張敬慧 (宜賓職業(yè)技術學院,四川宜賓644003)

湯欽林 (荊州職業(yè)技術學院,湖北荊州434020)

葡萄酒是采用新鮮葡萄或葡萄汁經(jīng)完全或部分酒精發(fā)酵而得到的飲料。葡萄酒的釀造是通過酵母菌的作用,將葡萄原料中的各種潛在質(zhì)量在酒中充分圖現(xiàn)出來[1]。葡萄酒具有開胃健脾、防治心血管病、防癌作用、殺菌作用、葡萄酒養(yǎng)顏益壽等作用,隨著人們生活水平的提高,酒飲料的保健功能越來越受到人們的重視,中高端葡萄酒的品質(zhì)也受到眾的關注。葡萄酒的品質(zhì)除了取決于原料和釀制工藝外,釀酒酵母菌的品質(zhì)也直接影響葡萄酒的產(chǎn)量和質(zhì)量。優(yōu)良葡萄酒酵母應具有生長速率快、耐高糖、耐SO2、耐酸、發(fā)酵平穩(wěn)、酒精產(chǎn)率高、發(fā)酵完全等特性[2]。本研究根據(jù)宜賓本地特色,從土壤中選育出適合于葡萄酒生產(chǎn)的菌株,對于充分利用本土微生物資源,開發(fā)特色優(yōu)質(zhì)葡萄酒具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)菌株 供試的4株野生釀酒酵母菌菌株分別從四川宜賓2個釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)生產(chǎn)土壤中采集,并經(jīng)分離純化后得到的,分別命名為Yp-1、Yp-2、Yp-3、Yp-4。對照菌株是由當?shù)仄咸丫粕a(chǎn)企業(yè)提供的活性干酵母。

(2)培養(yǎng)基 菌體培養(yǎng)用固體培養(yǎng)基為馬鈴薯培養(yǎng)基、MEA培養(yǎng)基[5];發(fā)酵培養(yǎng)基[6]為宜賓2010年產(chǎn)赤霞珠葡萄汁,pH3.5～3.6,糖度0.41～0.43g/mL。

1.2 方法

(1)酵母菌的純化 用五點取樣法從葡萄地土壤中取樣,用四分法獲取樣品20～30g,壓碎后放入盛有40mL無菌水的250mL三角瓶[3],取上清液1mL,依次按平板稀釋法進行稀釋,從10-3mg·L-1開始馬鈴薯培養(yǎng)基平板培養(yǎng),直到出現(xiàn)單個菌落。挑取單個菌落,用MEA培養(yǎng)基進行分離。每皿加青霉素300mg·L-1,25～28℃培養(yǎng),重復純化培養(yǎng)直到獲得純菌落。

(2)酵母菌的耐性試驗 采用乙醇體積分數(shù)分別為11%、13%、15%、17%、18%,檸檬酸pH分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5,葡萄糖濃度分別為 0.37、0.40、0.43、0.47、0.50g/mL。SO2濃度分別為10、15、20、25、30mg·L-1的帶有杜氏管的液體培養(yǎng)基10mL,分別接種已活化的菌液200μ L,接種量為106個/mL,25℃溫度培養(yǎng),記錄各單因素耐性試驗條件下各酵母菌株的72h產(chǎn)CO2量與啟動發(fā)酵的時間。

2 結果與分析

2.1 乙醇體積分數(shù)對各酵母菌株發(fā)酵的影響

從圖1可以看出,隨著乙醇體積分數(shù)的升高,野生菌啟動發(fā)酵的時間推遲,其中菌株Yp-3、Yp-4在同等條件下啟動發(fā)酵最快。菌株Yp-3、Yp-4與對照菌株比較發(fā)酵啟動時間很接近,在乙醇體積分數(shù)為15%左右時,所有菌株發(fā)酵啟動時間相對最短。但當乙醇體積分數(shù)≥18%時,各菌株均不能啟動發(fā)酵。

圖1 不同體積分數(shù)乙醇下各酵母菌株啟動發(fā)酵的時間

從圖2可以看出,菌株Yp-3、Yp-4在乙醇體積分數(shù)低于15%左右的條件下產(chǎn)氣能力良好,在乙醇體積分數(shù)為17%的條件下仍可產(chǎn)少量氣體,與對照菌株活性干酵母性能接近。而菌株Yp-1、Yp-2在乙醇體積分數(shù)為15%的條件下產(chǎn)氣量下降明顯,可能是由于酵母生長受抑制,圖2表明其耐受力較差,而菌株Yp-1在乙醇體積分數(shù)為17%的條件下幾乎不產(chǎn)氣,對乙醇的耐受力最差。乙醇體積分數(shù)為17%的條件對所有酵母菌株的生長繁殖具有明顯抑制作用,在野生菌中菌株Yp-4相對耐受力最好。在乙醇體積分數(shù)為18%時所有菌均不生長,酵母耐受性降低可能是CO2毒性所致。

圖2 不同體積分數(shù)乙醇下各酵母菌株的72h產(chǎn)CO2量

2.2 SO2濃度對各酵母菌株發(fā)酵的影響

葡萄酒生產(chǎn)過程中,需加入適量的SO2,達到抑制有害微生物、抗氧化、護色等作用。優(yōu)良葡萄酒酵母需在SO2濃度為15～20mg·L-1的條件下均能較好地抑制雜菌,保證正常發(fā)酵。

圖3表明,4株野生菌在SO2濃度為10～25mg·L-1的條件下均能啟動發(fā)酵,且時間接近,為7～12h。相對而言,菌株Yp-3、Yp-4與對照活性酵母菌的啟動時間更接近。

從圖4可以看出,不同SO2濃度對酵母產(chǎn)氣效果影響不是特別大,均能產(chǎn)氣,當SO2濃度為20mg·L-1時菌株Yp-1、Yp-4產(chǎn)氣效果相對最好,證明野生酵母菌發(fā)酵產(chǎn)氣最適SO2濃度在20mg·L-1左右。

圖3 不同SO2濃度下各酵母菌株啟動發(fā)酵的時間

圖4 不同SO2濃度下各酵母菌株的72h產(chǎn)CO2量

2.3 葡萄糖濃度對各酵母菌株發(fā)酵的影響

在葡萄糖濃度為0.37～0.50g/mL條件下,各菌株都能啟動發(fā)酵;但隨著葡萄糖濃度增加,啟動速率會下降,啟動時間會延遲 (圖5)。

圖5 不同葡萄糖濃度下各酵母菌株啟動發(fā)酵的時間

當葡萄濃度高于0.50g/mL時,菌株Yp-1和Yp-4發(fā)酵產(chǎn)CO2量相似,啟動時間也較接近。證明這2種野生菌耐高糖的能力較強。

2.4 pH對各酵母菌株發(fā)酵的影響

由圖8可以看出,當pH在2.0時,菌株Yp-3、Yp-4和活性干酵母能啟動發(fā)酵外,其余野生菌均不能啟動發(fā)酵,菌株Yp-3、Yp-4較其他菌株具有更強的耐酸性。不同酸度條件下各酵母菌株的72 h產(chǎn)CO2量相差較小。總體來看,起酵時間隨pH的降低而逐漸延長。當pH3.5左右時,酵母菌發(fā)酵效果相對較好。

圖6 不同葡萄糖濃度下各酵母菌株的72h產(chǎn)CO2量

圖7 不同pH條件下各酵母菌株啟動發(fā)酵的時間

圖8 不同 pH條件下各酵母菌株的72h產(chǎn)CO2量

3 小結

本研究結果表明,4株野生菌對高乙醇、高葡萄糖濃度等條件均具有較好的耐受性,能夠啟動酒精發(fā)酵進程。但菌株Yp-1、Yp-2、Yp-3在同等酸度梯度下發(fā)酵啟動時間長且不能耐受酸,因此予以淘汰。綜合各項發(fā)酵性能,Yp-4對乙醇的耐受性優(yōu)于其他菌株,并在高酸的條件下能夠較快啟動發(fā)酵,與現(xiàn)有的活性干酵母耐受性相近,為最優(yōu)菌株,更適宜宜賓當?shù)仄咸丫频纳a(chǎn)。

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