標(biāo)本，10%多聚甲醛固定，將固定好的標(biāo)本放入磷酸鹽緩沖液(PBS)配制的0.5mol/L的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)溶液(pH 7.8)中脫鈣30天，中間更換脫鈣液1次，脫鈣完全后用手術(shù)刀片取材，垂直于關(guān)節(jié)軟骨面切開，切成1.0cm×0.5cm×0.2cm，自動(dòng)脫水機(jī)梯度脫水，石蠟包埋，常規(guī)病理切片，5μm連續(xù)切片。常規(guī)脫蠟脫水后，蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察軟骨情況，明確骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的建成。

2.2 動(dòng)物分組實(shí)驗(yàn) 4周后，把剩下20只SD大鼠隨機(jī)分成2組，每組10只大鼠，右側(cè)膝關(guān)節(jié)腔第1、4、7天注射相應(yīng)的試劑:(1)核心蛋白聚糖(DCN)組(100μl，0.1mg/ml)，作為實(shí)驗(yàn)組;(2)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)組(100μl，0.1mg/ml)，作為治療對(duì)照組。左膝關(guān)節(jié)為生理鹽水組，作為空白對(duì)照。

2.3 軟骨修復(fù)情況檢測(cè) 動(dòng)物分別在注射試劑后2周和4周處死，膝關(guān)節(jié)標(biāo)本整體取下行大體觀察后固定，行HE染色。據(jù)國際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)(International Cartilage Repair Society，ICRS)規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分［5－6］。ICRS評(píng)分項(xiàng)目是:關(guān)節(jié)軟骨表面、基質(zhì)、細(xì)胞分布、活力細(xì)胞數(shù)量、軟骨下骨、軟骨礦化情況。

3 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié) 果

1 動(dòng)物模型的建立

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無意外死亡，動(dòng)物模型建立成功。注射木瓜蛋白酶后第2周，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)側(cè)關(guān)節(jié)有較明顯腫脹，關(guān)節(jié)活動(dòng)靈活性降低，步態(tài)輕度異常;第4周活動(dòng)頻次較第2周稍增多，活動(dòng)基本正常，步態(tài)基本正常，實(shí)驗(yàn)側(cè)關(guān)節(jié)腫脹不明顯。肉眼大體觀察兩組標(biāo)本，第2周實(shí)驗(yàn)側(cè)關(guān)節(jié)較對(duì)照側(cè)，邊緣軟骨表面局部小區(qū)域有輕度剝脫，光滑度降低。第4周實(shí)驗(yàn)側(cè)關(guān)節(jié)較對(duì)照側(cè)，軟骨表面局部區(qū)域有剝脫，光滑度明顯降低。

光鏡下觀察，正常對(duì)照側(cè)組織學(xué)觀察見關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)正常，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑連續(xù)，基質(zhì)透明，細(xì)胞分布呈柱狀，活力細(xì)胞占大多數(shù)，軟骨下骨正常，軟骨礦化正常。木瓜蛋白酶作用2周后見骨層清晰，但關(guān)節(jié)軟骨表面不連續(xù)，基質(zhì)透明，細(xì)胞分布呈柱狀，活力細(xì)胞開始下降，軟骨下骨正常，軟骨礦化正常;作用4周后見骨層不清晰，關(guān)節(jié)軟骨表面不規(guī)則，基質(zhì)混雜，細(xì)胞分布呈柱狀，活力細(xì)胞明顯下降，軟骨下骨重塑增加，軟骨礦化局部不規(guī)整。

2 大體觀察

肉眼大體觀察，試劑注射后2周，TGF組、DNC組實(shí)驗(yàn)側(cè)關(guān)節(jié)較對(duì)照側(cè)局部缺損區(qū)均有輕度修復(fù)，光滑度好轉(zhuǎn)，其余未見明顯差異。試劑注射后4周2組對(duì)照側(cè)均比實(shí)驗(yàn)側(cè)軟骨表面局部區(qū)域剝脫更明顯，光滑度降低，實(shí)驗(yàn)側(cè)軟骨表面修復(fù)明顯，光滑度明顯好于對(duì)照側(cè)。

3 組織學(xué)觀察

模型建立后，試劑注射術(shù)后2周光鏡下觀察，DCN組實(shí)驗(yàn)側(cè)比對(duì)照側(cè)，關(guān)節(jié)軟骨表面較光滑連續(xù)，但是在基質(zhì)、細(xì)胞分布、軟骨下骨、軟骨礦化等方面的差異ICRS評(píng)分均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TGF組實(shí)驗(yàn)側(cè)比對(duì)照側(cè)，關(guān)節(jié)軟骨表面更光滑連續(xù)，其ICRS評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05(表1，圖1～4)。

試劑注射術(shù)后4周光鏡下觀察，DCN組實(shí)驗(yàn)側(cè)比對(duì)照側(cè)，關(guān)節(jié)軟骨表面更光滑連續(xù)，基質(zhì)更透明，細(xì)胞分布成簇較少，軟骨下骨重塑好，各項(xiàng)ICRS評(píng)分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，但軟骨礦化的差異ICRS評(píng)分無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TGF組與DCN組的結(jié)果相似，但是TGF組實(shí)驗(yàn)側(cè)的軟骨基質(zhì)層改變更厚(表2，圖5～8)。

表1 注射術(shù)后2周兩組ICRS組織學(xué)評(píng)分(n=5，±s)

表1 注射術(shù)后2周兩組ICRS組織學(xué)評(píng)分(n=5，±s)

與對(duì)照組相比:*P＜0.05

組別 關(guān)節(jié)表面 基質(zhì) 細(xì)胞分布 活力細(xì)胞數(shù)量 軟骨下骨 軟骨礦化DCN組實(shí)驗(yàn)側(cè)3.0±0 2.2±0.4 2.4±0.5 3.0±0 2.6±0.4 3.0±0 DCN組對(duì)照側(cè) 1.2±1.6 1.4±0.5 1.6±0.5 2.2±1.1 2.6±0.5 2.4±1.3 TGF組實(shí)驗(yàn)側(cè) 3.0±0* 2.2±0.4 2.4±0.5 3.0±0 2.8±0.4 3.0±0 TGF組對(duì)照側(cè) 0.6±1.3 1.8±0.4 1.6±0.5 2.6±0.9 2.6±0.5 2.4±1.3

表2 注射術(shù)后4周兩組ICRS組織學(xué)評(píng)分(n=5，±s)

表2 注射術(shù)后4周兩組ICRS組織學(xué)評(píng)分(n=5，±s)

與對(duì)照組相比:*P＜0.05

組別 關(guān)節(jié)表面 基質(zhì) 細(xì)胞分布 活力細(xì)胞數(shù)量 軟骨下骨 軟骨礦化DCN組實(shí)驗(yàn)側(cè) 3.0±0 2.8±0.4* 2.8±0.4* 3.0±0* 2.8±0.4*3.0±0 DCN組對(duì)照側(cè) 0.6±1.3 1.4±0.5 1.2±0.4 1.0±0 2.0±0 1.2±1.6 TGF組實(shí)驗(yàn)側(cè) 3.0±0* 3.0±0* 2.8±0.4* 3.0±0* 2.8±0.4* 3.0±0 TGF組對(duì)照側(cè) 0.6±1.3 1.4±0.5 1.4±0.5 1.4±0.9 1.8±0.4 1.8±1.6

圖1 注射2周后DCN實(shí)驗(yàn)側(cè)組織學(xué)(HE×100)

圖3 注射2周后TGF實(shí)驗(yàn)側(cè)組織學(xué)(HE×100)

圖4 注射2周后TGF對(duì)照側(cè)組織學(xué)(HE×100)

圖5 注射4周后DCN實(shí)驗(yàn)側(cè)組織學(xué)(HE×100)

圖6 注射4周后DCN對(duì)照側(cè)組織學(xué)(HE×100)

圖7 注射4周后TGF實(shí)驗(yàn)側(cè)組織學(xué)(HE×100)

圖8 注射4周后TGF對(duì)照側(cè)組織學(xué)(HE×100)

討 論

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)又稱退行性骨關(guān)節(jié)炎(degenerative arthritis)是最常見的關(guān)節(jié)疾病，在美國50歲以上的人口中，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率居全部病種中的第2位，而在美國65歲以上有影像學(xué)異常的人群中，骨關(guān)節(jié)炎約占70%［1］。隨之而來，全球范圍內(nèi)由于骨關(guān)節(jié)炎帶來的醫(yī)療負(fù)擔(dān)大幅增長。因此，探討OA的病理過程，明確軟骨破壞及修復(fù)的機(jī)制，對(duì)于OA的防治具有重大的社會(huì)意義。

1 動(dòng)物模型

制作骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的方法很多，主要有Hulth模型手術(shù)法、關(guān)節(jié)制動(dòng)法、藥物注射法等。本實(shí)驗(yàn)采用關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶的方法復(fù)制骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型。許多研究表明，骨關(guān)節(jié)炎軟骨最早期發(fā)生的顯著的變化之一是蛋白多糖減少，而木瓜蛋白酶可以分解軟骨基質(zhì)中的蛋白多糖，使其從軟骨中丟失，因此木瓜蛋白酶這種造模方法與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程類似，是研究OA比較好的方法。有研究表明:木瓜蛋白酶在成年兔、豚鼠的膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射后可引起骨關(guān)節(jié)炎，且骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生時(shí)間短，重復(fù)性好［7］。

2 軟骨修復(fù)過程中DCN的作用

DCN是富含亮氨酸的小分子蛋白聚糖家族(small leucine rich proteoglycans，SLRP)中的一員，主要分布在骨、軟骨、肌腱、鞏膜等結(jié)締組織，屬于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。由于電鏡下顯示其在膠原網(wǎng)絡(luò)中能夠修飾膠原纖維，故又稱為飾膠蛋白聚糖。正常關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，呈現(xiàn)藍(lán)白色，由軟骨基質(zhì)和鑲嵌在軟骨基質(zhì)陷窩內(nèi)的軟骨細(xì)胞組成，軟骨基質(zhì)由膠原纖維、蛋白聚糖和水分構(gòu)成。蛋白聚糖鑲嵌于膠原纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，在關(guān)節(jié)軟骨受擠壓時(shí)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的水分?jǐn)D出，而在休息時(shí)又可從關(guān)節(jié)滑液中吸收水分，并使軟骨細(xì)胞獲得營養(yǎng)。正常情況下，軟骨細(xì)胞分泌合成的軟骨基質(zhì)和軟骨基質(zhì)的降解保持平衡，使得關(guān)節(jié)軟骨光滑有彈性，可發(fā)揮保護(hù)、減輕震蕩和減少摩擦等重要生理作用。

另一方面，多個(gè)研究表明:在骨性關(guān)節(jié)炎患者中，TGF-β的過多表達(dá)或者是表達(dá)減少都和骨性關(guān)節(jié)的發(fā)展相關(guān)［8］。因此，維持TGF-β的表達(dá)水平的平衡是維持關(guān)節(jié)軟骨代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。DCN作為ECM組分對(duì)TGF-β功能起重要反饋調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制可能是:(1)DCN通過其核心蛋白與TGF-β1結(jié)合，將該因子結(jié)合到ECM(作為其貯存庫)，調(diào)節(jié)TGF-β1利用度;(2)TGF-β1-decorin復(fù)合物通過識(shí)別DCN的受體被細(xì)胞內(nèi)吞而控制TGF-β1的穩(wěn)定水平;(3)DCN與TGF-β1結(jié)合可以直接中和其活性。因此理論上，DCN可以與TGF-β的相互作用，維持TGF-β的表達(dá)水平的平衡，修飾膠原纖維成熟，達(dá)到穩(wěn)定軟骨膠原、修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的作用［8－9］。

最近多個(gè)研究表明:在OA患者的關(guān)節(jié)軟骨中，DCN的mRNA含量增加，DCN的蛋白含量減少，而且DCN的分解片段隨年齡增加而增加［2－4］。這些結(jié)果提示:在OA患者的軟骨修復(fù)過程中，DCN可能起到重要的修復(fù)作用。我們的初步形態(tài)學(xué)研究提示:在大鼠模型中，DCN能促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎模型中軟骨表面更加光滑，基質(zhì)更透明。因此，DCN對(duì)于軟骨表面的修復(fù)能起到良好的效果，其機(jī)制可能是通過對(duì)TGF-β調(diào)節(jié)及膠原的穩(wěn)定起到作用，但需進(jìn)一步研究。因此，探討DCN修復(fù)骨性關(guān)節(jié)炎中軟骨缺損的機(jī)制，可能將為臨床上骨關(guān)節(jié)炎患者的治療提供新的策略。

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