荔枝核提取液抗小鼠體內(nèi)FM1流感病毒的作用

李 偉 朱宇同 黃真炎 何家靖 裴 晶 宋健平

廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405

荔枝核為無(wú)患子科植物荔枝 (Litchi chinensis Sonn.)的干燥成熟種子，主產(chǎn)于我國(guó)廣東、廣西、福建、四川和臺(tái)灣等地區(qū)［1］。又名荔仁、荔核、大荔核。其味甘、澀、微苦，性溫，歸肝、腎經(jīng)。具有行氣散結(jié)、祛寒止痛的作用。近年來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道荔枝核有抗乙肝病毒、保肝、降血糖、調(diào)血脂、抗氧化等作用［2］。水提取物及黃酮類化合物體外實(shí)驗(yàn)證明對(duì)乙型肝炎病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒有明顯的抑制作用［3－6］。但目前筆者尚未見國(guó)內(nèi)外有荔枝核提取液在體內(nèi)抗流感病毒作用的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究荔枝核黃酮類提取液體內(nèi)抗鼠肺適應(yīng)株FM1甲1型流感病毒的作用，并對(duì)其進(jìn)行了初步探討。

1 材料

1.1 動(dòng)物 NIH小鼠，雌雄各半，體重14－16 g，SPF級(jí)，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào):SCXK(粵)2008－0002。飼養(yǎng)環(huán)境:室溫為23±2℃，相對(duì)濕度為75±10%，用標(biāo)準(zhǔn)鼠料及水飼養(yǎng)。

1.2 毒種 甲1型H1N1流感病毒FM1鼠肺適應(yīng)株，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，經(jīng)雞胚尿囊腔傳代增強(qiáng)毒力后，測(cè)定其半數(shù)致死量LD50=10－3.7。

1.3 藥物 荔枝核提取液，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)青蒿中心藥學(xué)研究室提取配制。利巴韋林 (Ribavirin)，廣東肇慶星湖生物化學(xué)制藥廠，批號(hào):L051075。

2 方法

2.1 半數(shù)致死量的測(cè)定 病毒經(jīng)過11日齡雞胚傳代1次，測(cè)定尿囊液中病毒效價(jià)為1:160，以10倍遞減稀釋成10－1，10－2，10－3，10－4，10－5，10－6，分別滴 0.05mL 感染小鼠，每組5只，逐日觀察記錄動(dòng)物死亡數(shù)，24h內(nèi)死亡者不計(jì);直至感染后14d為止，死亡小鼠解剖觀察肺臟病理變化，以確定其死亡由于流感病毒感染所致。用Reed－Muench 法［7］計(jì)算其 LD50 為 10－4.5。

2.2 荔枝核提取液對(duì)流感病毒所致小鼠死亡的保護(hù)作用

取NIH小鼠80只，體重14～16g，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組16只。第1組為正常對(duì)照組、第2組為病毒對(duì)照組，第3組為利巴韋林陽(yáng)性藥物組，第4～5組分別為荔枝核高、低2個(gè)劑量組。各組動(dòng)物于感染前一天開始灌胃給藥，每天1次，給藥10d，利巴韋林組給予藥物0.075g/kg，荔枝核高、低劑量組分別按照劑量為0.3g生藥/kg，0.1g生藥/kg給藥，正常對(duì)照組和病毒對(duì)照組分別灌胃等體積蒸餾水。于給藥第2d，將小鼠 (第1組除外)在乙醚輕度麻醉下接種8LD50的流感病毒0.05mL/只。連續(xù)觀察14d，記錄小鼠死亡數(shù) (接種病24h內(nèi)死亡的小鼠不記入死亡數(shù)中)，為死亡者于第15d處死解剖，計(jì)算死亡率、死亡保護(hù)率、生命延長(zhǎng)率，平均存活時(shí)間。

2.3 對(duì)小鼠流感病毒肺炎的抑制作用 將小鼠按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組、病毒對(duì)照組、利巴韋林組、荔枝核高、低劑量組，共5組，每組10只，雌雄各半。利巴韋林組，荔枝核高低劑量組，給予相應(yīng)劑量藥物，分別為0.075g/kg、0.3g/kg、0.1g/kg，正常對(duì)照組、病毒對(duì)照組給予等體積蒸餾水，除正常對(duì)照組外，其它各組小鼠在乙醚輕度麻醉下，以15LD50病毒液滴鼻感染，每鼠0.05mL。于感染前一天開始灌胃給藥，每天1次，每次0.1 mL/10g，連續(xù)5 d。于第6 d禁食4 h，小鼠稱重，頸椎脫臼處死，解剖取肺臟，用生理鹽水洗凈，并用干凈濾紙吸掉殘余鹽水，稱重，計(jì)算肺指數(shù)及肺指數(shù)抑制率。

2.4 荔枝核提取液對(duì)小鼠肺炎治療作用的光鏡觀察 取2.3中各組別小鼠肺組織，10%甲醛固定，石蠟包埋，5μm切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察。

2.5 荔枝核提取液對(duì)小鼠肺炎治療的透射電鏡法觀察 取2.3中各組別小鼠肺組織，立即浸泡于2.5%戊二醛固定液中進(jìn)行前固定，用1%鋨酸進(jìn)行后固定，按電鏡制作樣要求進(jìn)行脫水、滲透、包埋、聚合，U1tracut E超薄切片機(jī)切片醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色，JEM－1200EX透射電鏡觀察。

3 結(jié)果

3.1 荔枝核提取液對(duì)流感病毒FM1株所致小鼠的死亡保護(hù)作用 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，小鼠感染病毒后出現(xiàn)聳毛、蜷縮、毛無(wú)光澤、活動(dòng)減少、體重減輕的狀態(tài)，大多于第七日開始死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)X2分析，見表1。

表1 荔枝核提取液對(duì)小鼠體內(nèi)感染病毒的死亡保護(hù)作用

結(jié)果表明正常組無(wú)小鼠死亡，其余各組均有小鼠死亡，且模型組小鼠死亡最多 (P＜0.05);利巴韋林及荔枝核高、低劑量組死亡率均顯著低于模型組 (P＜0.05)。該結(jié)果提示荔枝核提取液在小鼠體內(nèi)有一定的抗流感病毒FM1株的作用。

表2 荔枝核提取液對(duì)小鼠流感病毒性肺炎的影響 (±s)

表2 荔枝核提取液對(duì)小鼠流感病毒性肺炎的影響 (±s)

注:經(jīng)計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS 11.0方差分析，與病毒對(duì)照組相比，*P ＜0.05;＊＊P ＜0.01。

組別 劑量g/kg n 肺指數(shù)均數(shù) 肺指數(shù)抑制率 (%——病毒對(duì)照 —— 10 1.433±0.496 ——利巴韋林 0.075 10 0.871±0.128＊＊39.2荔枝核高劑量 0.3 10 0.930 ±0.265*35.1荔枝核低劑量 0.1 10 0.947 ±0.149＊＊)正常對(duì)照 —— 10 0.667±0.040 33.9

3.2 荔枝核提取液對(duì)流感病毒FM1株所致小鼠的肺炎的抑制作用 由實(shí)驗(yàn)可知，與病毒對(duì)照組相比，利巴韋林及荔枝核高、低劑量組肺指數(shù)明顯較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果表明，荔枝核提取液能顯著改善小鼠感染的甲1型流感病毒的肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率，對(duì)FM1病毒感染的肺炎具有一定的抑制作用。見表2。

3.3 荔枝核提取液對(duì)小鼠肺炎治療作用的光鏡觀察結(jié)果

小鼠肺組織HE染色光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常組小鼠肺組織中肺泡正常 (圖2)病毒對(duì)照組中，可見大量小鼠肺泡充血，白細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象 (圖2)陽(yáng)性照藥物利巴韋林組0.075 g/kg，荔枝核提取液高低劑量組0.3 g/kg、0.1 g/kg，的小鼠肺組織切片中，雖可見肺泡充血和白細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，但與病毒對(duì)照組相比有明顯改善 (圖3－5)。(HE staining×250)

3.4 荔枝核提取液對(duì)小鼠肺炎治療作用的透射電鏡觀察結(jié)果 電鏡觀察結(jié)果表明，正常對(duì)照組肺細(xì)胞未發(fā)生形態(tài)學(xué)改變 (圖1)，病毒對(duì)照組鼠肺細(xì)胞，多處肺泡壁表面有大量流感病毒，從切片中觀察到流感病毒在肺組織細(xì)胞中的繁殖與釋放，大量病毒顆粒的縱切面與橫切面可見病毒表面的纖切亞單位，病毒所在部位的肺組織細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞膜增厚或模糊不清 (圖2);而陽(yáng)性藥物利巴韋林組0.075g/kg，及荔枝核提取液高低劑量組0.3g/kg、0.1g/kg治療后的肺細(xì)胞雖可見部分流感病毒顆粒，但與病毒組相比病毒顆粒明顯減少且細(xì)胞膜沒有明顯增厚現(xiàn)象 (圖3－5)。

4 討論

流感是以流感病毒為病原體的一種常見傳染病，甲型流感病毒又可根據(jù)16個(gè)血凝素 (Hema1utinin，H A)和9個(gè)神經(jīng)氨酸苷酶 (Neuraminidase，N A)組合成不同亞型，均具有抗原性［8］。其危害主要在于流感嚴(yán)重的并發(fā)癥，常危及嬰幼兒、老年人及免疫功能低下者的生命。因此結(jié)合中醫(yī)理論利用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究開發(fā)中草藥，對(duì)于防治流感及其并發(fā)癥的發(fā)生，減少因流感所致的死亡具有重要的意義。

荔枝核又名大荔核，具有行氣散結(jié)、祛寒止痛，抗病毒的作用，是我國(guó)南方常見的藥物，其抗病毒作用是多種化學(xué)成分綜合作用的結(jié)果。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)荔枝核抗病毒實(shí)驗(yàn)做了大量研究，有關(guān)荔枝核體外抗呼吸道合胞病毒及體外抗單純皰疹病毒作用的研究表明荔枝核黃酮類化合物在Hep－2細(xì)胞中對(duì)呼吸道合胞病毒和單純皰疹病毒1型有明顯的抑制作用［9］。

為此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行荔枝核提取液抗流感病毒效果的初步探討，結(jié)果表明荔枝核提取液對(duì)小鼠病毒性肺炎的發(fā)生具有明顯的預(yù)防保護(hù)作用。適當(dāng)劑量的荔枝核提取液可以降低流感病毒感染導(dǎo)致的小鼠死亡率或延長(zhǎng)感染小鼠的平均存活時(shí)間，減輕流感病毒感染小鼠肺部病變的程度，且電鏡與光鏡顯微觀察結(jié)果也證實(shí)了這點(diǎn)。然而將荔枝核提取液在本實(shí)驗(yàn)高劑量的基礎(chǔ)上加大劑量，觀察其對(duì)肺炎的抑制作用，結(jié)果提示劑量提高到1g/mL以上后，其療效隨劑量增加反而下降，并出現(xiàn)毒副作用 (待發(fā)表資料)。有研究推斷該現(xiàn)象可能與中藥是通過增強(qiáng)機(jī)體自身免疫系統(tǒng)而發(fā)揮作用有關(guān)，劑量過高反而抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)，但此其具體發(fā)生機(jī)制有待進(jìn)一步研究。經(jīng)透射電鏡觀察的結(jié)果也表明，荔枝核提取液對(duì)流感病毒在小鼠肺中的增殖有明顯的抑制作用，在一定劑量下，其抑制病毒作用甚至與陽(yáng)性對(duì)照相當(dāng)，為該藥發(fā)揮臨床作用提供可靠實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為中藥抗病毒作用提供了廣泛的應(yīng)用前景。

［1］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典［M］.上海:上海人民出版社，1977:1616.

［2］潘競(jìng)鏘，郭潔文，韓超，等.荔枝核的藥理實(shí)驗(yàn)研［J］.中國(guó)新藥雜志，2000，9(1):14－16.

［3］梁榮感，劉衛(wèi)兵，唐祖年，等.荔枝核黃酮類化合物體外抗呼吸道合胞病毒的作用［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，27(20):1881－1883.

［4］羅偉生，龔受基，梁榮感，等.荔枝核黃酮類化合物體外抗流感病毒作用的研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2006，31(16):1379－1380.

［5］徐慶，陳全斌，易祥輝，等.荔枝核提取物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞系HBsAg與 HBeAg表達(dá)的影響 ［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2004，24:326－329.

［6］Zheng MS，Zheng YF.Experimenta1 studies on the inhibition effects of 1000 Chinese medicimina1 herbson the surfface antige of hepatitis B virus ［J］.Traditiona1 Chin Med，1992，12(3):193.

［7］郭元吉.流行性感冒病毒及其實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京:中國(guó)三峽出版社，1997，94～96，100～106.

［8］Hori moto T，kawaoka Y.Innuenza:1essons from past pandemics，warnings from current incidents［J］.Nat，Rev Microbio1 2005，3(8):591 －600.

［9］魏金亮，徐珍，等.荔枝核黃酮體外抗單純皰疹病毒的作用［J］，武漢大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30(1):89－92.