蔡聯(lián)燊,榮 俊 (長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北荊州434025)

雞傳染性法氏囊病 (infectious bursal disease,IBD)是一種急性、高度接觸傳染性的病毒病。它是由傳染性法氏囊病病毒 (infectious bursal disease virus,IBDV)引起的雞的免疫抑制性傳染病[1]。IBD給家禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失,尚無特效藥可以治療,目前主要應(yīng)用疫苗進(jìn)行預(yù)防。所用疫苗主要為滅活疫苗和凍干活疫苗以及新型的基因工程亞單位疫苗[2],其中傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗具有較好的免疫原性,副作用相對較低,是一種應(yīng)用前景廣闊的禽病疫苗[3]。

疫苗佐劑是動物疫苗中的重要組成部分,是一種非特異性免疫增強(qiáng)劑,可增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力或改變免疫應(yīng)答的類型。佐劑一方面能增強(qiáng)疫苗免疫效果,另一方面也會引起被免疫動物產(chǎn)生一些局部或全身副反應(yīng)。選擇合適的佐劑,對于提高疫苗免疫效果和減少不良反應(yīng)有重要的意義[4]。為了進(jìn)一步提高傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗的免疫效果和安全性,本研究以SPF雞為試驗動物,對2種不同的動物疫苗佐劑:白油佐劑和603新型納米佐劑應(yīng)用于傳染性法氏囊病亞單位疫苗中的免疫效果和安全性進(jìn)行了比較,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

白油佐劑:由94%(V/V)礦物油、6%(V/V)的Span-80,2%(m/V)硬脂酸鋁配置而成;603新型納米佐劑:由賽百瑞 (北京)生物技術(shù)有限公司提供。

VP2蛋白:以長江大學(xué)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)實驗室保存的IBD亞單位疫苗工程菌種 (專利菌種)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)而得[5],經(jīng)過純化后作為制備疫苗用抗原。IBDV瓊脂免疫擴(kuò)散試驗AGP檢測用抗原及陽性血清:購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

所用SPF雞由購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司的SPF種雞蛋,在實驗室以實驗用孵化器進(jìn)行孵化而得,孵出后放入消毒的隔離器中進(jìn)行飼養(yǎng)和試驗。

1.2 不同佐劑IBD亞單位疫苗的制備

本研究共制備4種傳染性法氏囊病亞單位疫苗:分別是VP2抗原效價為1∶32和1∶16的白油佐劑疫苗,分別編號為1號疫苗和2號疫苗,抗原效價為1∶32和1∶16的603納米佐劑疫苗,分別編號為3號疫苗和4號疫苗。并設(shè)2組不同佐劑配置的空白對照疫苗,白油佐劑對照疫苗編號為5號疫苗,納米佐劑對照疫苗編號為6號疫苗。各種疫苗成分詳見表1。

表1 不同抗原效價和佐劑傳染性法氏囊病亞單位疫苗的成分

制備白油佐劑傳染性法氏囊病亞單位疫苗時,將制備好的VP2抗原和吐溫-80,充分混勻,30℃,靜置60min。再與制備好的白油佐劑按表1比例混合,在乳化機(jī)內(nèi)進(jìn)行乳化。分裝后2～8℃保存[6]。制備納米佐劑傳染性法氏囊病亞單位疫苗時,按表1將各組分混勻,在乳化機(jī)內(nèi)進(jìn)行乳化。

1.3 佐劑的免疫效果試驗

將36只45日齡SPF雞分成6組 (A、B、C、D、E、F),每組6只。A～F各組雞分別注射1～6號疫苗,即其中A組、B組為白油佐劑組,C組、D組為納米佐劑組,E組、F組為對照組。所有雞均頸部皮下注射,劑量為0.2ml/只。在免疫接種14d、21d后分別對試驗雞進(jìn)行采血,血樣8000 r/min離心5 min分離血清,參照文獻(xiàn) [7]通過瓊脂免疫擴(kuò)散試驗檢測血清IBDV抗體。

1.4 佐劑的安全性試驗

將36只45日齡SPF雞隨機(jī)分成6組 (a、b、c、d、e、f),每組6只。a～f各組雞分別注射1～6號疫苗,即其中a組、b組為白油佐劑組,c組、d組為納米佐劑組,e組、f組為對照組。所有雞均頸部皮下注射,劑量為1ml/只。試驗雞安全性檢測通過以下2個方面進(jìn)行判斷:①觀察雞在免疫接種后的食欲、精神狀態(tài)及其恢復(fù)情況;②在免疫接種后21d,對雞進(jìn)行剖殺,觀察注射部位病理變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同佐劑IBD亞單位疫苗的免疫效果

各組試驗雞免疫接種14d、21d后血清IBDV抗體檢測結(jié)果見表2。

表2 不同免疫組雞接種 14d、21d后血清平均IBDV抗體水平

由表2可知,白油佐劑組2種不同抗原劑量刺激產(chǎn)生的抗IBDV VP2抗體水平均高于對應(yīng)的等劑量的納米佐劑組。白油佐劑的2個疫苗免疫組中,抗原量增加使抗體的水平提高明顯,如在免疫14d時,注射抗原效價為1∶32的疫苗的SPF雞,其IBDV抗體均效價為28.8,而注射抗原效價1∶16的疫苗的SPF雞,其IBDV抗體均效價為19.6。但該規(guī)律在納米佐劑疫苗中表現(xiàn)并不明顯,如在免疫14d時,注射抗原效價1∶32的納米佐劑疫苗的SPF雞,其IBDV抗體平均效價為9.6,而注射抗原效價1∶16的納米佐劑疫苗的SPF雞,其IBDV抗體均效價為10.4。試驗SPF雞注射白油佐劑疫苗后14d到21d期間,IBDV抗體水平呈明顯上升趨勢,而注射納米佐劑疫苗后14d到21d期間,抗體水平維持不變或下降。說明603號納米佐劑為水性佐劑,注射進(jìn)入動物體后迅速吸收,很快使抗體達(dá)到峰值,然后又迅速消退。

此結(jié)果表明,白油佐劑傳染性法氏囊病亞單位疫苗的免疫效果明顯優(yōu)于納米佐劑傳染性法氏囊病亞單位疫苗,并且在免疫后抗體水平穩(wěn)定性方面,也是前者明顯優(yōu)于后者。

2.2 不同佐劑IBD亞單位疫苗的安全性

不同組SPF雞注射不同佐劑疫苗后的全身反應(yīng)沒有明顯區(qū)別。24 h內(nèi)基本采食減少,行動遲緩,應(yīng)激性較差;24～48 h,采食增加,行動應(yīng)激逐漸恢復(fù);48 h后采食及精神基本恢復(fù)正常。在免疫21d,對SPF雞進(jìn)行折頸處死后剖檢,以腫塊大小或其他病變≤1cm×1cm為安檢合格,檢測結(jié)果見表3。

表3 不同免疫組雞接種21d后安檢合格率

從剖檢結(jié)果來看,2種不同佐劑的副反應(yīng)情況并不相同,白油佐劑組的a組和b組的疫苗吸收情況不理想,形成肉芽病變腫塊;而納米佐劑組的c組和d組的疫苗吸收較好,未形成肉芽病變腫塊。并且603新型納米佐劑組的病變范圍要明顯小于白油佐劑組。在白油佐劑組中,a組的安檢合格率要略低于b組;在納米佐劑組中,c組和d組的安檢合格率沒有明顯區(qū)別。此結(jié)果表明,納米佐劑傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗與白油佐劑法氏囊病基因工程亞單位疫苗比較,前者產(chǎn)生較小的副反應(yīng),安全性明顯優(yōu)于后者。

3 討論

本研究結(jié)果表明:在增強(qiáng)免疫效果方面,白油佐劑要明顯優(yōu)于納米佐劑;在安全性方面,納米佐劑要明顯優(yōu)于白油佐劑。白油佐劑為油乳佐劑,它的作用機(jī)制是抗原包被在油相形成的微結(jié)構(gòu)中,使之形成貯存庫而緩慢釋放,刺激機(jī)體免疫細(xì)胞持續(xù)性產(chǎn)生抗體[8],所以使動物獲得較高的抗體水平。但是,白油佐劑制備的疫苗在動物體內(nèi)不易擴(kuò)散吸收,所以產(chǎn)生較大的局部副反應(yīng)。603新型納米佐劑是采用納米技術(shù)加工而成的納米顆粒,其直徑通常介于50～200nm之間[9],試驗結(jié)果表明其安全性好、免疫效果差,原因可能由于其為水性佐劑,在動物體內(nèi)易于擴(kuò)散,所以在局部產(chǎn)生的副反應(yīng)較小;但是也由于其易于擴(kuò)散的特性,所以無法持續(xù)刺激動物免疫系統(tǒng)而得到較高的抗體水平。在選擇佐劑的時候,應(yīng)根據(jù)不同佐劑的特性和不同疫苗制備的需要,選擇合適的佐劑。

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