消腫噴劑促進(jìn)急性軟組織損傷大鼠損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究

牛淑亮 劉鳳霞 王海龍 廖 靜 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(烏魯木齊 830011)

消腫噴劑為蘇梔消腫膏改良制劑,主要由蘇木、梔子、姜黃、延胡索、制乳香、制沒藥、三七、血竭、冰片等多味中藥組成,具有活血祛瘀、舒筋活絡(luò)、消腫止痛作用。臨床應(yīng)用治療跌打損傷,各種骨折后軟組織腫脹、疼痛 1583例 ,效果良好。為探討其促進(jìn)急性軟組織損傷修復(fù)的作用機(jī)理,筆者進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)觀察:

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康 SD大白鼠 48只,雌雄各半,體重200～ 220g(新疆醫(yī)科大學(xué)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥 消腫噴劑 (蘇木、梔子、姜黃、延胡索、制乳香、制沒藥、三七、血竭混勻,浸泡于 60%酒精中,每天攪拌 1次,10d后過(guò)濾 ,取濾液,再加冰片 ,溶解后分裝)。對(duì)照藥物選用正紅花油。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 軟組織打擊器(自制),Labsystems Multiskan M S352型酶標(biāo)儀,Thermo Labsystems AC8洗板機(jī),TG16W微量高速離心機(jī),GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱,ELISA Kit for Rat IL-1β(美國(guó) RD公司進(jìn)口分裝 ,生產(chǎn)批號(hào):20100615)

2 實(shí)驗(yàn)方法

造模方法參照文獻(xiàn)[1]略加改造:SD大白鼠 36只 ,實(shí)驗(yàn)前1d禁水禁食,以 8%硫化鈉溶液右后肢脫毛。實(shí)驗(yàn)前,以 3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉,注射劑量:1.5mL/kg,麻醉成功后將大鼠固定在自制打擊器上,將 200g重的砝碼通過(guò)與砝碼直徑相當(dāng)?shù)乃芰瞎苤凶?20cm高處垂直自由落體沖擊大鼠大腿外側(cè)肌肉豐厚處,連續(xù)打擊 2次 ,打擊面積約 1cm×2cm,造成打擊局部出現(xiàn)散在出血點(diǎn),皮下瘀腫創(chuàng)面及腫脹的非開放性軟組織損傷模型[2]。排除皮膚破損或骨折者,并已經(jīng)解剖及組織學(xué)驗(yàn)證成功率為 100%。

造模成功的大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為將大鼠隨機(jī)等分為 3組:模型組,正紅花油藥物對(duì)照組和消腫噴劑藥物治療組。12只未打擊大鼠為空白組。模型組、空白組不予給藥,對(duì)照組與治療組每天早晚各外拭給藥一次,連續(xù)給藥 5d。各組均給予正常飼食。造模后 1,3,5 d二次給藥前,分 3批處死大鼠,以打擊部位為中心,沿?fù)p傷處切取肌肉組織,備用。

3 觀察評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 每天二次給藥前觀察記錄 1次,并根據(jù)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn),給予評(píng)分。

3.1 病情程度評(píng)估 大鼠損傷局部損傷情況及活動(dòng)度,并給予評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[3]:觸痛:觸之疼痛反應(yīng)明顯 3分,觸之疼痛反應(yīng)輕 2分,觸之無(wú)疼痛反應(yīng) 1分;腫脹:紅腫面積 0.5cm2及以上 3分,紅腫面積 0～ 0.5 cm22分 ,無(wú)紅腫 1分。 功能障礙:明顯跛行 3分,跛行不明顯 2分,無(wú)跛行 1分。

3.2 損傷征候評(píng)分 觀察傷肢瘀斑、腫脹和肌肉顏色等征候表現(xiàn),并給予評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]:皮下瘀血:多量塊狀計(jì) 2分,少量點(diǎn)狀計(jì) 1分,無(wú)瘀血者計(jì) 0分;肌肉腫脹:明顯腫脹計(jì) 2分,稍有腫脹計(jì) 1分,無(wú)腫脹者計(jì) 0分;肌肉顏色:紫暗色深計(jì) 2分,暗紅色淺計(jì) 1分,色澤正常計(jì) 0分。

3.3 組織形態(tài)學(xué)觀察評(píng)分 將取材組織進(jìn)行石蠟切片,HE染色并在光學(xué)顯微鏡下觀察組織學(xué)形態(tài),并分級(jí)評(píng)分[1]:充血出血:血管大片充血計(jì) 3分,血管中度充血或灶性出血計(jì) 2分,個(gè)別血管輕度充血計(jì) 1分,血管無(wú)充血計(jì) 0分。炎癥:大量炎細(xì)胞彌漫浸潤(rùn)計(jì) 3分,較多炎細(xì)胞片狀浸潤(rùn)計(jì) 2分,少數(shù)炎細(xì)胞散在浸潤(rùn)計(jì) 1分,無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)計(jì) 0分。變性壞死:組織大片壞死計(jì) 3分,組織廣泛變性計(jì) 2分,局部組織變性計(jì) 1分,無(wú)變形壞死計(jì) 0分。

[(21.6-8.8)×0.65+(0.731-0.26)×317.5] ×270×12=51.15(萬(wàn)元)

3.4 白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)檢測(cè) 將取材組織用生理鹽水漂洗 1min,濾紙吸干,分析天平稱取組織 100mg,按照 5mL/100 mg加入生理鹽水,勻漿器中均勻緩慢研磨 15 min,至勻漿液呈均勻懸濁液,倒入試管中,2 500 r/min高速冷凍離心機(jī)離心 15min,收集上清液,置于-20℃冰箱中備用。用 ELISA法測(cè)定 IL-1 β的含量,具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明完成。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

5.1 病情程度評(píng)估 第 1d各造模組大鼠的病情評(píng)分比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;治療過(guò)程中各造模組的病情評(píng)分逐漸下降,治療 3d后和 5d后,同期紅花油組、消腫噴劑組的病情評(píng)分明顯低于對(duì)照組組。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,同一觀察時(shí)段,紅花油組、消腫噴劑組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組病情程度評(píng)估結(jié)果見表 1。

表1 各組大鼠治療后不同時(shí)期病情評(píng)分結(jié)果(±s)

表1 各組大鼠治療后不同時(shí)期病情評(píng)分結(jié)果(±s)

組別 第1天 第 3天 第 5天空白組 3.00± 0.00 3.00± 0.00 3.00± 0.00模型組 8.00± 0.90 6.17± 0.76 4.66± 0.59紅花油組 8.00± 0.63 4.67± 1.03 3.30± 0.56消腫噴劑組 7.83± 0.75 4.50± 1.02 .00± 0.00

5.2 損傷證候評(píng)分 損傷征候指數(shù)觀察造模后大鼠傷肢迅速出現(xiàn)腫脹、皮膚瘀斑及皮下出血現(xiàn)象,傷勢(shì)以傷后第 1天最明顯,隨后漸輕,至第 5天腫脹基本消退,局部或肢體遠(yuǎn)端殘留皮膚瘀斑。

消腫噴劑組和紅花油組與模型組比較,傷肢腫脹程度低,消退速度快,在傷后第 3天已見明顯消退,瘀斑的消散情況亦優(yōu)于模型組。損傷證候指數(shù)評(píng)分損傷后 1d,紅花油組與模型組組間無(wú)明顯差異性(P＞0.05),消腫噴劑組與模型組組間具有明顯差異性(P＜0.05),損傷后 3d,5d,消腫噴劑組和紅花油組與模型組組間均具有明顯差異性(P＜0.01)。各組大鼠治療后不同時(shí)期的損傷證候評(píng)分結(jié)果見表 2。

表2 各組大鼠治療后不同時(shí)期損傷證候評(píng)分(±s)

表2 各組大鼠治療后不同時(shí)期損傷證候評(píng)分(±s)

組別 第1d 第3d 第5d空白組 0 0 0模型組 5.67± 0.51 4.83± 0.75 3.00± 0.88紅花油組 5.00± 0.62 3.00± 0.88 1.83± 0.75消腫噴劑組 4.17± 0.75 3.00± 0.88 1.00± 0.89

5.3 組織形態(tài)學(xué)觀察評(píng)分

治療后第 3天模型組見肌肉廣泛的充血水腫,玻璃樣團(tuán)快狀,橫紋消失,肌核增生,較多中性白細(xì)胞浸潤(rùn)。紅花油組與消腫噴劑組充血、水腫減輕,少數(shù)肌纖維淡染,肌間質(zhì)及血管周圍可見少量中性細(xì)胞浸潤(rùn)。

治療后第 5 d模型組部分肌纖維紅染,少量肌纖維扭曲,排列紊亂,偶見紅細(xì)胞瘀積現(xiàn)象,白細(xì)胞呈彌漫性浸潤(rùn)。紅花油組與消腫噴劑組見少量充血水腫,白細(xì)胞浸潤(rùn)以及肌漿碎裂不明顯,肌纖維形態(tài)大致正常。

組織形態(tài)學(xué)觀察評(píng)分損傷后各觀察時(shí)段,模型組與消腫噴劑組和紅花油組組間均具有顯著差異性(P＜0.05或 P＜0.01)。各組大鼠治療后不同時(shí)期組織形態(tài)學(xué)觀察評(píng)分結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠治療后不同時(shí)期組織形態(tài)學(xué)觀察評(píng)分(±s)

表3 各組大鼠治療后不同時(shí)期組織形態(tài)學(xué)觀察評(píng)分(±s)

組別 第3天 第 5天空白組 0 0 0模型組 8.66± 0.53 7.17± 0.74 5.56± 1.03紅花油組 6.67± 0.53 4.83± 0.76 3.67± 0.81消腫噴劑組 6.67± 0.72 5.67± 0.81 3.33± 0.81

5.4 局部 IL-1β含量

經(jīng) 3d治療,空白組與各造模組比較具有顯著差異性(P＜0.05);模型組與紅花油組、消腫噴劑組比較具有顯著差異性(P＜0.05);紅花油組、消腫噴劑組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

經(jīng) 5d治療,空白組與模型組比較具有顯著差異性(P＜0.05),與紅花油組、消腫噴劑組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);紅花油組、消腫噴劑組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。治療3 d、5 d后局部 IL-1 β 含量見表 4。

表4 治療 3d、5d后局部 IL-1β含量 (±s)

表4 治療 3d、5d后局部 IL-1β含量 (±s)

組別 第3d 第5d空白組 7.03± 1.83 8.16± 1.80模型組 17.99± 3.02 13.60± 1.18紅花油組 13.08±1.84 8.49±1.77消腫噴劑組 13.24±1.26 8.52±1.91

6 結(jié) 果

軟組織損傷是由各種致傷因素作用于機(jī)體而引起軟組織損傷的一系列病理變化的疾病,主要病理表現(xiàn)為損傷局部的炎癥反應(yīng)和炎性介質(zhì)的釋放增加、酸性產(chǎn)物的積聚,使得損傷局部發(fā)生微循環(huán)障礙,毛細(xì)血管破裂、通透性增加,血管張力下降,血流減緩甚至瘀積,繼而加重炎癥反應(yīng)。因此,氣滯血瘀,筋脈阻滯是急性筋傷的病機(jī),治療應(yīng)以活血化瘀之藥,直接作用于局部,可使瘀血速去、腫脹疼痛盡快消除。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,抑制無(wú)菌性炎性滲出,改善微循環(huán),促進(jìn)水腫吸收,減輕局部損傷,有利于創(chuàng)傷組織的修復(fù)愈合[5,6]。消腫噴劑所含藥物蘇木可以減少細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 IL-2的生成[7]。梔子提取物京尼平苷具有較好的治療軟組織損傷的作用[8]。 姜黃素對(duì) IL-8、 M IP-1 α、MCP-1、 IL-1b及 TNF-α有抑制作用。乳香乙醇提取物可抑制大鼠體內(nèi)的多形核白細(xì)胞浸潤(rùn)[9]。諸藥合用有明顯活血化瘀、消腫止痛作用。

研究結(jié)果表明消腫噴劑能夠抑制損傷局部 IL-1 β表達(dá) ,且在治療 3 d,5 d后與模型組比較具有顯著差異性,經(jīng) 5 d治療后,消腫噴劑組與空白組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。消腫噴劑對(duì)損傷局部炎癥反應(yīng)具有抑制作用,從而發(fā)揮發(fā)揮對(duì)急性軟組織損傷動(dòng)物模型有治療作用。

綜合本研究,消腫噴劑可明顯改善急性軟組織損傷動(dòng)物模型癥狀、癥候,加速傷肢組織修復(fù),抑制損傷局部炎性細(xì)胞因子IL-1 β表達(dá),加速損傷組織修復(fù)。但其深入的機(jī)理尚有待進(jìn)一步探討。

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