不同釋放速度瘤胃調控劑對瘤胃亞急性酸中毒體外發(fā)酵參數(shù)的影響

董利鋒 王之盛 杜 宇

(四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，雅安 625014)

不同釋放速度瘤胃調控劑對瘤胃亞急性酸中毒體外發(fā)酵參數(shù)的影響

董利鋒 王之盛*杜 宇

(四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，雅安 625014)

本試驗通過在體外構建瘤胃亞急性酸中毒(SARA)模型，來研究不同釋放速度的瘤胃調控劑對SARA體外發(fā)酵特性及牛鏈球菌數(shù)量的影響。選取3頭育肥期并安裝永久性瘤胃瘺管的宣漢黃牛，于晨飼2 h后采集瘤胃內(nèi)容物，濾液作為體外發(fā)酵液的接種物，通過添加玉米與白酒糟(1∶1)的方式誘導體外發(fā)生SARA。借助于構建成功的SARA體外模型，設置4個試驗處理:對照組、6 h完全釋放組、8 h完全釋放組和10 h完全釋放組。在誘導SARA之后的0、2、4、6、8、10、12 h取樣測定瘤胃各發(fā)酵指標及牛鏈球菌的相對數(shù)量。結果表明，與對照顧組相比，各試驗組瘤胃液pH均極顯著升高(P＜0.01)，乙酸、丙酸、丁酸、乳酸和總揮發(fā)性脂肪酸(total volatile fatty acids，TVFA)濃度也顯著降低(P＜0.05)。結果顯示，8 h完全釋放組不僅有效提高了瘤胃液pH，緩解了SARA狀態(tài)，還對穩(wěn)定瘤胃液環(huán)境和促進微生物的生長有顯著效果。

瘤胃調控劑;釋放速度;瘤胃亞急性酸中毒;發(fā)酵參數(shù)

瘤胃亞急性酸中毒(subacute rumen acidosis，SARA)是肉?？焖儆孰A段和高產(chǎn)奶牛生產(chǎn)中普遍存在的亞健康疾病。研究表明，SARA不僅能夠降低飼糧干物質采食量及產(chǎn)奶量，嚴重時還可造成肝臟膿腫和瘤胃炎，嚴重時甚至導致死亡［1］。同時，研究還發(fā)現(xiàn)SARA使得瘤胃內(nèi)pH持續(xù)偏低(pH＜5.5)，造成瘤胃內(nèi)內(nèi)毒素含量增加且內(nèi)毒素透過瘤胃壁膜進入到血液循環(huán)系統(tǒng)，嚴重時引發(fā)蹄葉炎等一系列疾?。?－3］。目前，防治瘤胃亞急性酸中毒的傳統(tǒng)措施除了調控飼糧中精粗料的比例之外，添加堿性緩沖物質也是一種常用的治療方法。為了緩解SARA對生產(chǎn)的影響，生產(chǎn)上普遍采用直接添加小蘇打、氧化鎂等堿類物質，它們雖能夠通過緩沖瘤胃內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸及乳酸對瘤胃的影響，調節(jié)滲透壓及增加瘤胃液外流速度來防治SARA，但酸堿中和反應劇烈，容易對瘤胃壁膜及微生物菌群造成傷害［4］。20世紀80年代國外報道了制備反芻動物瘤胃緩釋制劑的研究，但其緩釋制劑多用于提高反芻動物抗胃腸道寄生蟲能力或作為營養(yǎng)補充劑。采用緩釋技術處理堿性物質來減慢其與瘤胃內(nèi)酸類物質的中和反應時間、緩解瘤胃SARA的研究尚未見報道。因此，本試驗旨在通過采用包被材料處理的堿性緩沖物質及瘤胃微生物生長所需的微量元素，減慢其在瘤胃內(nèi)釋放速度，從而降低瘤胃內(nèi)過量的酸類物質［如揮發(fā)性脂肪酸(VFA)、乳酸等］，穩(wěn)定pH，從而達到緩解SARA的目的，為緩釋瘤胃調控劑在防治SARA上的深入研究和生產(chǎn)實踐提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 瘤胃液的采集

本試驗選用3頭育肥期并安裝有永久性瘤胃瘺管的宣漢黃牛。試驗飼糧參照NRC(1981)肉牛飼養(yǎng)標準，每日于07:00和18:00分2次飼喂，自由飲水。于晨飼后2 h采瘤胃內(nèi)容物，經(jīng)4層消毒紗布過濾并混勻持續(xù)充入CO2氣體5 m in，保溫，濾液作為體外發(fā)酵液的接種物。

1.2 體外發(fā)酵液和底物的制備

厭氧人工瘤胃緩沖液按Menke等［5］的方法配制。發(fā)酵底物采用風干玉米和鮮白酒糟，分別粉碎后過40目篩，備用。

1.3 瘤胃調控劑的制備

本試驗選取碳酸氫鈉、氧化鎂等物質，與適量羥丙基甲基纖維素(HPMC)、無水乙醇等混勻制備，方法參照趙新慧等［6］。緩釋片劑體外釋放度根據(jù)中國藥典二部附錄XD釋放度測定第一法“轉籃法”測定。最終制得6、8、10 h完全釋放速度瘤胃調控劑。

1.4 試驗設計

本試驗采用單因素試驗設計，3個試驗組分別為6 h完全釋放組、8 h完全釋放組和10 h完全釋放組，對照組為不添加HPMC的完全釋放組。每組4個重復，每個重復1個發(fā)酵瓶，在成功建立體外SARA模型之后將瘤胃調控劑分別加入各組發(fā)酵瓶內(nèi)，以此點記為起始點，并在隨后的 2、4、6、8、10、12 h取樣，保存待分析。

1.5 體外發(fā)酵

本試驗采用Menke等［5］的人工產(chǎn)氣法進行體外培養(yǎng)。準確稱取底物(玉米、鮮白酒糟各4 g)于240 m L發(fā)酵瓶中混合后迅速密封，速置于39℃人工瘤胃培養(yǎng)箱中90 r/m in震蕩進行連續(xù)培養(yǎng)。通過測定瘤胃液pH及持續(xù)的時間，確定成功建立體外 SARA 模型之后分別于 0、2、4、6、8、10、12 h 取瘤胃液樣，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 測定指標與方法

pH采用PHS－3C型高精度酸度計測定，瘤胃液VFA采用胡偉蓮等［7］的氣象色譜法條件測定。乳酸測定方法參照文獻［8］。采用16S rRNA寡核苷酸探針雜交定量分析法測定牛鏈球菌的相對含量。牛鏈球菌16S rRNA序列數(shù)據(jù)來自于核糖體核酸數(shù)據(jù)庫(RDP)，通過比對排列，選擇特異性的寡核苷酸序列為探針［9］(表 1)。

表1 牛鏈球菌寡核苷酸探針序列Table 1 Sequence of S.bovis oligonucleotide probe used for hybridization analysis

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel2003整理后，采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件中One-way ANOVA過程進行方差分析，并采用Duncan氏法進行多重比較，結果以平均值±標準誤來表示。

2 結果

2.1 體外SARA模型的建立

圖1顯示了以玉米與鮮酒糟(1∶1)為發(fā)酵底物的體外發(fā)酵過程中瘤胃液pH在18 h內(nèi)的動態(tài)變化。由圖1可知，體外發(fā)酵瘤胃液中的pH隨著時間的進行不斷下降，約在7 h時達到了5.5，且持續(xù)時間超出了8 h。表明SARA模型建立成功。

圖1 瘤胃液pH隨時間變化曲線圖Fig.1 Curve of rumen fluid pH changed with time

2.2 不同釋放速度瘤胃調控劑對瘤胃液pH及VFA含量的影響

從表2中可知，在12 h內(nèi)各試驗組的瘤胃液pH都得到了提高。其中對照組為不添加緩釋材料完全釋放的瘤胃調控劑，在2 h時瘤胃液pH達到了6.64，極顯著高于其他各組(P＜0.01)。各處理提高瘤胃液pH的程度由于其釋放速度的不同，對瘤胃液pH的升高不一致。6 h完全釋放組瘤胃pH上升速度最快，在4 h時達到了6.11，極顯著高于8 h完全釋放組(P＜0.01)和10 h完全釋放組(P＜0.01)，但是極顯著低于對照組(P＜0.01)。8 h完全釋放組在10和12 h分別達到了6.26和6.27，與10 h 完全釋放組差異不顯著(P＞0.05)。

表2 不同釋放速度瘤胃調控劑對體外SARA模型瘤胃液pH的影響Table 2 The effect of different releasing rates of rumen modulators on pH in vitro induced by SARA

由表3可以看出，在SARA過程中，瘤胃液內(nèi)VFA總量及各組分含量均隨著時間的推移呈現(xiàn)出降低的趨勢，而6 h完全釋放組乙酸/丙酸比隨著發(fā)酵的進行而不斷下降。在0 h時，各組分含量之間差異不顯著(P＞0.05)，對照組自2 h起，VFA及各組分含量顯著低于各試驗組(P＜0.01)，而乙酸/丙酸自4 h起顯著高于其他各組(P＜0.01)。

2.3 不同釋放速度瘤胃調控劑對瘤胃液內(nèi)乳酸及牛鏈球菌含量的影響

由表4中可以看出，在2 h時對照組乳酸含量急劇下降，極顯著地低于各試驗組(P＜0.01)。但在6 h之后隨著瘤胃內(nèi)pH的穩(wěn)定，乳酸含量逐漸增加，在12 h時達到0.08 mmol/L。10 h完全釋放組由于調控劑釋放速度較慢，所以在前8 h內(nèi)乳酸含量逐漸降低，在12 h時降到了0.06 mmol/L。8 h完全釋放組乳酸含量先降后升，在6 h達到0.15 mmol/L之后逐漸下降，在12 h時達到最大值0.16 mmol/L，極顯著高于其他各組(P＜0.01)。

牛鏈球菌占全部細菌的相對含量與乳酸的變化相似。對照組在10 h時下降至最低值0.16%，極顯著低于其他各試驗組(P＜0.01)。8 h完全釋放組在前4 h逐漸下降，在隨后的6 h逐漸增加，在12 h時達到最大值1.06%，顯著高于其他各組(P＜0.01)。

3 討論

3.1 體外SARA模型建立的評價

瘤胃pH是判定是否發(fā)生SARA的一個重要指標，常以5.5來作為衡量 SARA發(fā)生的臨界pH［10］。目前關于判定SARA發(fā)生的臨界pH研究很多［11－12］，但一般來說當瘤胃 pH 低于 5.5 時，纖維分解菌的活性顯著降低，VFA質子化程度增加(pKa≈4.9)，更容易造成瘤胃內(nèi)一系列的劇烈波動［13］。同時，有研究認為瘤胃 pH低于5.5持續(xù)8 h以上方可判定為SARA狀態(tài)［14］。以玉米和鮮酒糟為體外發(fā)酵底物能夠顯著降低瘤胃液pH。當玉米∶鮮酒糟=50∶50時，瘤胃液pH在6 h下降至5.6，并持續(xù)到 18 h時的5.3，持續(xù)時間大于10 h以上。因此采用玉米∶鮮酒糟=50∶50為體外發(fā)酵底物能夠成功構建SARA體外模型。

3.2 不同釋放速度瘤胃調控劑對瘤胃液pH及VFA含量的影響

碳酸氫鈉和氧化鎂能夠有效緩解酸類物質形成的低pH，還可以增加反芻動物唾液的分泌。在生產(chǎn)中通常采用一次性灌注或添加大劑量的堿性物質來緩解SARA，但劇烈的中和反應不僅會對反芻動物瘤胃壁膜產(chǎn)生損害，還會嚴重破壞瘤胃內(nèi)微生物菌群生長環(huán)境。有研究發(fā)現(xiàn)，通過使反芻動物舔舐碳酸氫鈉和氧化鎂與糖蜜的混合物可以減緩堿類物質的攝入，從而避免對瘤胃的損傷［15］。但也有研究指出處于SARA狀態(tài)的反芻動物不會主動地采食碳酸氫鈉來緩沖瘤胃內(nèi)酸性環(huán)境［16］。

表3 不同釋放速度瘤胃調控劑對體外SARA模型VFA含量的影響Table 3 The effect of different releasing rates of rumen modulators on VFA content in vitro induced by SARA

表4 不同釋放速度瘤胃調控劑對體外SARA模型乳酸及牛鏈球菌相對含量的影響Table 4 The effect of different releasing rates of rumen modulators on lactate concentration and S.bovis population in vitro induced by SARA

本試驗各處理顯著提高了瘤胃液pH，實現(xiàn)了穩(wěn)定瘤胃內(nèi)環(huán)境的目的，其中以對照組pH的上升變化最為顯著。這表明對照組內(nèi)的堿性物質快速釋放，與瘤胃內(nèi)有機酸發(fā)生了劇烈的中和反應，從而使得pH下降幅度遠遠高于各試驗組。而各試驗組由于調控劑釋放速度的不同，瘤胃內(nèi)pH改變的幅度也呈現(xiàn)不同的變化。8 h完全釋放組在6 h時瘤胃pH上升到了6.06，6 h完全釋放組和10 h完全釋放組在相同時間點分別達到了6.39和5.95。而8 h完全釋放組在10 h之后pH逐漸上升，可能是調控劑在與酸類物質中和之后，瘤胃液內(nèi)有機酸濃度降低，使得瘤胃液中pH有上升的趨勢。

研究表明VFA是SARA產(chǎn)生的主要原因?？砂l(fā)酵碳水化合物在瘤胃內(nèi)迅速發(fā)酵之后產(chǎn)生的VFA超出瘤胃壁膜的吸收能力之后，在瘤胃內(nèi)積累造成瘤胃內(nèi)pH持續(xù)下降。當瘤胃pH低于5.5時，VFA質子化程度加深［15］，更容易與堿類物質發(fā)生中和反應。8 h完全釋放組在緩和瘤胃液pH方面與其他處理沒有顯著差異，但從瘤胃液內(nèi)各種VFA的含量上可以看出，8 h完全釋放組在10 h之后，乙酸、丙酸和丁酸含量呈現(xiàn)增加的趨勢，其中12 h時TVFA含量明顯高于10 h含量。6 h完全釋放組丙酸和丁酸含量在10 h時雖有增加的趨勢，但上升幅度顯著低于8 h完全釋放組。原因可能因為8 h完全釋放組的調控劑在經(jīng)過與瘤胃液中VFA中和之后，瘤胃液內(nèi)產(chǎn)VFA細菌數(shù)量也顯著高于其他各組。原因可能是8 h完全釋放組在10 h之后瘤胃內(nèi)低pH環(huán)境得到緩解，瘤胃微生物菌群尤其是纖維分解菌的生長得到恢復，從而VFA的生成量增加。與各試驗組相比，對照組過快的釋放速度使得瘤胃液內(nèi)乙酸、丙酸、丁酸和TVFA含量迅速下降并且持續(xù)保持在最低的水平。原因可能是對照組調控劑完全快速釋放，與瘤胃內(nèi)有機酸迅速結合，使得瘤胃液內(nèi)發(fā)酵環(huán)境發(fā)生了劇烈的變化，影響甚至抑制了瘤胃微生物菌群正常的生理功能。因此可以推斷8 h完全釋放組調控劑的釋放速度可能更符合瘤胃內(nèi)酸類物質的產(chǎn)生速度，保持較為穩(wěn)定的瘤胃內(nèi)環(huán)境。

有研究認為適量的丁酸對瘤胃細胞生長具有雙向調節(jié)作用。丁酸濃度的提高對瘤胃乳頭生長具有促進作用。8 h完全釋放組丁酸含量在12 h時雖然低于正常狀態(tài)下瘤胃內(nèi)丁酸含量13.46 mmol/L，但極顯著地高于其他各組(P＜0.01)。同時，調控劑內(nèi)含有的硫酸鈷、硫酸鋅、煙酸是增加瘤胃內(nèi)微生物菌群活性所必需的微量元素。在SARA狀態(tài)下瘤胃微生物菌群受到持續(xù)低pH的影響，其活性及生理功能受到抑制，嚴重阻礙瘤胃發(fā)酵的正常進行。有研究認為雖然瘤胃能合成煙酸來滿足反芻動物的營養(yǎng)需要，但高于通常營養(yǎng)水平的煙酸可刺激瘤胃微生物的恢復和生長。8 h完全釋放組在10 h之后瘤胃內(nèi)VFA的量逐漸增加，原因一方面可能是調控劑中堿性物質中和了有機酸，緩解了低pH對微生物菌群的刺激作用，另一方面也可能是鈷、鋅、煙酸等微量元素的添加促進了瘤胃內(nèi)微生物菌群的恢復和生長，從而使得發(fā)酵產(chǎn)生的VFA量增加。

3.3 不同釋放速度瘤胃調控劑對瘤胃液內(nèi)乳酸及牛鏈球菌含量的影響

乳酸是瘤胃微生物底物發(fā)酵產(chǎn)生的另一種酸性物質。它的酸性(pKa=3.9)約是VFA(pKa=4.9)的10倍，有研究認為在SARA狀態(tài)下，乳酸含量較低不是引發(fā)SARA的直接原因，但有大量研究表明乳酸會加劇SARA狀態(tài)。本試驗在0 h SARA時各組乳酸含量在0.15 mmol/L左右，與肖訓軍等［17］的研究結果相近。8 h完全釋放組在2 h時乳酸含量下降，原因是加入調控劑之后，堿類物質迅速與瘤胃液內(nèi)各種酸類物質進行緩沖，使得乳酸含量降低，在8 h時乳酸含量達到了最低值。但同時由于瘤胃內(nèi)耐酸性微生物的存在和瘤胃內(nèi)pH的逐漸穩(wěn)定，使瘤胃內(nèi)微生物繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酸，結果導致乳酸含量不斷增加。這表明，8 h完全釋放組調控劑的釋放速度一方面減緩了瘤胃內(nèi)pH，另一方面對瘤胃內(nèi)微生物菌群的生長并沒有產(chǎn)生劇烈的破壞作用，因而使瘤胃內(nèi)產(chǎn)酸微生物能夠得以繼續(xù)生長，這與表2中8 h完全釋放組TVFA含量在10 h后含量增加相一致。

牛鏈球菌是瘤胃內(nèi)重要的淀粉分解菌，大量研究證實，隨著飼糧精料水平的提高，瘤胃淀粉分解菌的比例逐漸提高。但SARA狀態(tài)下瘤胃內(nèi)持續(xù)的低pH會抑制牛鏈球菌的生長［18］。有研究表明，當精料水平為35%時，奶牛瘤胃內(nèi)淀粉分解菌占總細菌數(shù)的14%，當精料水平提高至75%時，牛鏈球菌的比例降到6%。本試驗中8 h完全釋放組在8 h之前牛鏈球菌的數(shù)量不斷下降，一方面可能是由于調控劑雖然對瘤胃內(nèi)酸類物質進行了緩沖，但并沒有完全解除較低pH對牛鏈球菌生長的抑制作用，另一方面也可能是堿性物質的釋放改變了瘤胃內(nèi)牛鏈球菌的生長環(huán)境，抑制了其生長。但在10 h后牛鏈球菌的數(shù)量逐漸增加，在12 h時顯著高于其他各組。表明當調控劑與酸性環(huán)境達到一個穩(wěn)定時期之后，瘤胃內(nèi)微生物開始繼續(xù)生長，進行正常的發(fā)酵。

4 結論

①不同釋放速度的瘤胃調控劑能夠顯著提高瘤胃液pH，降低酸類物質在瘤胃內(nèi)的積聚。

②8 h完全釋放組不僅可以對瘤胃內(nèi)酸類物質進行緩沖，還可以有效地穩(wěn)定瘤胃內(nèi)微生物菌群生長的環(huán)境，促進SARA狀態(tài)下牛鏈球菌生理功能的恢復和生長，保障瘤胃發(fā)酵功能的持續(xù)進行。由此可知，8 h完全釋放組瘤胃調控劑對緩解體外SARA效果顯著。

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*Corresponding author，professor，E-mail:wangzs007@yahoo.com.cn

(編輯 趙天章)

Effect of Different Release Rate of Rum en Modulators on Ferm entation Characteristicsin vitroInduced by SARA

DONG Lifeng WANG Zhisheng*DU Yu
(Institute of Animal Nutrition，Sichuan Agricultural University，Key Laboratory for Animal Disease-resistance Nutrition of China Ministry of Education，Ya’an625014，China)

The aim of this study was to evaluate the effect of different release rate of rumenmodulators on fermentation characteristics andS.bovisnumberin vitroby the means of induced by subacute rumen acidosis(SARA)model.ThreeXuanhansteers fitted with permanent rum inal cannulas were used and SARA was induced by adding corn and fresh distilled grain(1∶1).Then this experimentwas divided into 4 groups:6 h release group，8 h release group，10 h release group and the control group.The sampleswere taken at0，2，4，6，8，10 and 12 h after the SARA modelwas induced and the rumen fermentation parameterswere determ ined andS.bovisnumberwas quantitated using 16S rRNA oligocecleotoide probe hybridization.The results showed that pH in all trial groupswere significantly increased compared with that in the control group(P＜0.01)，and ruminal acetate，propionate，butyrate and TVFA concentrations were significantly decreased(P＜0.05)，while rum inal lactate content decreased significantly(P＜0.05).The results indicate 8 h release group can effectively reduce pH，promote the growth ofm icroorganisms and improve the rumen fermentation.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2011，23(9):1608-1614］

rumen modulator;release rate;SARA;fermentation characteristics

S816.7

A

1006-267X(2011)09-1608-07

10.3969/j.issn.1006-267x.2011.09.021

2011－03－14

資金項目:現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(肉牛)產(chǎn)業(yè)技術體系專項經(jīng)費資助(CARS－38)

董利鋒(1985—)，男，河南鞏義人，碩士研究生，從事反芻動物營養(yǎng)與飼料資源開發(fā)的研究。E-mail:dunlifeng@gmail.com

*通訊作者:王之盛，教授，博士生導師，E-mail:wangzs007@yahoo.com.cn